Questo protocollo viene descritto come stabilire l'infezione virale in vivo in Drosophila melanogaster utilizzando il metodo di nano-iniezione e tecniche di base per analizzare l'interazione virus-ospite.
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Articolo metodologico
Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diffusione del virus è delle principali cause delle malattie epidemiche. Così, capire l'interazione tra il virus e l'host è molto importante per estendere la nostra conoscenza della prevenzione e trattamento dell'infezione virale. Moscerino della frutta Drosophila melanogaster ha dimostrato di essere uno degli organismi modello più efficiente e produttivo allo schermo per fattori antivirali e indagare l'interazione virus-ospite, a causa di potenti strumenti genetici e altamente conservato immune innata vie di segnalazione. La procedura descritta qui di seguito viene illustrato un metodo di nano-iniezione per stabilire l'infezione virale e inducono risposte antivirali sistemiche in mosche adulte. Il controllo preciso della dose iniezione virale in questo metodo consente un'elevata riproducibilità sperimentale. Protocolli descritti in questo studio includono la preparazione di mosche e il virus, il metodo di iniezione, analisi del tasso di sopravvivenza, la misurazione del carico di virus e una valutazione del percorso antivirale. Gli effetti di influenza dell'infezione virale di sfondo dei mosche sono stati menzionati qui. Questo metodo di infezione è facile da eseguire e quantitativamente ripetibile; può essere applicato allo schermo per host/virali fattori coinvolti nell'interazione virus-ospite e dissezionare il crosstalk tra immuni innate di segnalazione e altre vie biologiche in risposta all'infezione virale.
Introduzione
Emergenti di infezioni virali, soprattutto da arbovirus, come la Chikungunya virus1, il virus Dengue, la febbre gialla virus2 e ilvirusdi Zika3, sono state un'enorme minaccia per la salute pubblica di causare pandemie 4. così, una migliore comprensione dell'interazione virus-ospite è diventato sempre più importante per il controllo delle epidemie e trattamento di malattie virali negli esseri umani. Per questo obiettivo, è necessario stabilire modelli più appropriati ed efficaci per studiare i meccanismi alla base di infezione del virus.
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Protocollo
Nota: Prima di iniziare l'esperimento, le linee cellulari e volare scorte utilizzate non devono essere contaminate da altri patogeni, soprattutto per i virus come DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) e nefrite aviaria (ANV). Idealmente, il sequenziamento di RNA o una più semplice identificazione basati sulla PCR sono utilizzati per rilevare la contaminazione10,45. Se la contaminazione si è verificato, gli stock di volare e di linee cellulari non deve essere utilizzato di più fino a quando sono completamente decontaminati46.
1. virus e preparazione volare
- ....
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Risultati
Risultati di questa sezione sono ottenuti dopo l'infezione di DCV di d. melanogaster. La figura 1 Mostra il diagramma di flusso dell'infezione virale in drosofila. Mosche sono iniettati intra-thoracically, e quindi i campioni sono raccolti per la misurazione del virale TCID50 e livello di RNA del genoma (Figura 1). Infezione da virus può indurre la lisi cellulare e CPE è osservato a 3 giorni post infezione (Figura 2A). Il carico del virus mis.......
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Discussione
In questo articolo, presentiamo una procedura dettagliata su come stabilire un sistema virale infettivo in adulto Drosophila melanogaster usando nano-iniezione. I protocolli prevedono la preparazione di adeguate linee di volare e stock di virus, tecniche di infezione, la valutazione degli indicatori infettivi e la misura della risposta antivirale. Sebbene DCV è usato come un esempio di un agente patogeno virale, decine di diversi tipi di virus sono state applicate con successo per lo studio del sistema di Drosop.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare l'intero laboratorio di Pan in IPS. CAS. Ringraziamo il dottor Lanfeng Wang (IPS, CAS) per assistenza sperimentale e Dr. Gonalo Cordova Steger (natura Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Parigi) e Dr. Seng Zhu (IPS, Parigi) per commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da al programma di ricerca strategico prioritario dell'Accademia cinese delle scienze di l. p (XDA13010500) e h. t (XDB29030300), Fondazione della Cina nazionale di scienze naturali l. p (31870887 e 31570897) e J.Y. (31670909). L. p è membro dell'associazione per la promozione dell'innovazione di CAS della gioventù (2012083).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtro da 0,22 um | Millipore | SLGP033RS | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Marca | 352070 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml senza RNasi | Axygen | MCT-150-C | |
| Piatto per coltura cellulare da 10 cm | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Provette di ricambio | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Provetta da 15 ml | Corning | 352096 | |
| Sistema ABI 7500 qPCR | ABI | 7500 | qPCR |
| Sanyo | MIR-553 | ||
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Cloroformio | Sigma | 151858 | Estrazione dell'RNA |
| Acqua | DEPCSigma | 95284-100ML | Estrazione dell'RNA |
| Incubatore di Drosophila | Percival | I-41NL | Allevamento di Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Coltura cellulare |
| fondo piatto Piastra a 96 pozzetti | Sigma | CLS3922 | Microscopio |
| fluorescenza | Olympus | DP73 | |
| Alcool isopropilico | Sigma | I9516 | Estrazione dell'RNA |
| Tampone di lisi (estrazione dell'RNA) | Reagente Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol |
| Tampone di lisi (estrazione di RNA del campione liquido) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS |
| Reagente Microscopio | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Iniettore di auto-nanolitri | Drummond Scientific | 3-000-204 | Iniettore automatico Nanoject II a volume variabile (da 2,3 a 69 nL) con capillari in vetro (110V) |
| Pellicola adesiva ottica | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillina-Streptomicina, | Invitrogen | 15140-122 | |
| Piastra qPCR | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider' s Insect Medium | Sigma | S9895 | Software |
| statistico | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | Estrazione dell'RNA |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | Estrazione dell'RNA |
Riferimenti
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410(2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever....
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Ristampe e permessi
