Qui, presentiamo un protocollo per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza per studiare ulteriormente queste cellule mediante citometria a flusso. Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per determinare le sottopopolazioni di cellule T regolatorie mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nostro sistema immunitario è costituito da un numero e una varietà di cellule immuni compreso le cellule T regolatorie (Treg) di cellule. Le cellule Treg possono essere diviso in due sottoinsiemi, cellule Treg (tTreg) derivate timiche e marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg). Sono presenti in diversi organi del nostro corpo e possono essere distinti dagli indicatori specifici, quali Helios e Neuropiline 1. È stato segnalato che le cellule tTreg sono funzionalmente più soppressive rispetto alle cellule pTreg. Pertanto, è importante determinare la proporzione di cellule tTreg e pTreg durante l'analisi di popolazioni eterogenee delle cellule. Nel presente documento, abbiamo raccolto ghiandole del timo, linfonodi drenanti pancreatici e milze dai topi diabetici non obesi normoglicemici di distinguere le cellule di tTreg dalle cellule pTreg mediante citometria a flusso. Abbiamo preparato manualmente sospensioni di cellule singole da questi organi. Fluorocromo coniugato superficie CD4, CD8, CD25 e Neuropiline 1 anticorpi sono stati utilizzati per colorare le cellule. Erano tenute in frigorifero durante la notte. Il giorno successivo, le cellule sono state macchiate con fluorocromo coniugato anticorpi intracellulari di Foxp3 e Helios. Questi indicatori sono stati usati per caratterizzare i due sottoinsiemi di cellule Treg. Questo protocollo viene illustrato un modo semplice ma pratico per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza e utilizzarli per l'analisi citofluorimetrica.
Introduzione
Cellule regolarici di T (Treg) sono critiche per l'omeostasi del sistema immunitario. Le cellule Treg sono definite dall'espressione di antigeni di superficie CD4 e CD25 e la trascrizione fattore forkhead box P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. in primo luogo ha mostrato che CD25 è costitutivamente espresso sulle cellule del soppressore di T in topi4, che ha fornito un'osservazione pionieristica per l'identificazione di cellule Treg umane. Le cellule Treg svolgono un ruolo centrale nella tolleranza immunitaria esercitando una soppressiva capacità attrave....
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Protocollo
Il Comitato di etica animale locale all'Università di Uppsala ha approvato esperimenti sugli animali.
1. gli organi da animali di raccolta
- Sacrificare i topi da dislocazione cervicale.
- Posizionare le ghiandole del timo e milze in 20 mL scintillazione fiale o provette coniche da 15 mL riempite con 5 mL di Hanks´ soluzione salina (HBSS) equilibrata. Posto PDLNs in microprovette da 1,5 mL riempite con 1 mL di RPMI 1640. Utilizzare intero timo e milza e tutti i PDLNs.
Nota: Organi dovrebbero essere tenuti su ghiaccio durante tutta la procedura e l'investigatore dovrebbe cercare di essere veloci durante la....
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Risultati
Per studiare l'espressione di Nrp1 e Helios sulle cellule tTreg e pTreg, abbiamo preparato le celluli dalle ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD normoglicemici e li macchiato con gli indicatori delle cellule Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 per flusso cytometric analisi. I risultati sono stati analizzati come mostrato nel rappresentante gating strategie (Figura 1). Abbiamo trovato che la proporzione di cellule di Helios+ tra CD4+<.......
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Discussione
In questo studio, abbiamo isolato cellule singole ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD e studiato l'espressione di Helios e Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule mediante citometria a flusso. Nel presente studio, sono stati utilizzati topi NOD, che è un modello murino di diabete di tipo 1. In uno studio precedente, abbiamo utilizzato il CD-1 diversi ceppi di topi wild-type e topi C57BL/6 di indagare se Helios o Nrp1 è un migliore indicatore per distinguere le cellul.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio svedese della ricerca, EXODIAB, la Fondazione svedese per il diabete, fondo di diabete bambino svedese, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autori vorrebbero anche grazie Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler per loro supporti e discussioni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi | Panatura interna | ||
| HBSS | Statens veterinä | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contiene concentrato di fissazione/permeabilizzazione, diluente di fissazione/permeabilizzazione e tampone di permeabilizzazione (10x) |
| eBioscience Tampone di colorazione per citometria a flusso | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Anticorpo monoclonale (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Anticorpo monoclonale (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Ratto anti-topo CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Topo Neuropilin-1 APC-coniugato Anticorpo | R & D Systems | FAB5994A | |
| Anticorpo monoclonale FOXP3 (FJK-16s), PE-Cianina7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Anticorpo Helios umano anti-topo Pacific Blue | BioLegend | 137220 | |
| Provetta in polistirene a fondo tondo Falcon 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scatto | CORNING | 352235 | A 35 &; m la rete di nylon è incorporata nel tappo a scatto a doppia posizione |
| Provetta 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Microprovetta 1,5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Fiale a scintillazione monouso | Citometria a flusso WHEATON | ||
| Software di analisi per | |||
| Inivai Technologies | Flowlogic |
Riferimenti
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T r....
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Ristampe e permessi
