Microfluidica di interfacciamento con microelettrodi per studiare comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale

Sommario

Questo protocollo mira a dimostrare come combinare in vitro microelettrodi con dispositivi microfluidici per lo studio della trasmissione del potenziale d'azione in colture neuronali. Analisi dei dati, vale a dire l'individuazione e la caratterizzazione dei materiali di moltiplicazione di potenziali di azione, è eseguita utilizzando un nuovo avanzato, ma facile da usare e liberamente disponibile, strumento computazionale.

Abstract

Matrici di microelettrodi (MEA) sono ampiamente usate per studiare la funzione di un neurone in vitro. Questi dispositivi permettono di registrazione/stimolazione non invasiva simultanea di attività elettrofisiologica per lunghi periodi. Tuttavia, la proprietà di rilevamento di segnali provenienti da tutte le fonti intorno ogni microelettrodo può diventare sfavorevole quando si cerca di capire la comunicazione e propagazione nei circuiti neuronali del segnale. In una rete neuronale, diversi neuroni possono essere attivati simultaneamente e possono generare potenziali di azione sovrapposti, rendendo difficile per discriminare e tenere traccia di propagazione del segnale. Tenendo conto di questa limitazione, abbiamo stabilito un'installazione in vitro focalizzata sulla valutazione elettrofisiologica comunicazione, che è in grado di isolare e amplificare i segnali axonal con elevata risoluzione spaziale e temporale. Interfacciandolo dispositivi microfluidici e MEAs, siamo in grado di compartimenti stagni di colture neuronali con un allineamento ben controllato di assoni e microelettrodi. Questa configurazione permette registrazioni di propagazione di spike con un elevato rapporto segnale-rumore nel corso di diverse settimane. Combinato con algoritmi di analisi di dati specializzate, fornisce dettagliata quantificazione di comunicazione diverse proprietà come la velocità di propagazione, tasso di infornamento, insufficienza di conduzione anterograda picchi correlate e meccanismi di codifica.

Questo protocollo viene illustrato come creare un setup di compartimenti neuronali cultura su substrato-integrato MEAs, come cultura di neuroni in questa configurazione e come correttamente registrare, analizzare e interpretare i risultati di tali esperimenti. Qui, ci mostra come il programma di installazione stabilita semplifica la comprensione della comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale. Queste piattaforme spianano la strada per i nuovi modelli in vitro con topografie rete neuronale ingegnerizzati e controllabile. Sono utilizzabili nel contesto di colture neuronali omogenee, o con configurazioni di co-coltura dove, ad esempio, comunicazione tra neuroni sensoriali e altri tipi di cellule è monitorata e valutata. Questa configurazione fornisce condizioni molto interessanti da studiare, ad esempio, neurosviluppo, circuiti neuronali, informazioni coding, gli approcci di neurodegenerazione e neurorigenerazione.

Introduzione

Comprendere la comunicazione elettrica in circuiti neuronali è un passo fondamentale per rivelare la funzione normale e di elaborare strategie terapeutiche per affrontare la disfunzione. Neuroni integrano, elaborare e inoltrare i potenziali di azione (APs) che si propagano lungo i loro assoni sottili. Tradizionali tecniche elettrofisiologiche (ad es., toppa morsetto) sono potenti tecniche per studiare l'attività neuronale, ma sono spesso limitate per le più grandi strutture cellulari, come il soma o dendriti. Tecniche di imaging offrono un'alternativa per studiare axonal segnali ad alta risoluzione spaziale, ma essi sono tecnicamente difficili da eseguire e n....

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state eseguite secondo la direttiva 2010/63/UE Unione europea (UE) (recepita legislazione portoghese dal Decreto-Lei 113/2013). Il protocollo sperimentale (0421/000/000/2017) è stato approvato dal comitato etico dell'autorità ufficiale portoghese sul benessere degli animali e sperimentazione (Direção Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) e dell'host Institution.

1. preparazione di terreni di coltura e di altre soluzioni

Nota: Appena preparare le soluzioni di rivestimento il giorno del suo utilizzo. Le soluzioni di rivestimento inutilizzati e terreni ....

Risultati

Mediante il protocollo descritto qui, i neuroni corticali del ratto E-18 seminati su µEF sono in grado di sviluppare e rimanere in buona salute in queste condizioni di coltura per più di un mese. Appena 3-5 giorni nella cultura, i neuroni corticali crescono loro assoni attraverso Microscanalature verso il compartimento axonal di µEF (Figura 1). Dopo 15 giorni nella cultura, neuroni corticali coltivati su µEF sono tenuti ad esporre i livelli costanti di attivi.......

Discussione

Il protocollo presentato qui Mostra come assemblare un µEF, composto da un dispositivo microfluidico e un MEA con disegni standard disponibile in commercio e come analizzare i dati registrati.

Quando si progetta un esperimento, i ricercatori devono tener conto che il modello in vitro è limitato dalla griglia fissa MEA, che vincola il microsolco accordi. L'uso di un particolari microfluidici o MEA design dipenderà molto le esigenze sperimentali specifiche ma, in generale, la stessa pro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B-27 Suplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	LTI17504-044
Poli(etilene immina) ramificata) (PEI), 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727	Purificare il PEI ramificato mediante dialisi utilizzando una membrana cut-off da 2,5 kDa per 3 giorni a 4° C contro una soluzione di HCl da 5 mM (rinnovata quotidianamente). Liofilizzare il PEI purificato.
Filtro cellulare (40 & micro; m)	Falcon	352340
Microprovette coniche (1,5 ml)	VWR	211-0015
Pannolino usa e getta, 60x40 cm	Bastos Viegas SA	455-019
Pinza Dumont #5, dritto	Fine Science Tools	91150-20
Pinza Dumont #5/45	Fine Science Tools	11251-35
Pinza Dumont #7, curva	Fine Science Tools	91197-00
Siero fetale bovino inattivato a caldo Premium	Biowest	S181BH-500ML
Laminina di Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Preparare la soluzione madre di laminina a 1 mg/mL sciogliendo la polvere nel rispettivo volume di terreno non integrato. Conservare la soluzione di laminina a -20 gradi C in aliquote piccole (20 µ L) per evitare ripetuti cicli di gelo/disgelo.
L-Glutammina 200mM	Thermo Fisher Scientific	LTID25030-024
Neubauer camera di conteggio migliorata (emocitometro)	Marienfeld	630010
Terreno neurobasale (1X)	Thermo Fisher Scientific	21103-049	Terreno basale utilizzato per colture neuronali
Dispositivi microfluidici PDMS	non applicabile	non applicabile	Composto da due compartimenti di semina cellulare interconnessi da 20 microscanalature con 450 μ m lunghezza e tempi; 10 μ m altezza & tempi; 14 μ m di larghezza e separati da 86 µ m (interspazio totale di 100 μ m).
Soluzione di penicillina-streptomicina (P/S) (100X)	Biowest	L0022-100
Unità filtro siringa PES (Ø 30 mm), 0,22 &; m	Frilabo	1730012
Tubi conici in polipropilene, 15 ml	Thermo Fisher Scientific	07-200-886
Tubi conici in polipropilene, 50 ml	Thermo Fisher Scientific	05-539-13
Pipette sierologiche in polistirene disposabel, 10 ml	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Pipette sierologiche in polistirene disposabel, 5 ml	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Membrana in cellulosa rigenerata standard (2 kDa)	Spectrum labs	132107
Forbice chirurgica standard	Strumenti per le scienze fini	91401-14
MEA planari integrati nel substrato (256 microelettrodi)	Sistemi multicanale	256MEA100/30iR-ITO	252 elettrodi di registrazione al nitruro di titanio (TiN) e 4 elettrodi di riferimento interni organizzati in una griglia quadrata di 16 per 16. Ogni elettrodo di registrazione è da 30 & micro; m di diametro e interspaziato di 100 µm.
Siringa punta luer-lock, 10 ml	Terumo Europe	5100-X00V0
Siringa luer-lock puntale, 50 ml	Terumo Europa	8300006682
Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Detergente in polvere enzimatico utilizzato per la pulizia dei MEA
Piastre per coltura tissutale, 35 mm	StemCell Technologies	27150
90 mm	Frilabo	900095
soluzione di Trypan Blue (0,4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Tripsina (1:250)	Thermo Fisher Scientific	27250018
Nastro in vinile 471	3M	B40071909

Piastre per colture tissutali ,