Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nucleare di posizionamento all'interno delle cellule è importante per molteplici processi cellulari, nello sviluppo e rigenerazione. L'esempio più intrigante di posizionamento nucleare si verifica durante la differenziazione del muscolo scheletrico. Fibre muscolari (myofibers) sono cellule multinucleated formate dalla fusione delle cellule del precursore di muscolo (mioblasti) derivati da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione. Corretto posizionamento nucleare all'interno di miofibre è richiesto per la rigenerazione muscolare adeguata e la funzione. La procedura comune per valutare la formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti si basa su celle fisse analizzate mediante immunofluorescenza, che ostacola lo studio del comportamento delle cellule e del movimento nucleare nel corso del tempo. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi della formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti da formazione immagine di cellule vive. Mettiamo a disposizione un software per il rilevamento automatizzato ottenere una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle dinamiche nucleare e comportamento dei mioblasti (vale a dire, la traiettoria) durante la differenziazione e la fusione nucleare.
Introduzione
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo umano, per un totale di 35% - 40% della massa del corpo1. Le cellule satelliti sono cellule staminali del muscolo, anatomicamente caratterizzate dalla loro posizione (giustapposti alla membrana del plasma, sotto la lamina basale delle fibre muscolari), che danno origine ai mioblasti proliferanti (cellule progenitrici miogenico), che alla fine differenziare e integrare nelle miofibre esistenti e/o fusibile per formare nuove miofibre2,3,4. La loro scoperta e i progressi nello studio della loro biol....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di uso e San Raffaele istituzionale Animal Care.
1. dissezione dei muscoli hindlimb del mouse
- Sterilizzare in autoclave pinzette e forbici (sia dritti e curve).
- Preparare e filtro (0,22 µm) tutti i media (blocco medio, digestione medio, medio di proliferazione e differenziazione medio) prima di iniziare l'esperimento (Vedi Tabella materiali).
- Mettere 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri per la raccolta del muscolo da 35 mm.
- Sacrificare il mouse dislocazione cervicale o usando ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per seguire automaticamente movimento nucleare durante la differenziazione dei mioblasti in vivo imaging, i nuclei fluorescente preferenzialmente devono essere etichettati. È importante notare che utilizzando molecole intercalanti del DNA non è fattibile perché queste molecole interferiscono con la proliferazione e la differenziazione di mioblasti primari13. Ad esempio, proliferazione e differenziazione sono state analizzate in mioblasti primari coltivate con o sen.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Fibre muscolari (myofibers) sono multinucleate che si formano dalla fusione di cellule precursori muscolari (mioblasti) derivata da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione2,3, 4. Per valutare stimola il differenziamento, la procedura comune consiste di coltura mioblasti in differenziando le medie e fissare le cellule in diversi momenti per eseguire immunofluorescen.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da AFM-Telethon a E.V. (#21545) e con la concessione di seme di Ospedale San Raffaele (OSR) a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez dall'Hub di analisi di immagine dell'Institut Pasteur è riconosciuto per condividere pubblicamente la sua routine MATLAB "Semplice Tracker".
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| estratto di embrioni di pollo | Seralab | CE-650-J | |
| collagenasi | Sigma | C9263-1G | 125 unità/mg |
| collagene dalla pelle di vitello | Sigma | C8919 | |
| dispasi | Gibco | 17105-041 | 1,78 unità/mg |
| doxiciclina | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| siero fetale bovino | technologies | 10270106 | |
| gentamicina | Sigma | G1397 | |
| Siero di cavallo | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutammina | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillina-streptomicina | Sigma | P0781 | |
| terreno di lisi dei globuli rossi | Biolegend | 420301 | |
| Mezzo di digestione | |||
| collagenasi | 40 mg | ||
| dispasi | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtrato 0,22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Siero fetale bovino | 10% | ||
| L-glutammina | 1% | ||
| penicillina-streptomicina | 1% | ||
| gentamicina | 1 ‰ | ||
| filtrato 0,22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Siero fetale bovino | 20% | ||
| L-glutammina | 1% | ||
| penicillina-streptomicina | 1% | ||
| gentamicina | 1 ‰ | ||
| Estratto di embrione di chichen | 3% | ||
| filtrato 0,22um | |||
| mezzo di differenziazione | |||
| IMDM | |||
| Siero di cavallo | 2% | ||
| L-glutammina | 1% | ||
| penicillina-streptomicina | 1% | ||
| gentamicina | 1 ‰ | ||
| Estratto di embrione di Chichen | 1% | ||
| filtrato 0,22 um |
Riferimenti
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
