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Articolo metodologico

Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

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DOI:

10.3791/58891

⸱

7 gennaio 2019

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

In questo articolo

Sommario

Misurazione della capacità di efflusso di colesterolo in vitro di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente come biomarcatore per aterosclerosi. Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di efflusso di colesterolo-NBD fluorescente e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.

Abstract

Aterosclerosi conduce alla malattia cardiovascolare (CVD). Non è ancora chiaro se la concentrazione di colesterolo-HDL (cHDL) ha un ruolo causale nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, un fattore importante nelle prime fasi della formazione di placche di ateroma è capacità di efflusso di colesterolo di HDL (la capacità delle particelle di HDL di accettare di colesterolo dai macrofagi) al fine di evitare la formazione delle cellule della gomma piuma. Si tratta di un passaggio chiave nella evitando l'accumulo di colesterolo nell'endotelio e una parte del trasporto inverso del colesterolo (RCT) per eliminare il colesterolo attraverso il fegato. Capacità di efflusso di colesterolo di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente che può essere utilizzato come biomarcatore per aterosclerosi. Tradizionalmente, [3H]-colesterolo è stato utilizzato nelle analisi di efflusso di colesterolo. In questo studio, puntiamo a sviluppare una strategia più sicura e veloce utilizzando fluorescente etichettati-colesterolo (colesterolo-NBD) in un'analisi cellulare per rintracciare il processo di assorbimento e di efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. Infine, ottimizzare e standardizzare la metodica di efflusso di colesterolo-NBD e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.

Introduzione

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, le correnti principali cause di morte nel mondo sono la cardiopatia ischemica e ictus (contabilità per un totale di 15,2 milioni di morti)1. Entrambe sono malattie cardiovascolari (CVD) che possono essere precedute da aterosclerosi e la rottura delle placche di ateroma nei vasi sanguigni2,3.

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria parete vaso in cui i macrofagi, linfociti T, mastociti e cellule dendritiche infiltrano l'endotelio e si accumulano dal sangue, alla fine formano placche aterosclerotiche. Le placche aterosclerotiche presentano un lipide cristalli core e colesterolo, evidenziati da misure di ecografia B-mode ad alta risoluzione della carotide intima media spessore4,5. Nei macrofagi, efflusso di colesterolo verso particelle lipidiche accettore è effettuato con mezzi dei recettori ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro sottofamiglia G trifosfato di adenosina 1 (ABCG1) e il recettore scavenger SR-BI. Lo squilibrio del colesterolo afflusso e deflusso nei macrofagi è considerato un processo chiave nella aterosclerosi iniziazione6. Efflusso di colesterolo è considerata un passo fondamentale nell'eliminazione del colesterolo dal tessuto periferico al plasma e nel fegato in un processo chiamato trasporto inverso del colesterolo (RCT). Colesterolo viene trasferito dai macrofagi principalmente ad apolipoproteina A1 (ApoA1) presenti sulla superficie delle particelle della lipoproteina ad alta densità (HDL). HDL trasportano quindi il colesterolo al fegato per escrezione e reimpiego7,8,9.

Tradizionalmente, colesterolo radiomarcato trizio (3H) è stato utilizzato in efflusso di colesterolo10. Il segnale di emissione dei radioisotopi è altamente sensibile10; Tuttavia, il colesterolo radiomarcato presenta evidenti svantaggi quali protocolli lunghi, rischio di esposizione a radiazioni ionizzanti e la necessità speciali radioattività strutture e attrezzature garantire l'uso sicuro dell'emissione radioattiva. Al contrario, fluorescenza è stato integrato con successo nelle tecniche diagnostiche grazie alla sua semplicità nella rilevazione del segnale fluorescente, l'ampia varietà di fluorofori disponibili e relativi di sicurezza11. Diversi steroli fluorescenti-etichettati sono stati usati per studiare il metabolismo del colesterolo compreso dehydroergosterol (con fluorescenza intrinseca), colesterolo di dansile, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterolo e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-OL (NBD-colesterolo). In particolare, NBD-colesterolo presenta un assorbimento efficiente in cellule umane12. Due differenti NBD etichettati-colesterolo sono attualmente disponibili: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterolo etichettato con parte 22-NBD soddisfino al meglio gli studi di efflusso di colesterolo, mentre 25-NBD-colesterolo pricipalmente è utilizzato nella membrana cellulare dinamica ricerca13,14.

Le linee cellulari in genere utilizzate nelle analisi di efflusso di colesterolo in vitro sono cellule monocito-come ad esempio cellule THP-1 leucemia-derivate essere umano, murino 264,7 cellule15o J774.1. Tutte queste cellule possono essere differenziate in macrofagi in vitro facendo uso di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), ma THP-1-macrofagi derivati (dmTHP-1) migliori riflettono e imitano i macrofagi umani16.

Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di alto-rendimento fluorescente per determinare la capacità di efflusso di colesterolo di campioni di siero su dmTHP-1, utilizzando 22-NBD-colesterolo come alternativa a [3H]-colesterolo. Inoltre, mettiamo a confronto la tecnica fluorescente ottimizzata con l'analogico standard radioattivo.

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Protocollo

Per questo studio, approvazione del comitato etico (Comitato Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcellona; numero di omologazione di HCB/2014/0756) e consenso informato scritto da tutti i soggetti sono stati ottenuti.

1. preparazione NBD-colesterolo

  1. Sciogliere il NBD-colesterolo (MW 494.63; Vedi Tabella materiali) in etanolo puro per ottenere il brodo (2 mM). Per un flaconcino da 10 mg, sciogliere il contenuto di intero flaconcino in un volume di 10,1 mL di etanolo per ottenere uno stock di 2 mM.
  2. Diluire il NBD-colesterolo da stock in RPMI 1640 completati con 10% fetale bovino del siero e 5% penicillina/streptomicina (R10 medium) per raggiungere una concentrazione finale di 5 μM (ad es., ottenere 10 mL di NBD-colesterolo alla concentrazione finale di 5 μM) di diluire 25 μL di brodo NBD-colesterolo (2 mM) nel mezzo di R10. Questo volume è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.

2. cellula di coltura e semina (2 ° giorno)

  1. Cellule THP-1 e di cultura in mezzo R10 a 37 ° C, 5% CO2. Regolare a 0,3 x 106 cellule/mL ogni 3 giorni.
  2. Seme le cellule in una piastra a 96 pozzetti bianca con un fondo piatto e chiaro a 0,2 x 106 cellule/pozzetto in mezzo R10 (100 μL per pozzetto).
  3. Trattare le cellule con 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA; da uno stock di 10 μM) per 48-72 h, incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per differenziare THP-1 cellule in dmTHP-1.
    Nota: Si consiglia di utilizzare 5 μL di stock PMA (10 μM) in 500 μL di R10 medium. Prima di questo, preparare un 10 μM PMA brodo sciogliendo un flaconcino di liofilizzato 1 g in 10 mL di solfossido dimetilico (DMSO), aliquota e magazzino a-20 ° C.
  4. In alternativa (suggerimento) combinano passi 2.2 e 2.3 per migliore omogeneizzazione. Preparare 10 mL di cellule THP-1 in una provetta da 15 mL, aggiungere 200 µ l di brodo PMA (10 μM), mescolare delicatamente e immediatamente seme 100 μL per pozzetto sulla piastra. Incubare le cellule come descritto al punto 2.3.

3. apolipoproteina B impoverito preparazione del siero (anime) (giorno 2 o 3)

  1. Per preparare una soluzione di glicole polietilenico (PEG), diluire glicina in PBS 10% (con sterile H2O) a una concentrazione di 200 mM a pH 7,4. Aggiungere 40 mL di glicina di 200 mM a 10 g di PEG 8000 per ottenere PEG 20% (p/v). Miscelare la soluzione vigorosamente per omogeneizzare.
  2. Applicare 4 parti del 20% PEG per 10 parti di siero/plasma su ogni campione di siero/plasma in una provetta da 1,5 mL e lasciare la miscela sul ghiaccio per 25 min17 (ad esempio, per aggiungere 100 μL del plasma o siero, 40 μL di 20% PEG soluzione).
  3. Centrifugare il precipitato di PEG-apolipoproteina B a 13.000 x g per 15 min a 4 ° C.
  4. Eliminare il precipitato. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
    Nota: È consigliabile preparare le anime il giorno 3 (fresco). Se non è possibile, preparare le anime il giorno 2 e mantenerlo durante la notte a 4 ° C.

4. NBD-colesterolo cellulare carico (giorno 2)

  1. Scartare il terreno di coltura del dmTHP-1 e lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
  2. Caricare le celle con 5 μM NBD-colesterolo (100 μL per pozzetto) nel mezzo di R10 e incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.

5. incubazione con accettori di colesterolo (giorno 3)

  1. Eliminare il terreno e lavare le cellule due volte con PBS.
  2. Incubare le cellule con 2 – 5% anime o la concentrazione desiderata di accettore di lipide purificato (HDL, ApoA, ApoE, ecc.) diluiti in incolore medium RPMI 1640 (100 μL per pozzetto) per 4-6 h a 37 ° C.
    Nota: Includere un controllo negativo (C-) costituito da incolore RPMI 1640 medium senza accettori e un controllo positivo (C +) (ad es., anime da un pool di donatori sani) o HDLs purificata. Nota che il controllo positivo si applica specialmente quando i campioni dei pazienti (condizioni di malattia) sono analizzati (complementare figura 1).
  3. Preparare un brodo di 200 mL della soluzione di lisi cellulare 1 (tampone Tris 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). Mescolare il rapporto di soluzione 1 a 1:1 (v: v) di lisi delle cellule con etanolo puro per ottenere la soluzione di lisi 2.

6. acquisizione segnale fluorescente (giorno 3)

  1. Rilevamento dei supporti NBD-colesterolo
    1. Rimuovere il mezzo di cella delle placche e raccoglierlo in una piastra a 96 pozzetti bianca nuova con un fondo piatto opaco.
    2. Per un rilevamento del segnale di fluorescenza ottimale nei campioni media, aggiungere 100 μL di etanolo puro al 100 μL di ciascun campione medio per ottenere un rapporto di 1:1 della piastra 96 pozzetti bianco.
    3. Tenere la piastra con i media trattati per ulteriore misura l'intensità della fluorescenza (FI) alla lunghezza d'onda di nanometro (eccitazione/emissione) 463⁄536 il luminometro.
  2. Rilevamento di NBD-colesterolo intracellulare
    1. Lavare le cellule due volte con PBS.
    2. Per ottenere il colesterolo intracellulare, lisare le cellule di incubarle con 100 μL di soluzione di lisi 2 per pozzetto e scuotere la piastra a temperatura ambiente (TA) per 25 min.
    3. Per catturare un rilevamento del segnale di fluorescenza ottimale nei campioni lysate delle cellule, l'intensità della fluorescenza dei lisati cellulari nello stesso bianco piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente piatto (nello stesso piatto in cui le cellule sono state seminate nel passaggio 2.2).
  3. 6.3 misura l'intensità di fluorescenza (FI) sul luminometro regolando il parametro di sensibilità a 50 nel software (Vedi Tabella materiali).

7. Risultati analisi

  1. Esprime la quantità di efflusso di colesterolo di un campione come percentuale calcolata con la formula:
    figure-protocol-1
  2. Ottenere la misura finale di efflusso di colesterolo (CE) sottraendo il CE del controllo negativo (campione caricato con NBD-colesterolo ma incubate con medium RPMI 1640 incolore, senza accettori di colesterolo) dalla CE di un dato esempi:
    figure-protocol-2

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Risultati

Il dosaggio di efflusso di colesterolo mira a determinare in vitro la capacità di efflusso di colesterolo di un dato del siero, il plasma o il supernatante contenente particelle di HDL. Il metodo consiste di caricamento etichettati-colesterolo in una cultura di una linea cellulare del macrofago standard e inducendo il contatto con il campione di prova diluito in media FBS-liberi con le cellule. Infine, i livelli fluorescenti dal NBD sono misurati nei media e lysate delle cellule. Per ottimizzare le misure, il effluxed di...

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Discussione

Fluorescenti-etichettati colesterolo è una strategia promettente per analizzare e studiare le proprietà e il metabolismo del colesterolo naturale in vitro. I suoi principali vantaggi sono che può essere preso dalle cellule, permette per intracellulare e gli studi di distribuzione di membrana e può essere applicato a dosaggi efflusso di colesterolo come in questo protocollo (Figura 7). Alcuni steroli fluorescenti-etichettati consentono colesterolo monitoraggio in vitro BODIPY-colesterolo, col...

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Dichiarazioni

Gli autori desiderano dichiarare che essi sono gli inventori della domanda di brevetto (EPO; 18382337.6-1118; 17 maggio 2018) dal titolo "Metodo per la determinazione di efflusso di colesterolo" basato su questo metodo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di studio la ricerca FIS (PS12/00866) dall'Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; El di para di Fondo Europeo sviluppo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) e CERCA programma / Generalitat de Catalunya. Gli autori ringraziano la Retrovirology e virale Immunopathology laboratorio di progetto l'Institut Investigacions agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Ringraziamo Escribà T., c. Rovira e C. Hurtado per la loro assistenza e S. Cufí dalla conoscenza e dall'ufficio di trasferimento tecnologico per la sua guida nel proteggere l'invenzione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di raccolta a 96 pozzettiCorning Inc Costar3912bianca Piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente opaco
Piastra a 96 pozzettiCorning IncCostar 3610bianca Piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e trasparente
Kit per il dosaggio dell'efflusso del colesterolo (basato su cellule)Abcamab196985Commercial Kit di analisi cellulare ad alto rendimento ad alto rendimento volto a determinare il efflusso di colesterolo
incolore RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 senza pehnol-red
Gen5 Software di analisi dei datiBioTekVersione 2.0
GlicinaSigma-AldrichG8790-100GGlicina, uso non animale
LuminometroBiotekSYNERGY HTMulti-Detection Microplate
Reader Lisi Soluzione 150 mM di tampone Tris, 150 mM di NaCl e H2O
Soluzione di lisiin-houseSoluzione di etanolo puro e lisi cellulare 1:1 (v:v)
NBD-colesteroloThermo-FisherN114822-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Ammino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBSSigma-AldrichP3813Fosfato-tamponato  soluzione salina
PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250Gpolietilenglicole
PMASigma-Aldrich79346Phorbol 12-merystate B-acetato.
R10RPMI1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e il 5% di penicillina/streptomicina.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 con 2 mM di L-glutammina contenente 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 4,5 g/L
di glucosio di cellule THP-1Sigma-AldrichATCC, #TIB-202linea simile a monociti derivata dalla leucemia di un bambino di un anno
di età Tween 80Sigma-AldrichP1754
2

Riferimenti

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