Misurazione della capacità di efflusso di colesterolo in vitro di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente come biomarcatore per aterosclerosi. Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di efflusso di colesterolo-NBD fluorescente e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.
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Articolo metodologico
Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Aterosclerosi conduce alla malattia cardiovascolare (CVD). Non è ancora chiaro se la concentrazione di colesterolo-HDL (cHDL) ha un ruolo causale nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, un fattore importante nelle prime fasi della formazione di placche di ateroma è capacità di efflusso di colesterolo di HDL (la capacità delle particelle di HDL di accettare di colesterolo dai macrofagi) al fine di evitare la formazione delle cellule della gomma piuma. Si tratta di un passaggio chiave nella evitando l'accumulo di colesterolo nell'endotelio e una parte del trasporto inverso del colesterolo (RCT) per eliminare il colesterolo attraverso il fegato. Capacità di efflusso di colesterolo di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente che può essere utilizzato come biomarcatore per aterosclerosi. Tradizionalmente, [3H]-colesterolo è stato utilizzato nelle analisi di efflusso di colesterolo. In questo studio, puntiamo a sviluppare una strategia più sicura e veloce utilizzando fluorescente etichettati-colesterolo (colesterolo-NBD) in un'analisi cellulare per rintracciare il processo di assorbimento e di efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. Infine, ottimizzare e standardizzare la metodica di efflusso di colesterolo-NBD e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.
Introduzione
Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, le correnti principali cause di morte nel mondo sono la cardiopatia ischemica e ictus (contabilità per un totale di 15,2 milioni di morti)1. Entrambe sono malattie cardiovascolari (CVD) che possono essere precedute da aterosclerosi e la rottura delle placche di ateroma nei vasi sanguigni2,3.
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria parete vaso in cui i macrofagi, linfociti T, mastociti e cellule dendritiche infiltrano l'endotelio e si accumulano dal sangue, alla fine formano placche aterosclerotiche. Le plac....
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Protocollo
Per questo studio, approvazione del comitato etico (Comitato Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcellona; numero di omologazione di HCB/2014/0756) e consenso informato scritto da tutti i soggetti sono stati ottenuti.
1. preparazione NBD-colesterolo
- Sciogliere il NBD-colesterolo (MW 494.63; Vedi Tabella materiali) in etanolo puro per ottenere il brodo (2 mM). Per un flaconcino da 10 mg, sciogliere il contenuto di intero flaconcino in un volume di 10,1 mL di etanolo per ottenere uno stock di 2 mM.
- Diluire il NBD-colesterolo da stock in RPMI 1640 completati con 10% fetale bovino del siero e 5% ....
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Risultati
Il dosaggio di efflusso di colesterolo mira a determinare in vitro la capacità di efflusso di colesterolo di un dato del siero, il plasma o il supernatante contenente particelle di HDL. Il metodo consiste di caricamento etichettati-colesterolo in una cultura di una linea cellulare del macrofago standard e inducendo il contatto con il campione di prova diluito in media FBS-liberi con le cellule. Infine, i livelli fluorescenti dal NBD sono misurati nei media e lysate delle cellule. Per ottimizzare le misure, il effluxed di.......
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Discussione
Fluorescenti-etichettati colesterolo è una strategia promettente per analizzare e studiare le proprietà e il metabolismo del colesterolo naturale in vitro. I suoi principali vantaggi sono che può essere preso dalle cellule, permette per intracellulare e gli studi di distribuzione di membrana e può essere applicato a dosaggi efflusso di colesterolo come in questo protocollo (Figura 7). Alcuni steroli fluorescenti-etichettati consentono colesterolo monitoraggio in vitro BODIPY-colesterolo, col.......
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Dichiarazioni
Gli autori desiderano dichiarare che essi sono gli inventori della domanda di brevetto (EPO; 18382337.6-1118; 17 maggio 2018) dal titolo "Metodo per la determinazione di efflusso di colesterolo" basato su questo metodo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di studio la ricerca FIS (PS12/00866) dall'Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; El di para di Fondo Europeo sviluppo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) e CERCA programma / Generalitat de Catalunya. Gli autori ringraziano la Retrovirology e virale Immunopathology laboratorio di progetto l'Institut Investigacions agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Ringraziamo Escribà T., c. Rovira e C. Hurtado per la loro assistenza e S. Cufí dalla conoscenza e dall'ufficio di trasferimento tecnologico per la sua guida nel proteggere l'invenzione.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di raccolta a 96 pozzetti | Corning Inc Costar | 3912 | bianca Piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente opaco |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning Inc | Costar 3610 | bianca Piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e trasparente |
| Kit per il dosaggio dell'efflusso del colesterolo (basato su cellule) | Abcam | ab196985 | Commercial Kit di analisi cellulare ad alto rendimento ad alto rendimento volto a determinare il efflusso di colesterolo |
| incolore RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 senza pehnol-red |
| Gen5 Software di analisi dei dati | BioTek | Versione 2.0 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glicina, uso non animale |
| Luminometro | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate |
| Reader Lisi Soluzione 1 | 50 mM di tampone Tris, 150 mM di NaCl e H2O | ||
| Soluzione di lisi | in-house | Soluzione di etanolo puro e lisi cellulare 1:1 (v:v) | |
| NBD-colesterolo | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Ammino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Fosfato-tamponato soluzione salina |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polietilenglicole |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetato. |
| R10 | RPMI | 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e il 5% di penicillina/streptomicina. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 con 2 mM di L-glutammina contenente 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 4,5 g/L |
| di glucosio di cellule THP-1 | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | linea simile a monociti derivata dalla leucemia di un bambino di un anno |
| di età Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Riferimenti
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K.
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Ristampe e permessi
