Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Sommario

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Abstract

Gli osteoclasti sono cellule grandi, multinucleate e di riassorbimento osseo del lignaggio dei monociti-macrofage che sono formate dalla fusione di monociti o precursori di macrofage. Un eccessivo riassorbimento osseo è uno dei meccanismi cellulari più significativi che portano a malattie osteolitiche, tra cui l'osteoporosi, la parodontite e l'osteolisi periprotesica. La principale funzione fisiologica degli osteoclasti è quella di assorbire sia la componente minerale di idrossiapatite che la matrice organica dell'osso, generando l'aspetto caratteristico del riassorbimento sulla superficie delle ossa. Ci sono relativamente pochi osteoclasti rispetto ad altre cellule del corpo, soprattutto nelle ossa adulte. Studi recenti si sono concentrati su come ottenere osteoclasti più maturi in meno tempo, che è sempre stato un problema. Diversi miglioramenti nelle tecniche di isolamento e cultura si sono sviluppati nei laboratori al fine di ottenere osteoclasti più maturi. Qui, introduciamo un metodo che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale, utilizzando un dispositivo speciale e semplice. Con l'uso di centrifugazione a gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati dal midollo osseo del ratto, che sono identificati con metodi classici.

Introduzione

L'omeostasi ossea è un processo fisiologico complesso che è regolato da osteoclasti di riassorbimento osseo e osteoblast che formano ossa¹. Un equilibrio tra attività osteoblastica e osteoclastica mediata attraverso osteoblasti e osteoclasti, rispettivamente, è altamente essenziale per mantenere la salute ossea e l'omeostasi, perché le perturbazioni nell'omeostasi ossea possono portare a malattie ossee, come come crescita ossea anormale o perdita di densità ossea. Come cellule di riassorbimento osseo uniche, gli osteoclasti sono importanti nelle malattie legate alla distruzione ossea anormale, tra cui l'osteoporosi, la parodontite e l'osteolisi periprotesica^2,3.

Lo sviluppo di una cultura osteocultima è diviso principalmente in due fasi. I metodi stabiliti da Boyde et al.⁴ e Chambers et al.⁵ hanno composto la prima tappa negli anni ottanta. Hanno ottenuto osteoclasti relativamente abbondanti dalle ossa degli animali appena nati, che è il periodo di rimodellamento rapido. Gli osteoclasti vengono rilasciati frammentare e mescolare le ossa in un mezzo speciale. Tuttavia, le cellule ottenute con questo metodo sono a basso contenuto di quantità e purezza. Il secondo stadio è stato lo sviluppo di colture a lungo raggio di formazione di degli osteoclasti, utilizzando cellule di lignaggio ematopoietiche derivate dal midollo osseo⁶. Le citochines, come 1 α, 25-diidrossiamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), e l'ormone paratiroideo (PTH), che vengono aggiunti nel mezzo di coltura, agiscono attraverso il sistema di osteoblasti/cellule stromali per stimolare la formazione di degli osteoclasti^7,8 . Tuttavia, la purezza e la quantità degli osteoclasti ottenuti con questo metodo non possono soddisfare le esigenze della moderna ricerca sulla biologia molecolare. Quindi, la scoperta del fattore stimolante le colonie di macrofage (m-CSF) e dell'attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-κB (RANKL) rende l'osteoclastogenesi più facile^9,10,11e il metodo di utilizzo di m-CSF e RANKL per stimolare direttamente la formazione di degli osteoclasti è ampiamente usato in tutto il mondo. Tuttavia, ci sono ancora alcuni dettagli nella metodologia che devono essere migliorate.

Attualmente, il metodo di coltura degli osteoclasti più comunemente usato, come descritto da Marino et al.¹² e Pei et al.¹³, spesso richiede la rimozione del tessuto circostante intorno all'osso e utilizza un ago sterilizzato per lavare la cavità del midollo con supporti completati. Ci sono alcuni inconvenienti a questo processo, compreso il fatto che (1) la rimozione del tessuto circostante intorno all'osso richiede molto tempo e grande tecnica chirurgica, (2) le ossa sono fragili e possono portare a deflusso del midollo osseo, (3) la cavità del midollo osseo potrebbe essere troppo piccolo per lavare, e (4) c'è il rischio di lesioni dell'ago. Per evitare questi problemi, centrifugheremo i tubi contenenti le ossa per il midollo osseo invece di lavare l'ago al midollo osseo. Qui, introduciamo un metodo stabile e sicuro che isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzo rispetto alla procedura tradizionale. Insieme all'uso della centrifugazione con gradiente di densità, otteniamo grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono gli animali qui descritti sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di medicina cinese di Nanchino.

1. impostazione del Setup

1. Preparare diversi puntali per pipette da 1 mL longitudinalmente tagliati (1 cm) e diversi provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Mettere i puntali per pipette e le provette per microcentrifuga a 103 kPa e 121 ° c per 20 minuti e assicurarsi che siano sterili.
2. Preparare una scatola di ghiaccio e diversi piatti sterili per preservare i tessuti isolati durante la procedura di isolamento.

2. preparazione del mezzo di coltura

1. Prepara il mezzo di coltura completo. Utilizzare l'alfa medio essenziale minimo (α-MEM) che contiene una soluzione finale dell'1% di penicillina/streptomicina e 10% di siero bovino fetale (FBS).
2. Filtrare il supporto dal passaggio 2,1 utilizzando un filtro da 0,22 μm.
3. Preparare il mezzo di induzione del midollo osseo. Per 50 mL di soluzione, aggiungere 125 μL di M-CSF a una concentrazione di 10.000 ng/mL (tabella dei materiali) a 49,875 ml di mezzo di coltura completo (dal passo 2,2) per effettuare una soluzione finale di 25 ng/ml di m-CSF.
4. Preparare il mezzo di induzione degli osteoclasti. Per 50 mL di soluzione, aggiungere 500 μL di RANKL a una concentrazione di 10.000 ng/mL (tabella dei materiali) a 49,5 ml di mezzo di induzione del midollo osseo (dal passo 2,3) per effettuare una soluzione finale di 25 ng/ml di M-CSF e 100 ng/ml RANKL.

3. isolamento delle cellule derivate dal midollo osseo

1. eutanasia
   1. Euthanize quattro ratti di Sprague Dawley di CO₂ inalazione seguita da lussazione cervicale, e immergerli in 75% etanolo per 1 min.
      Nota: Assicurarsi che gli animali siano dello stesso sesso e di un'età simile. Si raccomandano animali di età da 2 a 3 settimane. Due ratti sono preparati per il metodo centrifugo, mentre gli altri due sono per il metodo tradizionale.
2. Metodo tradizionale
   1. Collocare gli animali su una scheda disinfettante in posizione supina. Fare una piccola incisione (circa 1 cm) al femore prossimale per sbucciare la pelle, utilizzando forbici sterili.
   2. Dissezionare i femori e le tibias. Tagliare le parti di collegamento bilaterali intorno alle articolazioni dell'anca, del ginocchio e della caviglia per isolare le tibia e i femori con attenzione e delicatezza. Tagliare parte dei tessuti intorno all'osso; essere approfondita. Non fratturare la tibia e femori durante l'intero processo.
   3. Mettere le ossa pulite in un piatto con 5 mL del mezzo di coltura completo. Tagliare l'osso lungo con le forbici sterili e utilizzare un ago siringa da 1 mL per lavare accuratamente la cavità del midollo con 10 mL di supporto completo fino a quando la cavità del midollo diventa bianca.
   4. Trasferire la sospensione cellulare dal punto 3.2.3 a un tubo da 50 mL, quindi filtrarla con un filtro da 70 μm per rimuovere il tessuto rimanente.
   5. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (tabella dei materiali) alla sospensione cellulare. Incubare le cellule per 8 min sul ghiaccio. Quindi, centrifugare le cellule a 250 x g per 5 min per produrre il pellet cellulare.
   6. Aspirare il fluido e risospendere le cellule in 10 mL di supporto completo. Contare le cellule utilizzando un emocytometro e calcolare il tempo speso sui passi da questa sezione (sezione 3,2).
3. Metodo migliorato
   1. Collocare gli animali su una scheda disinfettante in posizione supina. Fare una piccola incisione (circa 1 cm) al femore prossimale con forbici sterili per sbucciare la pelle.
   2. Dissezionare i femori e le tibias. Tagliare correttamente la parte dei tessuti intorno all'osso (non è necessario rimuovere completamente). Non fratturare la tibia e femori durante l'intero processo.
   3. Sciacquare le tibia e i femori con 12 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tagliarli a metà. Posizionare le tibia e le femore da cattura in una punta di pipetta da 1 ml (dal passo 1,1), che viene poi messa in una provetta per microcentrifuga e viene centrifugata 3x a 1.000 x g per 45 s a 4 ° c.
   4. Dopo la centrifugazione, rimuovere la punta della pipetta contenente l'osso e lasciare il midollo osseo nel tubo. Aggiungere 200 μL di supporto completo nel tubo della microcentrifuga e ripetere il pipettaggio per disintegrare accuratamente il midollo.
   5. Trasferire la sospensione cellulare dal passaggio 3.3.4 a un tubo da 50 mL, quindi filtrarla con un filtro da 70 μm per rimuovere il tessuto rimanente.
   6. Contare le cellule utilizzando un emocytometro e calcolare il tempo speso sui passi da questa sezione (sezione 3,3).

4. purificazione per centrifugazione con gradiente di densità

1. Regolare la sospensione cellulare dal punto 3.2.6 o dal passaggio 3.3.5 a 2 mL con α-MEM.
2. Preparare un tubo centrifugo silicificato sterile e aggiungere 8 mL della soluzione di separazione cellulare (tabella dei materiali) al tubo.
3. Aggiungere la sospensione cellulare dal passaggio 4,1 alla soluzione di separazione delle cellule. Aderire la punta della pipetta alla superficie interna del tubo e mantenere un 45 ° alla superficie interna. Dopo aver aggiunto la sospensione, apparirà un limite chiaro tra lo strato delle cellule e la soluzione di separazione.
   Nota: L'operazione richiede molta cura e deve essere eseguita lentamente.
4. Centrifugare la soluzione stratificata in una centrifuga orizzontale a 500 x g per 30 min. Dopo la centrifugazione, aspirare il secondo strato nuvoloso, che contiene le cellule bersaglio, dall'alto verso il basso.
   Nota: Annullare l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga prima della centrifugazione. Ci sono sei strati dopo la centrifugazione; il primo strato è lo strato di diluente, il secondo strato è lo strato monociti, il terzo strato è lo strato di cellule mononucleate, il quarto strato è il liquido di separazione trasparente uno strato, il quinto è lo strato di cellule granulari, e il sesto strato è la cella rossa strato.
5. Trasferire le celle di destinazione in un nuovo tubo. Aggiungere 5 mL di PBS per lavare le cellule 3x. Dopo ogni lavaggio, centrifugare le cellule bersaglio a 250 x g per 5 min per produrre il pellet cellulare.
6. Risospendere il pellet cellulare con il mezzo di induzione del midollo osseo e contare le cellule utilizzando un emocytometro. Aggiungere 5 – 8 mL di mezzo di induzione del midollo osseo dal passo 2,3 per ottenere una soluzione di cellule finali di 300.000 cellule/mL. Aggiungere 1 mL per ogni pozzetto di una piastra 24-well.

5. cultura e differenziazione

1. Dopo aver incubato le cellule a 37 ° c per 24 ore, aspirare delicatamente il fluido e aggiungere 1 mL del mezzo di induzione dell'degli osteoclasti ad ogni pozzetto. Agitare delicatamente la piastra e metterla in incubatore a 37 ° c.
2. Cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti ogni 48 h. Mentre si fa così, cambiare 0,8 mL di mezzo nel pozzo e agitare delicatamente la piastra.
   Nota: Gli osteoclasti grandi, motili e multinucleati devono essere osservati nel pozzo sotto un microscopio invertito, tipicamente intorno ai giorni 4 – 6.

6. colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato

Nota: Gli osteoclasti multinucleati saranno presenti dopo 4 – 6 giorni se l'induzione (sezione 5) ha esito positivo.

1. Preparare la soluzione fissativa combinando 4 mL di 37% di formaldeide, 32,5 mL di acetone e 12,5 mL di una soluzione di citrato. Conservare la soluzione fissativa a 4 ° c.
2. Preparare la soluzione di colorazione della fosfatasi acida (TRAP) resistente ai tartrati (tabella dei materiali) aggiungendo 50 μl di nitrito di sodio, 50 μl di soluzione di base di Fast Garnet gbc, 50 μl di soluzione di naftolo As-bi fosfato, 200 μl di soluzione di acetato e 100 μl di soluzione di tartrato in 4,55 mL di acqua deionizzata che viene preriscaldato a 37 ° c. Poi, mescolare delicatamente per inversione per 1 min, e lasciarlo riposare per 2 min.
3. Dopo l'induzione di successo di osteoclasti, aspirare il mezzo, e lavare delicatamente i pozzi 3x con PBS.
4. Portare la soluzione fissativa a temperatura ambiente (RT). Aggiungere 2 mL di soluzione fissativa ai pozzetti per 30 s e non lasciare asciugare le cellule.
5. Aspirare la soluzione fissativa, lavarla delicatamente 3x con acqua deionizzata che viene preriscaldato a 37 ° c, e quindi aspirare l'acqua.
6. Aggiungere 2 mL di soluzione di colorazione TRAP per 1 h a 37 ° c e conservare il campione al buio.
7. Dopo 1 h, aspirare la macchia, e lavare delicatamente il campione con acqua deionizzata che viene preriscaldato a 37 ° c, e quindi aspirare l'acqua.
8. Contromacchia le cellule per 1 minuto in una soluzione di ematossilina. Dopo la colorazione, aspirare la soluzione di ematossilina e lavare delicatamente le cellule 3x con acqua deionizzata.
9. Osteoclasti immagine utilizzando microscopia campo chiaro, e TRAP⁺ celle con tre o più nuclei appariranno viola.

7. saggio di riassorbimento osseo utilizzando la colorazione blu di toluidina

1. Pretrattamento delle fette ossee
   1. Tagliare la corteccia ossea femorale bovina fresca in fette spesse 2 cm lungo l'asse longitudinale mediante sega Microelettrica. Quindi, tagliare e macinare le fette con le smerigliatrici dei tessuti duri in 80 μm.
   2. Lavare le fette in un bicchiere con acqua deionizzata e 100 Hz ultrasuoni per 1 h, e ripetere 3x.
   3. Immergere le fette in 75% alcool per 2 h. Quindi, aspirare l'alcol ed esporre ogni lato delle fette alla luce ultravioletta per 1 h su una piattaforma pulita.
   4. Prima di piantare le cellule, immergere le fette nel terreno di coltura per almeno 2 h.
2. Colorazione Blu toluidina
   1. Posizionare le fette ossee pretrattate nella piastra a 24. Piantare le cellule come indicato al punto 4,6 e indurre le cellule come indicato nel paragrafo 5.
   2. Dopo la comparsa di osteoclasti (dopo 4 – 6 giorni), lavare le fette con 1 mL di 0,25 di idrossido di ammonio M, e Sonicare loro 3x per 5 min ciascuno per rimuovere le cellule viventi per consentire l'analisi dei pozzi di riassorbimento sulle fette ossee. Poi, rimuovere l'idrossido di ammonio e macchiare le fette con 1 mL di 1% (wt/vol) toluidina soluzione blu per porzione per 2 min.
   3. Lavare le fette con PBS. Selezionare casualmente cinque viste ed eseguire un'analisi semiquantitativa dell'area di riassorbimento utilizzando un software di analisi delle immagini.

8. microscopia elettronica a scansione

1. Anteporre le fette ossee dal punto 7.2.1 con 1 mL di 2,5% di glutaraldeide per porzione per 2 h a RT, quindi, Sonicare le fette 3x per 3 min ciascuna con 1 M di idrossido di ammonio per rimuovere le cellule e rimuovere l'idrossido di ammonio.
2. Lavare le fette di osso 3x per 12 min ciascuna con PBS.
3. Fissare le fette di osso con 1% di acido osmico per 2 h a RT.
4. Eseguire disidratazione a gradiente di etanolo, con 50%, 70%, 80%, 90%, e 95% etanolo, per 15 min per ogni gradiente, e poi, sostituire l'etanolo con acetato di isoamile per 15 min.
5. Rivestire le fette con oro palladio, e poi, analizzare scansionando microscopia elettronica.

9. colorazione di immunofluorescenza del recettore della calcitonina

Nota: Gli osteoclasti multinucleati saranno presenti dopo 4 – 6 giorni se l'induzione ha esito positivo (paragrafo 5).

1. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente il pozzo 3x con PBS.
2. Fissare le cellule per 10 min con 4% paraformaldeide, che è preraffreddato a 4 ° c.
3. Aggiungere 1 mL di PBS con 0,3% tensioattivo non ionico per pozzo per 30 min su ghiaccio. Quindi, aspirare il PBS con 0,3% tensioattivo non ionico e aggiungere 1 mL di PBS con 5% FBS per pozzo per 30 min su ghiaccio.
4. Aspirare il PBS e incubare le membrane con il recettore anti-calcitonina (anti-CTR) ad una diluizione 1:100 in PBS a 4 ° c durante la notte.
5. Aspirare la soluzione e incubare le membrane con anticorpi IgG anti-coniglio coniugati con Alexa-488 a una diluizione 1:1000 in PBS per 1 ora a RT.
6. Aspirare la soluzione e lavare delicatamente le cellule 3x con PBS. Contromacchia i nuclei con Hoechst 33342 macchia per 3 minuti a RT.
7. Aspirare la soluzione, e lavare delicatamente le cellule 3x con PBS. Osservare l'intensità del CTR mediante microscopia a fluorescenza.

Risultati

Lo scopo del protocollo era quello di isolare e purificare un gran numero di precursori degli osteoclasti convenientemente e indurre osteoclasti con successo. Completando con M-CSF e RANKL, osteoclasti giganti sono stati osservati nei giorni 5 – 6. La formazione di osteoclasti è stata identificata con successo dalla colorazione TRAP (Figura 1a). Le cellule grandi e viola sono state considerate come cellule trappola-positive con nuclei multipli (tipicamente ≥ ...

Discussione

La capacità di ottenere e studiare osteoclasti in vitro è un'abilità critica e fondamentale per qualsiasi ricercatore che desideri studiare il metabolismo osseo, che può aiutare a comprendere i meccanismi delle malattie che assorbono le ossa e sviluppare nuovi agenti terapeutici. Il presente studio ha descritto un protocollo con alcune modifiche basate su metodi precedenti.

Utilizzando puntali per pipette e provette per microcentrifuga per ottenere il midollo osseo, ha ridotto in gran parte il...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Fosfatasi Acida, Lekocyte (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A
Affettatrice automatica per tessuti duri	Lecia	RM2265
		femorale bovino	Acquistato da noi stessi
Incubatrice	Heraus	BB16/BB5060
Siero fetale bovino	Sarana	s-fbs-au-015
Capra Anti-coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Smerigliatrici per tessuti duri	Lecia	SP-2600
Kit istopaco	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Tubo centrifugo silicizzato e soluzione di separazione cellulare
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Microscopio a contrasto di fase invertito	Olympus	CKX31
Microscopio a fluorescenza invertita	Lecia	DMI-3000
MEM, senza glutammina	Gibco	11090-081
Penicillina-streptomicina,	Gibco	15140122
recettore anticalcitonina di coniglio	Bioss	bs-0124R
Ratto ricombinante M-CSF	PeproTech	400-28
Ligando	sRANK di ratto ricombinantePeproTech	400-30
Tampone per lisi dei globuli rossi	Absin	abs47014932
Microscopia elettronica a scansione	FEI	Quanta 200
Toluidina Blu	Sigma-Aldrich	89649