Presentiamo un saggio di fluorescenza per dimostrare che Lucifero Giallo (LY) è un marcatore robusto per determinare l'apparente permeabilità paracellulare dei monostrati cellulari hCMEC/ D3, un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana. Abbiamo usato questo saggio per determinare la cinetica di una formazione di monostrato confluente nelle cellule hCMEC/D3 coltivate.
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Articolo metodologico
Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
La barriera emato-encefalica BBB è costituita da cellule endoteliali che formano una barriera tra la circolazione sistemica e il cervello per impedire lo scambio di ioni non essenziali e sostanze tossiche. Giunzioni strette (TJ) sigillano efficacemente lo spazio paracellulare nei monostrati, causando una barriera intatta. Questo studio descrive un saggio di fluorescenza basato su LY che può essereutilizzato per determinare il suo coefficiente di permeabilità apparente (P app) e a sua volta può essere utilizzato per determinare la cinetica della formazione di monostrati confluenti e la risultante giunzione stretta risultante l'integrità della barriera nei monostrati hCMEC/D3. Dimostriamo inoltre un'utilità aggiuntiva di questo saggio per determinare l'integrità funzionale di TJ nelle cellule trasfette. I nostri dati dal saggiodell'app LY P mostrano che le cellule hCMEC/D3 seminato in una configurazione transwell limitano efficacemente il trasporto paracellulare LY 7 giorni dopo la coltura. Come utilità aggiuntiva del saggio presentato, dimostriamo anche che la trasfezione delle nanoparticelle di DNA non altera il trasporto paracellulare LY nei monostrati hCMEC/D3.
Introduzione
La barriera emato-encefalica (BBB) è la barriera protettiva che limita l'afflusso di componenti plasmatici nel tessuto cerebrale ed è costituita da cellule endoteliali cerebrali insieme a cellule di supporto come i periciti. Il ruolo principale di BBB è quello di fungere da barriera che sigilla lo spazio tra il sangue periferico e il sistema nervoso centrale (SNC) per mantenere l'emostasi del microambiente neurale1,2. Le cellule endoteliali capillari del cervello sigillano efficacemente la via paracellulare attraverso la formazione di giunzioni strette intercellulari (TJ)1. Questa barri....
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Protocollo
1.Coltura cellulare generale hCMEC/D3
- Rianimazione delle cellule congelate
NOTA: tutti i lavori di manutenzione e di manutenzione della coltura cellulare sono stati eseguiti all'interno di una cappa sterile di biosicurezza. I mezzi di coltura, gli integratori e i reagenti sono stati acquistati come prodotti sterili o sterilizzati tramite filtrazione utilizzando un filtro di membrana di 0,22 m per prevenire la contaminazione microbica.- Aggiungere 8,5 mL di soluzione di collagene (0,15mg/mL) in un flacone di coltura tissutale (75 cm2 area di crescita; indicato d'ora in poi come T75) e posizionarlo in un'incubatrice (37 , ....
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Risultati
In primo luogo, abbiamo determinato l'effetto del tempo di coltura sulla permeabilità LY per determinare l'apparente cinetica della formazione di TJ. I valori medidell'app LY P dal giorno 1 al seeding di 10 post sono illustrati nella Figura 2a. Il giorno 1,l'app P media era 4,25 x 10-4 cm/min e leggermente sceso a 3,32 x 10-4 cm/min il giorno 2. Il valore mediodell'app P è leggermente aumentato a 3,93 x 1.......
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Discussione
Un ruolo chiave della BBB è quello di impedire lo scambio di ioni non essenziali e sostanze tossiche tra la circolazione sistemica e il cervello per mantenere l'emostasi del microambiente neurale. Una delle caratteristiche del BBB è la capacità delle cellule endoteliane capillari di formare giunzioni strette (TJ) che sigillano efficacemente il percorso paracellulare di trasporto. Abbiamo dimostrato un saggiodell'app LY P come metodo quantitativo per determinare l'apparente cinetica della formazione della barri.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario dal 2017 New Investigator Award dall'American Association of Pharmacy, un hunkele Dreaded Disease award dalla Duquesne University e i fondi di start-up School of Pharmacy per il laboratorio Manickam. Ringraziamo il laboratorio Leak (Duquesne University) per l'assistenza occidentale del blotting e per aver permesso l'uso del loro imager A 16 bit Odyssey. Vorremmo anche includere una nota speciale di apprezzamento per Kandarp Dave (laboratorio Manickam) per l'aiuto con il gonfiore occidentale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| linea cellulare hCMEC/D3 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | linea cellulare endoteliale microvascolare cerebrale umana |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | DNA plasmidico che codifica per il gene della luciferasi |
| giallo lucifero CH sale di dilitio | Invitrogen | 155267 | |
| Inserti Transwell con membrane in polietilene tereftalato (PET) incise su pista Fiaschetta | Falcon | ||
| Olympus Plastics | 25-207 | ||
| Fondo piatto a 24 pozzetti | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Piastre immunoimetriche nere a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimo terreno essenziale (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Cellule endoteliali basale-2 (EBM-2) |
| soluzione salina tamponata con fosfato 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagene Tipo I | Scoperta Labware, Inc. | Kit per | |
| il dosaggio delle proteine BCA 354236 Pierce | Thermo Scientific | 23227 | |
| Lisi per colture cellulari 5X Reagente | Promega | E1531 | |
| Scarabeo Luciferina, Sale di Potassio | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Lettore di piastre a fluorescenza | |
| Soluzione di tripano blu, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| Anticorpo policlonale ZO-1 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anticorpo anti-GAPDH | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-coniugato AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 pozzetti, fondo piatto | Olympus Plastics | 25-106 | |
| tampone RIPA (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Imager Odyssey CLx | LI-COR Biosciences per la | scansione di membrane western blot |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
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Ristampe e permessi
