Cellule endoteliali microvascolari dei muscoli scheletrici (MMEC) forma la parete interna dei vasi capillari del muscolo e regolano entrambi, scambio di fluidi/molecole e migrazione delle cellule (immuni) tra sangue e tessuto muscolare. Isolamento di MMEC murino primario, come descritto qui, consente indagini complete in vitro del "unità myovascular".
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule endoteliali dei capillari del muscolo scheletrico (muscolo cellule endoteliali microvascolari, MMEC) costruire la barriera tra sangue e nei muscoli scheletrici che regolano lo scambio di fluidi e sostanze nutrienti, nonché la risposta immunitaria contro infettive agenti di controllo della migrazione delle cellule immuni. Per queste funzioni, MMEC formano un funzionale "unità myovascular" (MVU), con altri tipi di cellule, come fibroblasti, periciti e cellule muscolari scheletriche. Di conseguenza, una disfunzione di MMEC e di conseguenza il MVU contribuisce a una vasta varietà di miopatie. Tuttavia, meccanismi regolatori di MMEC nella salute e nella malattia rimangono insufficientemente capiti e loro delucidazione precede trattamenti più specifici per miopatie. L'isolamento e l'indagine approfondita delle funzioni primarie di MMEC nel contesto del MVU potrebbe agevolare una migliore comprensione di questi processi.
Questo articolo fornisce un protocollo per isolare MMEC murino primario del muscolo scheletrico di dissociazione meccaniche ed enzimatiche, tra cui purificazione e operazioni di manutenzione di cultura.
Introduzione
Organi, cellule e via flusso sanguigno sono forniti con ossigeno, substrati e altre molecole necessarie. Questo interscambio avviene nei capillari, i vasi più piccoli. I capillari sono formati da uno strato interno delle cellule endoteliali (CE) cui integrità rimane un prerequisito per il successo regolazione dell'omeostasi del muscolo tra lo spazio intravascolare e interstiziale. Per garantire una transizione selettiva di cellule e fattori solubili, CE costituiscono un monostrato collegati tra loro da stretti e adherens junctions 1. Oltre il suo ruolo come barriera per le sostanze nutrienti o prodotti metabolici, CE regolano il reclut....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità locali e condotto secondo la legge tedesca sul benessere degli animali (84-02.05.20.13.097).
1. osservazioni sugli esperimenti sugli animali
- Eseguire tutti gli esperimenti del mouse conformemente agli orientamenti della rispettiva cura animale istituzionale e utilizzare il comitato.
- Tenere topi in condizioni standardizzate e secondo linee guida internazionali come la Federazione per Laboratory Animal Science associazioni (FELASA).
Nota: In generale questa tecnica di isolamento può essere utilizzata per topi indipendenti da età, se....
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Risultati
Un giorno dopo l'isolamento, MMEC murino primario e residuo altre cellule formano conglomerati e aderiscano alla parte inferiore di piastre di coltura (Figura 1A giorno 1). Da giorno 7, si possono osservare cellule piatte e allungate. Tuttavia, la contaminazione di altri, principalmente cellule di sferoide, è ancora visibile (Figura 1A giorno 7). Così, un altro ciclo di CD31 positivi selezione tramite MCS è richiesto. Qu.......
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Discussione
Cellule endoteliali microvascolari forniscono funzioni di barriera in tutti i tessuti e i loro risultati di disfunzione nella malattia di organi associati 3. Inoltre, gli studi di organo-specifici di microvascolare CE potrebbero spianare la strada per nuove strategie terapeutiche. Di conseguenza, una più profonda comprensione della funzione microvascolare CE in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è di grande interesse scientifico. Modulazione dell'interazione leucocita/endotelio è utilizzat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal "altro Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 a TR), "Innovative Medizinische Forschung (FMI) Münster" (I-RU211811 a TR) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 e ME 3283/6-1 a SGM). Immagini illustrate fornite da Heike Blum.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | tampone |
| ACK | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA in acqua a pH 7,3 | ||
| Anti-topo CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Controllo isotipico: FITC Rat IgG2a, κ Isotipo Ctrl |
| Anti-topo CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Controllo isotipico: PE Ratto IgG2b, κ Isotipo Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Fattore di crescita dei fibroblasti di base |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads topo | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads topo | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenasi-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenasi da V. alginolyticus, Dispasi da B. polymyxa |
| Corning Costar Piastre multiple a 6 pozzetti trattate con TC Corning | 3516 | ||
| Anticorpo IgG anti-ratto coniugato Cy3 | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (reagente antidissolvenza ProLong Gold con DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desossiribonucleasi | Sigma Aldrich | D4513 | Desossiribonucleasi I da pancreas bovino |
| Dietilpirocarbonato acqua trattata Thermo | Fisher | AM9916 | |
| DMEM, contenente glutammina Integratore e piruvato | Thermo Fisher | 31966-021 | riscalda fino a 37 gradi ° C prima dell'uso |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Provette FACS | Sarstedt | 551.579 | |
| Falcon 70 μ m Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| Tampone | 0,1% BSA, 0,2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Siero fetale di vitello | Sigma Aldrich | F6178 | Siero fetale di vitello |
| Colorante di vitalità fissabile eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Pinze (seghettate, dritte, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Pinze (seghettate, diritte, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Siringa da insulina 100 Solo 1 mL (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| (colonne LS) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MCS | 0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS a un pH di 7,2 | ||
| Colonna magnetica media (colonna MS) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | per CD31-MACS-step |
| Acqua priva di nucleasi | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Soluzione salina tamponata con fosfato, tampone PCR pronto all'uso | |
| (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in kit con la trascrittasi inversa |
| Pecam1 ratto α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 &; g/mL |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma Aldrich | P4333 | |
| cellule muscolari murine primarie | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Caderina) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM marcato |
| Primer Cldn5 (claudina-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM marcato |
| Primer Ocln (occludina) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | Primer marcato FAM |
| Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | Primer marcato FAM |
| Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM marcato |
| Primer 18s rRNA (controllo endogeno eucariotico) | Thermo Fisher | 4310893E Tampone | marcato VIC |
| (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; per 200 reazioni ciascuna |
| Miscela casuale di primer a filamento singolo | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Trascrittasi inversa (200 U/μ L) + tampone PCR (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Inibitore della RNASI (40 U/μ L) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Forbice (tagliente 23 mm, affilato/affilato) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Forbice (tagliente 42 mm, affilato/smussato) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Riferimenti
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S.
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