Dopo aver controllato di sangue-ossigeno-livello-dipendente funzionale imaging a risonanza magnetica (fMRI grassetto) che la corrispondente zona della corteccia somatosensoriale barile campo (chiamata S1BF) è correttamente attivato, il principale obiettivo di questo studio è quello di quantificare il contenuto del lattato fluttuazioni nei cervelli del ratto attivati dalla spettroscopia di risonanza magnetica del protone localizzata (1H-MRS) a 7 T.
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Articolo metodologico
Spettroscopia di risonanza magnetica funzionale a 7 T nella corteccia di canna del ratto durante l'attivazione Whisker
In questo articolo
Sommario
Abstract
Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) offre l'opportunità di misurare cerebrale metabolita contenuto in vivo e non invadente. Grazie agli sviluppi tecnologici nel corso dell'ultimo decennio e l'aumento della resistenza del campo magnetico, è ora possibile ottenere buona risoluzione spettri in vivo nel cervello del ratto. Neuroenergetics (cioè, lo studio del metabolismo del cervello) e, soprattutto, le interazioni metaboliche tra i diversi tipi cellulari hanno attirato sempre più interesse negli ultimi anni. Tra queste interazioni metaboliche, l'esistenza di una navetta di lattato tra neuroni e astrociti è ancora dibattuta. È, quindi, di grande interesse per eseguire spettroscopia di risonanza magnetica funzionale protone (1H-MRS) in un modello del ratto del lattato del monitor e l'attivazione del cervello. Tuttavia, il picco di lattato di metile si sovrappone a picchi di risonanza del lipido ed è difficile da quantificare. Il protocollo descritto di seguito permette metabolico e del lattato di fluttuazioni da monitorare in una zona del cervello attivato. Attivazione cerebrale è ottenuto da stimolo whisker e 1H-MRS è eseguita nella corteccia barile attivato corrispondente, cui area è rilevato usando sangue-ossigeno-livello-dipendente risonanza magnetica funzionale (fMRI grassetto). Tutti i passaggi sono descritti: la scelta di anestetici, bobine e sequenze, raggiungere whisker efficiente stimolazione direttamente nel magnete ed elaborazione dei dati.
Introduzione
Il cervello possiede meccanismi intrinseci che consentono la regolazione del suo substrato principale (cioè, glucosio), sia per il suo contributo e il suo utilizzo, a seconda delle variazioni nell'attività cerebrale locale. Anche se il glucosio è il substrato principale di energia per il cervello, gli esperimenti condotti negli ultimi anni hanno indicato quello lattato, che viene prodotta dai astrocytes, potrebbe essere un substrato energetico efficiente per i neuroni. Ciò solleva l'ipotesi di una spola di lattato tra astrociti e neuroni1. Conosciuto come ANLS, per astrociti lattato navetta2, la teoria è ancora altamente dibattuta ma ha portato la proposta che il glucosio, piuttosto che andare direttamente in neuroni, può immettere gli astrociti, dove viene metabolizzato in lattato, un metabolita che è , poi, trasferiti ai neuroni, che lo utilizzano come substrato energetico efficiente. Se una tale navetta esiste in vivo, avrebbe parecchie conseguenze importanti sia per la comprensione di base tecniche di imaging cerebrale funzionale (tomografia a emissione di positroni [PET]) per decifrare le alterazioni metaboliche osservate nelle patologie cerebrali.
Per studiare il metabolismo del cervello e, in particolare, le interazioni metaboliche tra neuroni e astrociti, quattro principali tecniche sono disponibili (non compresi micro-/ nanosensori): autoradiografia, PET, microscopia confocale fluorescente del due-fotone e la signora. Autoradiografia è stato uno dei primi metodi proposti e fornisce immagini dell'accumulo regionale di radioattivo 14C-2-deossiglucosio nelle fette del cervello, mentre rese in vivo immagini PET dell'assorbimento regionale di radioattivo 18 F-deossiglucosio. Entrambi hanno lo svantaggio di utilizzare molecole irradiative, producendo immagini di risoluzione bassa-spaziale. Microscopia del due-fotone fornisce una risoluzione cellulare sonde fluorescenti, ma dispersione della luce dal tessuto limita la profondità di imaging. Queste tre tecniche sono state utilizzate in precedenza per studiare neuroenergetics in roditori durante whisker stimolazione3,4,5,6. In vivo MRS ha il duplice vantaggio di essere non invadente e non radioattivi, e qualsiasi struttura del cervello possa essere esplorato. Inoltre, MRS può essere eseguita durante l'attivazione neuronale, una tecnica chiamata MRS funzionale (fMRS), che è stato sviluppato molto recentemente in roditori7. Pertanto, si propone un protocollo per il monitoraggio del metabolismo cerebrale durante l'attività cerebrale di 1H-MRS in vivo e non invadente. La procedura è descritta in ratti adulti sani con l'attivazione del cervello ottenuto da un soffio di aria whisker stimolo eseguita direttamente in un imager di risonanza magnetica (RM) T 7 ma può essere adattata in animali geneticamente modificati, nonché in qualsiasi condizione patologica .
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Protocollo
Tutte le procedure di animali sono stati condotti in conformità degli orientamenti di sperimentazione animale della direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Il protocollo ha incontrato le linee guida etiche del Ministero francese dell'agricoltura e foreste ed è stato approvato dai comitati etici locali (Comité d 'éthique pour L' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).
Nota: Durante le misurazioni di MR, un adeguato livello di anestesia e monitoraggio fisiologico (temperatura corporea, frequenza respiratoria) sono requisiti indispensabili.
1. gli animali
- Utilizzare i ratti maschii di Wistar peso compreso tra 350 e 450 g.
- Tenerli su un 12:12 h chiaro: scuro ciclo e fornire cibo e acqua ad libitum.
2. anestesia
- Preparare l'attrezzatura necessaria per l'anestesia (Figura 1A, B, Vedi Tabella materiali): una siringa da 5 mL contenente medetomidina in soluzione fisiologica (240 µ g/kg/h, con un tasso di aspersione di 20 µ l/min), una siringa da 0,5 mL contenenti atipamezolo (20 μL, in 0,5 mL di soluzione salina) e unguento oculare.
Nota: Tenere tutte le attrezzature sotto la cappa di aspirazione, tranne la siringa da 5 mL contenente medetomidina, che viene inserito nella pompa a siringa vicino al magnete per anestesia durante acquisizioni di MR. - Posizionare il ratto nella camera di induzione, iniziare l'anestesia fornendo 4% isoflurane e regolare la portata di ossigeno a 1,5 L/min.
- Valutare la profondità dell'anestesia valutando il ritiro dei riflessi di zampa.
- Quando il topo non risponde alla stimolazione, portarlo fuori dalla scatola di anestesia, posizionarlo sulla panchina con il suo naso nella maschera di isoflurano e mantenere l'anestesia fornendo 2,5% in ossigeno a 1,5 L/min.
- Delicatamente la coda di massaggio e posizionare il laccio emostatico (Figura 1).
Nota: Il massaggio può essere eseguito in acqua calda, con una temperatura compresa tra 38 e 42 ° C, per ottenere migliore vasodilatazione delle vene. - Inserire il catetere endovenoso periferico (22 G), precedentemente eparinizzato, nella vena caudale sinistro o destro. Nota che si osserva un ritorno venoso (una goccia di sangue è visibile alla parte distale dell'ago) quando il catetere è correttamente inserita (Figura 1).
- Far fuoriuscire eventuali bolle d'aria presenti nel volume di spazio morto del catetere usando la siringa da 2 mL contenente eparina e soluzione fisiologica.
- Applicare l'unguento dell'occhio e preparare la siringa contenente atipamezolo (17 µ g/mL) per risvegliare il topo alla fine dell'esperimento.
3. ratto posizionamento nel magnete per stimolazione Whisker
- Posto un sensore di respirazione sul letto magnete e quindi trasferire il ratto dalla panchina per il letto di magnete. Collocarlo in posizione prona con il suo naso nella maschera di isoflurano, con il sensore di respirazione che si trova tra la gabbia toracica e il letto di magnete.
Nota: Tutte le attrezzature che entra nella stanza di MRI dovrebbero essere MRI-cassetta di sicurezza. - Diminuire l'isoflurano (dal 4% al 1,5%-2%) durante il posizionamento del ratto e passare l'anestesia alla medetomidina alla fine di questa procedura. Garantire che i baffi di destro sono gratuiti, dopo aver tagliato il bordo destro nella parte anteriore del ratto letto MRI in anticipo per permettere il movimento dei baffi.
- Tenere il ratto in posizione con nastro e monitorare la respirazione che deve essere compreso tra 60 e 80 respiri al minuto.
- Fare una vela che intrappola tutto bene baffi nel nastro di carta (Figura 2). Allineare il tubo di scarico flessibile del sistema aria-soffio lungo il ratto letto MRI affinché la parte usciti dal tunnel è perpendicolare e a circa 1,5 cm dalla vela. Fissarlo con nastro di carta.
4. whisker stimolazione
- Collegare il tubo flessibile d'entrata da una sorgente di aria compressa (1 bar) per un input di solenoide controllo valvola e il tubo di mandata all'output del solenoide controllo valvola (Figura 3). Assicurarsi che la valvola di controllo del solenoide rimane fuori dalla stanza del magnete.
- Collegare il dispositivo pulsa l'elettrovalvola e al magnete utilizzando la logica del transistore-transistore (TTL)-porto. Configurarlo in modo che la frequenza di pulsazione = 8 Hz, tempo di pulsazione = 20 s e il periodo di riposo = 10 s.
Nota: Questi parametri, visualizzati sul piccolo schermo a cristalli liquidi (LCD) schermo di visualizzazione, sono regolabili tramite i tre potenziometri analogici dedicati. Il pulsa dispositivo elettronico, che controlla il paradigma, deve essere composto di componenti elettronici di alta qualità per evitare qualsiasi deriva nei parametri di tempo (per post-elaborazione corretta).
5. BOLD fMRI acquisizione
- Mettere il cervello di ratto, in modo che è in posizione verticale e utilizzare le barre di orecchio per mantenerla. Posizionare la bobina di matrice volume sopra la testa del ratto (Figura 4A) e fissarlo con del nastro. Controllare che la vela si muova correttamente (movimento antero-posteriore, senza rotazione e senza attrito di vela) quando il sistema di aria-puff è girato su; quindi, spegnere.
- Inserire il letto e la bobina al centro del magnete. Verifica che la vela è ancora in movimento correttamente una volta che il letto è all'interno del magnete quando il sistema di aria-puff è su; quindi, spegnere. Passare completamente da isoflurane medetomidina (tasso di perfusione: 20 µ l/min).
- Controllare che il ratto è ben situato utilizzando una sequenza di localizzazione (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; medio = 1; ripetizione = 1; affettare = 1 mm; dimensione della battuta = 256 x 256; campo visivo (FOV) = 50 x 50 mm; tempo di scansione = 12 s 800 ms). Trascinare la scheda di sequenza Localizer nel nome di istruzioni e fare clic su continua.
- Trascinare la scheda di sequenza di T2_Star_FID_EPI nel nome di istruzione, centro il FOV al centro del cervello e fare clic sulla scheda piattaforma di aggiustamento per aprire le istruzioni di scansione modificato. Registrare una B0 mappa e procedere alla scansione shim.
Nota: Per una mappa di0 B, utilizzare i seguenti parametri: primo tempo eco = 1,65 ms; TR = 20 ms, medio = 1; angolo di vibrazione = 30°; Eco spaziatura = 3,805 ms; affettare = 58 mm; dimensione della battuta = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; tempo di scansione = 1 m 24 ms. s 920 per scansione shim, utilizzare i seguenti parametri: eccitazione selettiva voxel = impulso gaussiano di vapore; TE = 5 ms; tempo di miscelazione = 10 ms; Durata acquisizione = 204,8 ms; larghezza di banda = 10.000 Hz; tempo di permanenza = 50 μs). - Avviare la sequenza di T2 Star_FID_EPI (TE = 16,096 ms; TR = 500 ms; medio = 1; ripetizione = 600; affettare = 1 mm; quattro fette consecutivi; dimensione della battuta = 128 x 128; FOV = 20 x 20 mm; larghezza di banda = 333.333,3 Hz; tempo di scansione = 5 min 00 s).
Nota: A causa del porto TTL, un segnale di trigger esterno inizierà il sistema aria-soffio allo stesso tempo. Il paradigma = [attivazione s 20 + 10 s resto] x 10, per la durata totale delle 600 scansioni, 500 ms per ogni scansione. Le fette sono allineate al centro della zona di campo di canna. - Acquisire un'altra sequenza di localizzazione (identico a quello descritto nel passo 5.3) per confrontare con il primo e controllare se il topo è stato spostato durante la sequenza di T2_Star_FID_EPI.
- Riportare il letto in posizione iniziale, rimuovere la bobina di matrice di volume e collegare la bobina di superficie.
6. elaborazione di grassetto
- Aprire il file T2 Star_FID_EPI e leggere l'immagine T2 Star_FID_EPI nella Visualizzazione delle immagini. Aprire la finestra di avvio del controller funzionale, chiamato FunController.
- In questa scheda di elaborazione , selezionare la finestra di imaging funzionale e definire il protocollo di stimolazione (durata e alternanza di On/Off periodi, corrispondente al paradigma utilizzato).
- Selezionare la finestra di protocollo (dataset con 600 fotogrammi) e inserire il valore di 40 nella scheda Il periodo e 20 nella scheda fuori periodo fare clic sulla scheda Attribuzione invertire e trascina il cursore di Stimolazione stati verso sinistra per selezionare il valore 1.
- Nella finestra di pre-elaborazione, fare clic sul filtro mediano in aereo per la pre-elaborazione e il filtro mediano (2D, 3D) per post-elaborazione.
- Fare clic sulla scheda Execute e trascinare i cursori per regolare la tabella di ricerca di sovrapposizione. Visualizzare l'area del cervello attivato (Figura 4B).
7. proton MRS acquisizioni
- Per posizionare correttamente la bobina di superficie, modificare la posizione della testa del ratto. Ruotare la testa (circa 30° in senso orario) in modo che la bobina di superficie (Figura 5A) può essere posizionata appena sopra la corteccia sinistra barile pur essendo orizzontale e si trova al centro del magnete all'interno del magnete.
- Posizionare la bobina di superficie, risolvere il problema il cervello del ratto usando del nastro (figura 5B) e controllare che la vela si muova correttamente (movimento antero-posteriore, senza rotazione e senza attriti della vela) quando il sistema di aria-puff è girato su; quindi, spegnere l'interruttore generale.
- Controllare che la vela si muova correttamente una volta che il letto è all'interno del magnete quando il sistema di aria-soffio è il. Quindi, spegnere.
- Verificare che il ratto sia posizionato correttamente utilizzando una sequenza di localizzazione. Impostare i parametri come segue: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; medio = 1; ripetizione = 1; affettare = 1 mm; dimensione della battuta = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm; tempo di scansione = 12 s 800 ms.
- Trascinare la scheda sequenza Localizer nella finestra nome istruzioni e fare clic sulla scheda continua a eseguire il programma di scansione.
- Quando la localizzazione cerebrale è corretta, trascinare la scheda di sequenza di T2_TurboRARE nella finestra nome istruzione e clicca su continua per eseguire il programma di scansione. Queste immagini anatomiche, insieme con l'acquisizione di fMRI grassetto precedente, consentirà la corretta localizzazione del voxel nella S1BF MRS.
Nota: I parametri T2_TurboRARE sono 14 sezioni, 2 mm per ogni fetta, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5.000 ms, matrice = 128 x 128, tempo di sequenza = 2 min 40 s. - Trascinare la scheda sequenza LASER nella finestra nome istruzione , posto il voxel (2 mm di altezza, lungo 2,5 mm, 3 mm di profondità) al centro della zona di S1BF.
- Utilizzare un Atlante del cervello del ratto e la valorizzazione di fMRI grassetto per localizzare la zona sulle immagini T2 (Figura 6). Fare clic sulla scheda piattaforma di aggiustamento per aprire le istruzioni di scansione modificato. Fare clic sulla scheda Wobble e modificare l'impedenza (caricamento elettronico) della bobina leggermente per sintonizzare in ricezione. Fare clic sulla scheda applica quando l'accordatura è finito per chiudere l'editor di istruzioni e applicare le modifiche nell'istruzione modificato.
- Registrare una B0 mappa e procedere alla scansione shim e, quindi, eseguire uno spessore locale.
Nota: Per la mappa di0 B, utilizzare i seguenti parametri: primo tempo eco = 1,65 ms; TR = 20 ms, medio = 1; angolo di vibrazione = 30°; Eco spaziatura = 3,805 ms; affettare = 58 mm; dimensione della battuta = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; tempo di scansione = 1 m 24 ms. s 920 per lo spessore di scansione, utilizzare i seguenti parametri: impulso gaussiano di voxel eccitazione selettiva di vapore; TE = 5 ms; tempo di miscelazione = 10 ms; Durata acquisizione = 204,8 ms; larghezza di banda = 10.000 Hz; tempo di permanenza = 50 μs. Per lo spessore locale, utilizzare i seguenti parametri: soppressione di acqua, vapore Durata acquisizione = 1.363,15 ms; punti = 4.096; larghezza di banda in Hz = 3.004,81 Hz; larghezza di banda in ppm = 10 ppm; tempo di permanenza = 166,40 μs; risoluzione spettrale = 0,37 Hz/punti. I parametri LASER sono: echo tempo = ms 19,26; TR = 2.500 ms; Media = 128 o 32; tempo di scansione = 5 min 20 s o 1 min 20 s; punti di acquisizione = 4.096. - Eseguire 1H-MRS.
- Avviare 1H-MRS acquisizione prima durante un periodo di riposo (scansioni LASER 4x32 + 128 LASER scansiona; 2.500 ms per ogni scansione).
- Acquisire un'altra sequenza di localizzazione (identico a quello descritto nel passo 5.3) per confrontare con il primo registrato e garantire che il topo non è spostato durante l'acquisizione di LASER.
- Eseguire 1H-MRS durante l'attivazione di whisker utilizzando la sequenza LASER (scansioni LASER 4x32 + 128 LASER scansiona; 2.500 ms per ogni scansione) con il sistema di aria-puff (paradigma = 20 s di attivazione e 10 s di riposo).
- Ancora una volta, eseguire una sequenza di localizzazione per controllare se il topo è stato spostato.
Nota: Il numero di scansioni e periodi di riposo/attivato può essere adattato e modificato, ma sempre in modo che il topo non è commovente eseguendo regolarmente una sequenza di localizzazione.
- Riportare il letto in posizione iniziale, rimuovere la bobina di superficie e fai avanzare il ratto torna in panchina. Iniettare atipamezolo in una piega di pelle fatta nella parte posteriore del ratto di invertire l'anestesia e risvegliare.
8. proton MRS elaborazione
- Aprire il software di LCModel e fare clic sulla scheda appropriata per selezionare il tipo di dati corretto (file Free Induction Decay ) e scegliere il file giusto. Fare clic sulla scheda OK quando questo è fatto.
- Ottimizzare i parametri di controllo di quantificazione passo dopo passo.
- Nella sezione del titolo , immettere un titolo e definire un intervallo di ppm adeguata (ad es., 0.2-4,0 ppm) digitando manualmente il valore necessario nei rispettivi campi manualmente.
- Nella sezione del file di base , selezionare e scaricare il file necessario per adattarla correttamente la linea di base della macromolecola (può essere fornito dal fornitore del software).
- Definire e caricare i parametri di controllo di input. Preparare il salvataggio processo di tutti i tipi di file utili in anticipo (tabella = tavole compatte; PS = output PostScript necessarie; CSV = formato per fogli di calcolo; COORD = Coordinate piazzole). Fare clic sulla scheda RunLCModel per avviare la quantificazione di LCModel.
- Definire metaboliti selezionati per generare le statistiche.
Nota: LCModel fornisce quantificazione metabolita ed errori di stima di un valore definito limite inferiore di Cramér-Rao (CRLB). Un valore con un CRLB < 15 è considerato come una quantificazione ottima. Un CRLB > 25 indica un valore inaffidabile.
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Risultati
Questo protocollo permette la quantificazione delle fluttuazioni di metabolita durante l'attivazione cerebrale, che si ottiene dalla stimolazione destra whisker direttamente nel magnete.
In questo studio, l'obiettivo generale di fMRI grassetto era per controllare che la stimolazione di baffo era efficiente, per visualizzare l'area di S1BF attivata e per individuare correttamente i voxel per 1H-fMRS. Il dispositivo cos...
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Discussione
La corteccia di canna, chiamata anche S1BF per la corteccia somatosensoriale o un campo di canna, è una regione all'interno dello strato corticale IV che possono essere osservate utilizzando ossidasi del citocromo c colorazione9, e la sua organizzazione è ben nota, poiché è stato ampiamente descritto 10,11. Una vibrissa è connesso a un barile, in cui circa 19.000 neuroni sono organizzati in una colonna12. Il pathway...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione LabEx TRAIL, riferimento ANR-10-LABX-57 e un francese-svizzero ANR-FNS concedere riferimento ANR-15-CE37-0012. Gli autori ringraziano Aurélien Trotier per il suo supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 0,5 mL con ago | Becton, Dickinson and Company, USA | 2020-10 | 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm |
| 1H bobina di superficie per spettroscopia | Bruker, Ettlingen, Germania | T116344 | |
| 7T Sistema Bruker Biospec | Bruker, Ettlingen, Germania | 70/20 USR | |
| Dispositivo pulsante basato su Arduino Uno | su | ||
| misuraAtipamezolo | Vé toquinol, S.A., Francia | V8335602 | Antisedan, 4,28 mg |
| Maschera respiratoria | su misura | ||
| Unguento oculare | TVM laboratoire, Francia | 40365 | Ocry gel 10 g |
| Camera di induzione | su misura | 30x17x15 cm | |
| Tubo flessibile di ingresso | Gardena, Germania | 1348-20 | 4,6 mm di diametro, 3 m di lunghezza |
| Pompa per isoflurano, vaporizzatore serie 100, classico T3 | Surgivet, Harvard Apparatus | WWV90TT | da OH 43017, U.S.A |
| Isoflurane, liquido per inalazione | Vertflurane, Virbac, Francia | QN01AB06 | 1000 mg/mL |
| Pompa a siringa KD Scientific | KD sientific, Holliston, USA | Legato 110 | |
| LCModel software | LCModel Inc., Ontario, Canada | 6.2 | |
| Medetomidina cloridrato | Vé toquinol, S.A., Francia | QN05CM91 | Domitor, 1 mg/mL |
| Rotolo Micropore di cerotto adesivo | 3M micropore, Minnesota, Stati Uniti | MI912 | |
| Rotolo Micropore di cerotto adesivo | 3M micropore, Minnesota, Stati Uniti | MI925 | |
| Sistema di monitoraggio del parametro fisiologico | SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA | Modello 1025 | |
| NaCl | Fresenius Kabi, Germania | B05XA03 | 0,9 % 250 mL |
| Tubo flessibile di uscita | Gardena, Germania | 1348-20 | 4,6 mm di diametro, 4 m di lunghezza |
| Software | Paravision Bruker, Ettlingen, Germania | 6,0.1 | |
| Catetere endovenoso periferico | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SP500930S | 22 G x 1", 0,85x25 mm, 35 mL/min |
| Bobina testa di ratto | Bruker, Ettlingen, Germania | ||
| Eparina sodica, soluzione iniettabile | Choai, Sanofi, Parigi, Francia | B01AB01 | 5000 UI/mL |
| Valvole di controllo a solenoide, valvola a stantuffo a 2/2 vie ad azione diretta | Burkert, Germania | 3099939 | Tipo di modello 6013 |
| Terumo Siringa da 2 ml | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SY243 | con ago da 21 g x 5/8" |
| Siringa Terumo da 5 ml | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | 05SE1 | |
| Wistar RJ-Han ratts | Janvier Laboratories, Francia |
Riferimenti
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