Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Summary

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Abstract

La presenza, assenza o livelli di specifiche proteine sinaptiche possono influire gravemente trasmissione sinaptica. Oltre a chiarire la funzione di una proteina, è fondamentale per determinarne anche la distribuzione. Qui, descriviamo un protocollo che impiegano immunofluorescenza, microscopia confocale e l'analisi computerizzata per determinare la distribuzione della proteina sinaptica Mover (chiamato anche TPRGL o SVAP30). Mettiamo a confronto la distribuzione del motore a quello della sinaptofisina proteine delle vescicole sinaptiche, determinando la distribuzione del motore in maniera quantitativa rispetto l'abbondanza delle vescicole sinaptiche. In particolare, questo metodo potrebbe potenzialmente essere implementato per consentire il confronto tra la distribuzione delle proteine usando anticorpi differenti o microscopi o attraverso studi differenti. Il nostro metodo elude la variabilità inerente di immunofluorescente stainings cedendo un rapporto piuttosto che i livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre, il metodo descriviamo consente al ricercatore di analizzare la distribuzione di una proteina su diversi livelli: dalle fette di cervello intero a regioni del cervello a subregions differenti nell'area di un cervello, come i diversi strati dell'ippocampo o sensoriali cortecce. Mover è una proteina di vertebrato-specifico che è associata con vescicole sinaptiche. Con questo metodo, dimostriamo che Mover è eterogeneo tra aree del cervello, con gli alti livelli nell'amigdala, i nuclei settali e pallidum ventrale e anche all'interno di aree cerebrali singole, ad esempio i diversi strati dell'ippocampo.

Introduction

Comunicazione tra neuroni avviene presso siti specializzati di contatto chiamati sinapsi. Sinapsi contengono una miriade di diverse proteine che orchestrano trasmissione sinaptica. Alcune di quelle proteine mostrano una distribuzione eterogenea in tutto il sistema nervoso e non sono presenti in ogni sinapsi¹. Un esempio di una tal proteina è Munc13, che è coinvolto nel processo di adescamento delle vescicole sinaptiche. Esistono diverse isoforme di Munc13, che sono distribuite in modo eterogeneo in tutto il cervello², e la presenza o l'assenza di specifiche isoforme possa influenzare la plasticità sinaptica a breve termi....

Protocol

Questo protocollo non comporta esperimenti su animali vivi. Gli esperimenti che coinvolgono eutanasia degli animali per ottenere campioni del cervello sono stati approvati dalle autorità locali di protezione animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sotto il numero di omologazione T 10/30.

Nota: Per questo protocollo, sono stati utilizzati topi C57BL/6 3 maschio adulto.

1. preparazione del campione

1. Preparare il fissativo e tampone fosfato 0,1 M (PB; si veda tabella 1).
2. Difficoltà l'animale mediante perfusione perfusione come descritto in Gage et al.<....

Results

Rappresentante modelli dei diversi marcatori di macchiatura può essere visto nella Figura 1. Il modello varia a seconda della distribuzione della proteina. Esempi di cinque livelli di rostro-caudale sono riportati nelle colonne (A)-(E). Un rappresentante colorazione DAPI è indicata nella prima riga: DAPI aderisce al DNA di una cellula e quindi i nuclei sono colorati. Ciò provoca un modello punctato. Regioni con una densità el.......

Discussion

Il metodo qui presentato mira a quantificare la distribuzione di una proteina di interesse riguardante l'abbondanza di una proteina marker con una nota distribuzione. Colorazione di immunofluorescenza può mostrare un'alta variabilità dell'intensità tra le diverse sezioni di colorazione. L'approccio di quantificazione descritto qui aggira questo problema determinando il rapporto della proteina di interesse per i media in tutto l'emisfero. Di conseguenza, diverse intensità di colorazione attraverso fette sono vanificate e .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette di reazione da 1,5 mL	Eppendorf	30120094
Provette di reazione da 50 mL	Greiner Bio-One	227261
multipozzetto a 24 pozzetti	Fisher Scientific	087721H
pipetta in plastica (monouso)	Sarstedt	861.176
Pipetta da 1000 ml	Rainin
pipetta da 2 ml	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	Vetrini per	3340001
Menzel	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscopio	Leica
LSM800	Zeiss	Microscopio confocale
microtomo per congelamento	Leica
PBS (10X)	Roche
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
saccarosio	neoFroxx	1104KG001
Tessuto Tek Sakura		4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1.063.460.500
siero di capra normale	Merck Millipore	S26-100ML
siero d'asino normale	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1.086.031.000
coniglio anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
cavia anti-sinaptofisina	Sistemi sinaptici	RRID: AB_1210382
asino anti-coniglio AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
capra anti-topo AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem
software ZEN2 blue Software	microscopia Zeiss
Software di analisi FIJI	ImageJ
Microsoft Excel	Microsoft