Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l'analisi di gratta e Vinci, l'analisi di invasione di transwell e l'analisi di proliferazione delle cellule.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast
In questo articolo
Sommario
Abstract
Movimento delle cellule è una proprietà critica di trofoblasto durante lo sviluppo placenta e la gravidanza iniziale. Il significato del trofoblasto corretta migrazione e l'invasione è dimostrato da disturbi di gravidanza come restrizione della crescita intrauterina e di pre-eclampsia, che sono associati con l'invasione del trofoblasto inadeguata del vasculature materno. Purtroppo, la nostra comprensione dei meccanismi da cui la placenta si sviluppa dalla migrazione trofoblasto è limitato. Analisi in vitro di migrazione delle cellule via l'analisi gratta e Vinci sono uno strumento utile nell'identificazione dei fattori che regolano la capacità migratoria trofoblasto. Tuttavia, questo test da solo non definisce i cambiamenti cellulari che possono provocare la migrazione cellulare alterata. Questo protocollo descrive tre diversi saggi in vitro utilizzati collettivamente per valutare il movimento delle cellule di trofoblasto: il dosaggio di gratta e Vinci, l'analisi di invasione e il saggio di proliferazione. I protocolli descritti qui possono essere modificati anche per l'uso in altre linee cellulari per quantificare il movimento cellulare in risposta agli stimoli. Questi metodi consentono ai ricercatori di identificare fattori individuali che contribuiscono al movimento delle cellule e forniscono un esame approfondito dei meccanismi potenziali cambiamenti apparenti nella migrazione cellulare.
Introduzione
Sviluppo placenta è un passo fondamentale nella creazione della gravidanza, un impatto di salute sia materna che fetale. Tuttavia, la base meccanicistica per cui questo processo avviene completamente non è capita. Migrazione delle cellule è un processo biologico importante che contribuisce alla costituzione e funzioni della placenta durante la gravidanza. A seguito dell'impianto di blastocisti, delle cellule trofoblastiche differenzia in trofoblasti villosi, che coprono la superficie dei villi coriali e sono coinvolti in gas e lo scambio di nutrienti, ed extravillous trofoblasto (EVTs), che migrano fuori da villi e invadere la materna decidua e sistema vascolare
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. cella preparazione
- Mantenere le cellule in boccette di T-75 in media standard crescita a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità.
Nota: Le cellule utilizzate in questi esperimenti erano l'immortalizzate linee cellulari di primo-acetonide trofoblasto Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. Le cellule Sw.71 sono state mantenute in DMEM/F-12 completati con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), piruvato di sodio 1.0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM non essenziali aminoacidi, 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Le cellule di HTR-8/SVneo sono state mantenute in RP....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Le linee cellulari immortalizzate trofoblasto di primo-acetonide umano Sw.71 e HTR-8/SVneo sono state utilizzate in questi esperimenti per determinare il ruolo dei glucocorticoidi nel trofoblasto cella migrazione12. I glucocorticoidi sono stati utilizzati in questi esperimenti, come recentemente sono stati indicati per alterare le funzioni del trofoblasto, sebbene trattamenti alternativi potrebbero essere usate12. Entrambe le linee cellulari.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questa procedura si basa sull'uso di migrazione e invasione saggi per includere il tasso di proliferazione delle cellule come un potenziale collaboratore di differenze misurate nel movimento delle cellule di trofoblasto. Utilizzati insieme, questi saggi in vitro sono metodi semplici ed efficaci che possono essere utilizzati per identificare le vie cellulari che regolano la migrazione di trofoblasto. Come descritto in precedenza, le cellule del trofoblasto possono essere trattate con ormoni, citochine, fattori di crescita.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Gil Mor per fornire le cellule di Sw.71. Questa ricerca è stata sostenuta da un Albert McKern Scholar Award a S.W.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,4% Tripano macchia blu | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0,5% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1,0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM aminoacidi non essenziali | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM piruvato di sodio | Life Technologies | 11360-070 | |
| Inserti per pozzetti a piastre a 24 pozzetti | Corning | 3422 | Contengono filtri in policarbonato con un 8 μ m dimensione dei pori |
| Antracite destrino FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Contatore di cellule automatizzato | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Desametasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alfa;-fluoro-16&alfa;-metil-11β, 17, 21-triolo-3, 20-dione; ≥ 98% TLC) | Steraloidi | P0500-000 | |
| DMEM/Ham' s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Siero fetale bovino | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte Piastre ImageLock a 24 pozzetti | Essen BioScience | 4365 | Se si utilizza il sistema di imaging IncuCyte Zoom, seminare le cellule sulle piastre IncuCyte ImageLock. Queste piastre hanno marcatori fiduciali sul fondo della lastra che vengono utilizzati come riferimento per l'imaging ripetuto in un campo visivo costante. |
| Software IncuCyte | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| Sistema IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | N/A | Le immagini del saggio scratch sono state acquisite e analizzate utilizzando il " Ferita da graffio" sul sistema IncuCyte ZOOM. Possono essere utilizzati anche altri microscopi time-lapse. |
| Matrice di membrana Matrigel | Becton Dickinson | 356231 | Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo |
| Micro vetrini | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Vetro di copertura del microscopio | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Microscopio invertito Olympus IX71 | Olympus | IX71 | |
| Penicillina (10.000 unità/mL)/streptomicina (10.000 &; g/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Senza rosso fenolo DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Strumento semiautomatico per la creazione di ferie | Essen BioScience | N/A |
Riferimenti
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
