Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l'analisi di gratta e Vinci, l'analisi di invasione di transwell e l'analisi di proliferazione delle cellule.
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Articolo metodologico
Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast
In questo articolo
Sommario
Abstract
Movimento delle cellule è una proprietà critica di trofoblasto durante lo sviluppo placenta e la gravidanza iniziale. Il significato del trofoblasto corretta migrazione e l'invasione è dimostrato da disturbi di gravidanza come restrizione della crescita intrauterina e di pre-eclampsia, che sono associati con l'invasione del trofoblasto inadeguata del vasculature materno. Purtroppo, la nostra comprensione dei meccanismi da cui la placenta si sviluppa dalla migrazione trofoblasto è limitato. Analisi in vitro di migrazione delle cellule via l'analisi gratta e Vinci sono uno strumento utile nell'identificazione dei fattori che regolano la capacità migratoria trofoblasto. Tuttavia, questo test da solo non definisce i cambiamenti cellulari che possono provocare la migrazione cellulare alterata. Questo protocollo descrive tre diversi saggi in vitro utilizzati collettivamente per valutare il movimento delle cellule di trofoblasto: il dosaggio di gratta e Vinci, l'analisi di invasione e il saggio di proliferazione. I protocolli descritti qui possono essere modificati anche per l'uso in altre linee cellulari per quantificare il movimento cellulare in risposta agli stimoli. Questi metodi consentono ai ricercatori di identificare fattori individuali che contribuiscono al movimento delle cellule e forniscono un esame approfondito dei meccanismi potenziali cambiamenti apparenti nella migrazione cellulare.
Introduzione
Sviluppo placenta è un passo fondamentale nella creazione della gravidanza, un impatto di salute sia materna che fetale. Tuttavia, la base meccanicistica per cui questo processo avviene completamente non è capita. Migrazione delle cellule è un processo biologico importante che contribuisce alla costituzione e funzioni della placenta durante la gravidanza. A seguito dell'impianto di blastocisti, delle cellule trofoblastiche differenzia in trofoblasti villosi, che coprono la superficie dei villi coriali e sono coinvolti in gas e lo scambio di nutrienti, ed extravillous trofoblasto (EVTs), che migrano fuori da villi e invadere la materna decidua e sistema vascolare1. Migrazione del EVTs è essenziale per rimodellamento arterie a spirale materna e circolazione uteroplacentare per supportare la crescita fetale2. Invasione del trofoblasto inadeguata durante la gravidanza provoca lo sviluppo placenta anormale e può contribuire alle complicanze della gravidanza come la preeclampsia, ipertensione gestazionale, restrizione della crescita intrauterina e nascita pretermine3, 4. Di conseguenza, comprensione dei fattori che influiscono sulla motilità di trofoblasto è essenziale per determinare i percorsi necessari per placentazione normale.
Migrazione di trofoblasto è controllata da una complessa rete di molecole, tra cui fattori di crescita, citochine, ormoni e di fattori angiogenici5di segnalazione. A causa delle limitazioni di studiare la placenta in vivo, saggi in vitro utilizzando immortalato delle cellule del trofoblasto umano linee sono stati essenziali per identificare i fattori che contribuiscono alla motilità del trofoblasto. Analisi zero e di invasione sono stati ampiamente utilizzate per valutare quantitativamente il ruolo delle singole molecole il trofoblasto cella migrazione6,7,8. Tuttavia, mentre utile in tandem per indagare come cambiamenti nella migrazione possono essere causati da cambiamenti nell'invasività delle cellule, questi due test non conto di ulteriori meccanismi che possono contribuire a alterato i tassi di migrazione delle cellule. Ad esempio, riduzioni del tasso di proliferazione delle cellule possono provocare meno cellule disponibili per la migrazione.
Qui, descriviamo metodi quantitativi in vitro per la valutazione della migrazione di trofoblasto utilizzando zero, proliferazione delle cellule e le analisi di invasione delle cellule. Nell'analisi della memoria virtuale, una ferita uniforme viene creata in un monostrato di cellule e la migrazione delle cellule per colmare il divario è misurata da formazione immagine automatizzata, time-lapse della dimensione della ferita e densità delle cellule all'interno della ferita. L'analisi di proliferazione delle cellule è basato sul calcolo del rapporto delle cellule in ogni punto di tempo rispetto ad una quantità nota di partenza delle cellule. Nell'analisi di invasione delle cellule, cellule sono seminate in cima a un alloggiamento di inserto della coltura cellulare rivestite con matrice extracellulare (ad es. Transwell) e il numero di cellule che invadono attraverso la matrice extracellulare in risposta alla chemio-attractant è contato.
Il dosaggio zero è uno strumento semplice ed efficace che può essere utilizzato per determinare come le diverse condizioni ambientali influiscono sulla migrazione delle cellule. I saggi di proliferazione ed invasione possono essere utilizzati successivamente per determinare il contributo di proliferazione delle cellule e l'invasività di cambiamenti globali nella migrazione cellulare. Collettivamente, questi saggi forniscono misurazioni robusti dei processi biologici che possono contribuire alla motilità cellulare. Due linee cellulari immortalizzate primo-acetonide trofoblasto sono state utilizzate nelle analisi descritte, Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. Tuttavia, queste analisi possono anche essere ottimizzate per l'utilizzo in altri tipi cellulari per identificare la chiave modulatori della migrazione cellulare e invasione.
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Protocollo
1. cella preparazione
- Mantenere le cellule in boccette di T-75 in media standard crescita a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità.
Nota: Le cellule utilizzate in questi esperimenti erano l'immortalizzate linee cellulari di primo-acetonide trofoblasto Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. Le cellule Sw.71 sono state mantenute in DMEM/F-12 completati con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), piruvato di sodio 1.0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM non essenziali aminoacidi, 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Le cellule di HTR-8/SVneo sono state mantenute in RPMI-1640 supplementato con 5% FBS inattivati. - Permettono alle cellule di replica finché non raggiungono la confluenza di 90-100%. Usando una cappa a flusso sterile di coltura del tessuto, aspirare i media dalle cellule boccetta e lavare con 10 mL di 1x sterile tampone fosfato salino (PBS).
- Aspirare il PBS e aggiungere 5 mL di 1x (0,05%) tripsina-EDTA al pallone, assicurandosi che le cellule siano coperti da tripsina. Immergere la muffola in incubatrice laboratorio mantenuta a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità fino a quando tutte le celle sono staccate dal fondo del matraccio (circa 5-10 min).
- Aggiungere 10 mL di coltura pre-riscaldato al pallone per disattivare la tripsina-EDTA.
2. analisi della graffiatura
- Seguendo passo 1.4, seme il numero appropriato di cellule in una piastra a 24 pozzetti per raggiungere 100% confluenza in 48h.
Nota: È possibile eseguire l'analisi di gratta e Vinci con una varietà di layout piatto diverso. Il numero massimo di pozzi ammessi dallo strumento creatore di ferita è un formato a 96 pozzetti. - Il giorno successivo (giorno prima del dosaggio zero), cambiare il supporto per supporti liberi rosso fenolo completati come richiesto, tra cui FBS destrano-spogliato inattivati, carboncino.
Nota: Altri studi hanno segnalato l'uso dei media con bassa concentrazione FBS (ad es., 1%) per ridurre al minimo la proliferazione delle cellule, che può essere utilizzata come un'alternativa a questo protocollo11. - Il giorno del test gratta e Vinci, pretrattare le cellule per 30 min con l'aggiunta di trattamento desiderato ai media in ciascun pozzetto. Gli esperimenti di profilati utilizzati veicolo (1x PBS) e 100 nM desametasone, diluito in 1X PBS.
-
Per creare ferite uniforme, inserire Puntali sterili 10 µ l sui perni dell'attrezzo del creatore di ferita. Abbassare le punte in prima fila di pozzetti e muovere la piastra lungo la pista del creatore della ferita fino a quando i puntali per raggiungono l'altro lato del pozzo.
- Spostare la piastra torna alla posizione di partenza, consentendo i puntali toccare continuamente il fondo del piatto per garantire una costante della ferita attraverso il diametro del pozzo. Rimuovere e sostituire i puntali sterili a 10 µ l e abbassare le punte nella riga successiva di pozzi.
- Ripetere il passaggio 2.4 fino a quando tutti i pozzetti sono graffiati.
Nota: Se un ferita maker strumento non è disponibile, ferite possono essere create raschiando manualmente il centro dei pozzi con una punta di pipetta 10 µ l. - Media di aspirare accuratamente e lavare delicatamente le cellule due volte con PBS 1x 1. Dopo un lavaggio finale, aggiungere completato rosso fenolo libero, spogliato o basso-FBS supporti con trattamento desiderato o il veicolo (come indicato al punto 2.3).
Nota: HTR-8/SVneo cellule devono essere lavate con media di rosso fenolo completati, come lavaggio con 1x PBS causerà cellule staccare. - Posizionare la piastra di 24 pozzetti contenenti graffiati pozzi nell'automatizzato, time-lapse imager (Vedi Tabella materiali) ospitato in un incubatore da laboratorio mantenuto a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità. Immagine pozzi a intervalli regolari, come necessario per consentire alle cellule di completare la guarigione delle ferite (ad es., ogni 2 h per 72 h).
- Calcolare la densità della ferita e la larghezza dal software associato con il dispositivo di imaging automatizzato, time-lapse (Vedi Tabella materiali). Per calcolare la variazione percentuale della ferita dimensione rispetto alla dimensione della ferita iniziale, impostare la larghezza della ferita al tempo 0 pari al 100%. Dividere la dimensione della ferita in ogni timepoint successivo dalle dimensioni della ferita al tempo 0 e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale (Figura 1).
3. analisi invasione
- Seguente passaggio 1.4, seme il numero appropriato di cellule in piastre da 6 pozzetti per consentire alle cellule di raggiungere 90% confluenza in 48 h. mantenere le cellule in un incubatore da laboratorio impostato a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità.
- Il giorno successivo, cambiare supporto per supporti liberi rosso fenolo completati come richiesto, tra cui FBS destrano-spogliato inattivati, carboncino.
Nota: Le cellule possono essere pretrattate in questo momento a seconda del disegno sperimentale. - A questo punto, posizionare la cuvetta della matrice extracellulare 10 mg/mL (Vedi Tabella materiali) sul ghiaccio e lasciarlo scongelare in frigorifero durante la notte.
- Il giorno successivo, l'analisi pre-cool invasione forniture inserendo piastre da 24 pozzetti, inserti in coltura cellulare, per microcentrifuga e puntali in frigorifero (4 ° C) per almeno 2 h prima di lavorare con la matrice extracellulare.
- Utilizzando forniture refrigerati nella coltura del tessuto cappa, matrice extracellulare di 10 mg/mL diluito 1:1 con fenolo-rosso-libero, privo di siero media ad una concentrazione finale di 5 mg/mL.
Nota: Tenere sempre il brodo e la matrice extracellulare diluita sul ghiaccio. Il rapporto della matrice extracellulare ai media può essere regolato basato sulle proprietà della linea cellulare usato nell'analisi. - Utilizzando forniture refrigerati nella coltura del tessuto cappa, aggiungere 100 μL di matrice extracellulare diluita agli inserti (Vedi Tabella materiali) che sono stati inseriti nella piastra 24 pozzetti. Assicurarsi che la matrice sia livello senza eventuali bolle. Posizionare la piastra di 24 pozzetti contenenti inserti con rivestimento matrice nell'incubatore a 37 ° C per permettere la matrice indurire.
- Per preparare le celle per analisi di invasione, lavare le cellule con 1 mL di PBS 1X, aspirare il PBS e aggiungere 500 µ l di tripsina EDTA 1x in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore laboratorio mantenuta a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità fino a quando tutte le celle sono staccate dal fondo della piastra.
- Una volta che le cellule hanno staccato, aggiungere 500 µ l di fenolo-rosso-libero, privo di siero media ad ogni pozzetto delle cellule trypsinized.
- Trasferire 1.000 µ l di cellule indipendente per microcentrifuga e centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 ° C.
- Media di aspirare e risospendere le cellule in media fenolo-rosso-libero, privo di siero (volume dipenderà concentrazione delle cellule). Numero di celle utilizzando una cella automatizzata counter (Vedi Tabella materiali) e regola il volume della sospensione cellulare per una concentrazione finale di 5 x 105 cellule per mL.
Nota: Un emocitometro e microscopio possono anche essere utilizzati per contare le celle. - Aggiungere 600 µ l di media crescita completa dei pozzetti della piastra 24 pozzetti che verrà utilizzato per l'analisi di invasione.
Nota: Ulteriori chemioattrattanti o trattamenti possono aggiungersi al medium di crescita completa nel pozzo (camera bassa). Gli esperimenti delineati aggiunto veicolo (1x PBS) o 100 nM desametasone, diluito in 1X PBS per la camera bassa. - Posto il prepatinato inserire in ciascun pozzetto contenente mezzo di sviluppo completo che verrà utilizzato per l'analisi di invasione. Quindi aggiungere 200 μL di celle nella parte superiore di ogni inserto di cella prepatinato (camera superiore) per un totale di 1 x 105 celle.
Nota: Come controllo negativo per questo test, un volume uguale di fenolo-rosso-libero, privo di siero media (senza cellule) possa essere aggiunti alla camera superiore. - Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore laboratorio mantenuta a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità per 24 h.
Nota: Il periodo di incubazione di 24 ore è stato ottimizzato per le cellule immortalizzate primo-acetonide trofoblasto e possono essere necessari ulteriori test per determinare il periodo di incubazione richiesto in altre linee cellulari. - A seguito di incubazione overnight, aspirazione media rimanenti dalla camera superiore e inferiore senza disturbare la matrice extracellulare. Quindi, rimuovere attentamente la matrice extracellulare e le cellule non invaso dalla parte superiore dell'inserto con un tampone di cotone, tamponi tante volte quanto necessario per rimuovere la matrice extracellulare.
- Lavare ogni inserire 3 volte con PBS 1X, aggiungendo PBS agli alloggiamenti superiori e inferiori del pozzo. Aspirare il PBS dopo ogni lavaggio.
- Difficoltà cellule allegate agli inserti inserendo inserti in 100% di metanolo ghiacciato per 30 min a 4 ° C. Lavare inserisce 3x con 1x PBS e Rimuovi PBS dopo la finale di lavaggio. Macchia le cellule allegate agli inserti per 10 min con cristalvioletto 0,2% in etanolo al 20%.
- Lavare 3 volte con acqua deionizzata e aspirare acqua deionizzata dopo il lavaggio finale.
- Asciugare all'aria inserti per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzo di pinze e una lama di rasoio, tagliare con cura la membrana inferiore dell'inserto e montare su un vetrino con il lato inferiore rivolto verso l'alto. Consentire mezzi di montaggio asciugare a temperatura ambiente.
- Ottenere almeno 4 immagini uniche dell'invase cellule per esempio utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo 20x. Contare il numero totale delle cellule in ogni immagine e normalizzare il numero delle cellule di campioni di controllo e tracciare i dati (Figura 2).
4. proliferazione Assay
- Seguente passaggio 1.4, contare le cellule tripsinizzate dalla beuta utilizzando un contatore di cellule automatizzati e semi in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 105 cellule per pozzetto in mezzi standard di sviluppo.
- Cellule di posizione in un incubatore da laboratorio mantenuta a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità per 4 h o fino a quando le cellule hanno aderito.
- Media di cambiamento al fenolo rosso tra cui FBS destrano-spogliato inattivati, carboncino completati come richiesto, i media liberi e aggiunta il trattamento desiderato. Gli esperimenti delineati aggiunto veicolo (1x PBS) o 100 nM desametasone, diluito in 1X PBS. Posizionare le piastre 6 pozzetti in un incubatore da laboratorio mantenuto a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità.
- Rimuovere i supporti e sostituire con trattamento e nuovi media ogni 48 h.
- Dopo 24, 48 o 72 h trattamento, lavare le cellule con 1 mL di 1X PBS e aggiungere 500 µ l di tripsina-EDTA in ciascun pozzetto. Posto 6 pozzetti in incubatrice fino a quando le cellule hanno staccato dalla piastra.
- Una volta che le cellule hanno staccata dalla piastra, aggiungere 500 µ l dei mezzi di comunicazione gratuito completati di rosso fenolo per disattivare tripsina.
- Aggiungere 5 µ l di cellule tripsinizzate a 5 µ l di tripan blu in un tubo separato e Miscelare pipettando.
- Contare le celle da ogni pozzetto in duplice copia utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
- Il numero medio di cellule per pozzetto ad ogni punto nel tempo e la trama come funzione del tempo (Figura 3).
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Risultati
Le linee cellulari immortalizzate trofoblasto di primo-acetonide umano Sw.71 e HTR-8/SVneo sono state utilizzate in questi esperimenti per determinare il ruolo dei glucocorticoidi nel trofoblasto cella migrazione12. I glucocorticoidi sono stati utilizzati in questi esperimenti, come recentemente sono stati indicati per alterare le funzioni del trofoblasto, sebbene trattamenti alternativi potrebbero essere usate12. Entrambe le linee cellulari...
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Discussione
Questa procedura si basa sull'uso di migrazione e invasione saggi per includere il tasso di proliferazione delle cellule come un potenziale collaboratore di differenze misurate nel movimento delle cellule di trofoblasto. Utilizzati insieme, questi saggi in vitro sono metodi semplici ed efficaci che possono essere utilizzati per identificare le vie cellulari che regolano la migrazione di trofoblasto. Come descritto in precedenza, le cellule del trofoblasto possono essere trattate con ormoni, citochine, fattori di crescita...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Gil Mor per fornire le cellule di Sw.71. Questa ricerca è stata sostenuta da un Albert McKern Scholar Award a S.W.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,4% Tripano macchia blu | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0,5% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1,0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM aminoacidi non essenziali | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM piruvato di sodio | Life Technologies | 11360-070 | |
| Inserti per pozzetti a piastre a 24 pozzetti | Corning | 3422 | Contengono filtri in policarbonato con un 8 μ m dimensione dei pori |
| Antracite destrino FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Contatore di cellule automatizzato | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Desametasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alfa;-fluoro-16&alfa;-metil-11β, 17, 21-triolo-3, 20-dione; ≥ 98% TLC) | Steraloidi | P0500-000 | |
| DMEM/Ham' s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Siero fetale bovino | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte Piastre ImageLock a 24 pozzetti | Essen BioScience | 4365 | Se si utilizza il sistema di imaging IncuCyte Zoom, seminare le cellule sulle piastre IncuCyte ImageLock. Queste piastre hanno marcatori fiduciali sul fondo della lastra che vengono utilizzati come riferimento per l'imaging ripetuto in un campo visivo costante. |
| Software IncuCyte | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| Sistema IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | N/A | Le immagini del saggio scratch sono state acquisite e analizzate utilizzando il " Ferita da graffio" sul sistema IncuCyte ZOOM. Possono essere utilizzati anche altri microscopi time-lapse. |
| Matrice di membrana Matrigel | Becton Dickinson | 356231 | Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo |
| Micro vetrini | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Vetro di copertura del microscopio | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Microscopio invertito Olympus IX71 | Olympus | IX71 | |
| Penicillina (10.000 unità/mL)/streptomicina (10.000 &; g/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Senza rosso fenolo DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Strumento semiautomatico per la creazione di ferie | Essen BioScience | N/A |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
