In genere, il modello di iniezione del collo del mouse viene utilizzato per valutare i comportamenti scratch indotti da pruritogen. Tuttavia, il modello fornisce informazioni solo sul prurito, non sul dolore. Qui, un modello di iniezione guancia viene introdotto nei topi che può essere utilizzato per misurare contemporaneamente il dolore e i comportamenti legati al prurito.
Articolo metodologico
Modello di iniezione guancia per la misurazione simultanea del dolore e dei comportamenti correlati all'itch
In questo articolo
Sommario
Abstract
Itch è stato definito come "una spiacevole sensazione cutanea che provoca il desiderio di graffiare" da Rothman nel 1941. Nei modelli murini, gli inchiostri di graffio sono in genere conteggiati per valutare il prurito indotto dai pruritogeni. Tuttavia, rapporti precedenti hanno dimostrato che le sostanze algesiche inducono anche comportamenti graffianti in un modello di iniezione del collo del mouse, che è il test più comune utilizzato per i comportamenti di graffio. Questa scoperta rende difficile studiare il prurito nei topi. Al contrario, capsaicina, un algogen comune, ridotto comportamenti graffianti in alcuni esperimenti di iniezione del collo. Pertanto, l'effetto del dolore sui comportamenti di graffi ompocoscicamento rimane poco chiaro. È quindi necessario sviluppare un metodo per studiare contemporaneamente prurito e sensazione di dolore utilizzando test comportamentali. Qui, viene introdotto un modello di iniezione delle guance che può essere utilizzato per misurare contemporaneamente i comportamenti legati al dolore e al prurito. In questo modello, i pruritogeni inducono comportamenti di graffio mentre le sostanze algesiche inducono comportamenti di pulizia. Utilizzando questo modello, l'acido lisofofhatico (LPA), un mediatore prurito trovato in pazienti colestatici con prurito, è indicato per indurre esclusivamente prurito, ma non dolore. Tuttavia, nei modelli murini, LPA è stato segnalato per essere sia un pruritogeno e un algono. L'analisi degli effetti del LPA in un modello di iniezione delle guance del topo ha mostrato che l'LPA ha indotto solo i graffi, ma non i comportamenti di pulizia. Ciò indica che LPA agisce come un pruritogeno allo stesso modo nei topi e negli esseri umani, e dimostra l'utilità di un modello di iniezione guancia per la ricerca prurito.
Introduzione
Itch è stato originariamente caratterizzato come una sensazione che induce comportamenti graffianti per rimuovere i materiali nocivi dalla superficie della pelle. Tuttavia, il prurito è stato al centro delle terapie per sensazioni spiacevoli causate da molte malattie come dermatite atopica, lesioni neurogeniche e colestasi1. In questi casi, il prurito è una grave sensazione spiacevole simile al dolore. Pertanto, il prurito rappresenta un importante obiettivo di ricerca. Il comportamento di graffio è l'indicatore primario del prurito negli esperimenti sugli animali, e i comportamenti di graffio possono essere indotti nei topi iniettando pruritogeni nella pelle sul collo2,3. Tuttavia, uno studio precedente ha dimostrato che la capsaicina, un algogeno, induce anche comportamenti graffianti in un modello di iniezione del collo4, rendendo difficile discriminare il prurito dal dolore in questo modello. Al contrario, è stato trovato che la capsaicina riduceva i comportamenti di graffio in un modello di iniezione del collo, indicando che l'effetto del dolore sui comportamenti graffianti è complicato e dipende dalle condizioni sperimentali. Pertanto, misurazioni simultanee del dolore e dei comportamenti correlati al prurito consentirebbero l'analisi precisa di pruritogeni e algogeni. Steven G. Shimada e Robert H. LaMotte sono riusciti a misurazioni simultanee del dolore e dei comportamenti legati al prurito cambiando il sito di iniezione dal collo alla guancia4. Nel modello di iniezione delle guance, la capsaicina ha indotto la pulizia, ma non i comportamenti graffianti, mentre l'istamina, un pruritogeno, solo comportamenti graffianti indotti. Pertanto, questo modello consente la valutazione indipendente del prurito e del dolore, rendendo l'iniezione delle guance un modello utile per la ricerca sul prurito. Quando si cerca di determinare se una sostanza di prova è un pruritogeno e/o un algogeno, questo modello fornisce più informazioni rispetto al modello di iniezione del collo. Questo articolo descrive un metodo pratico per eseguire l'iniezione delle guance e contare gli inchiostri di graffio o pulizia e mostra l'utilità di questo metodo per la valutazione dei comportamenti di graffio indotti dall'acido lisofofatico (LPA).
Protocollo
Tutte le procedure relative alla cura e all'uso degli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di scienze naturali (16A074) e sono svolte in conformità con le linee guida dell'Istituto nazionale per la cura degli animali e sono svolte in conformità con le linee guida dell'Istituto nazionale per la cura degli animali per Scienze fisiologiche.
NOT: Il protocollo originale è stato riportato da Steven G. Shimada e Robert H. LaMotte4,e la presente relazione descrive questi metodi con diverse modifiche, tra cui l'aggiunta di uno schermo per impedire agli animali di vedersi, l'assenza di un il numero di topi per registrazione, sforzo del mouse, dimensioni della gabbia e tempo di registrazione.
1. Modello di iniezione guancia
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Preparazione dell'esperimento
- gabbia
- Impostare quattro gabbie sotto una telecamera come illustrato nella Figura 1. Impostare uno schermo per impedire ai topi di vedersi. Mettere in ogni mouse per ogni gabbia e impostare un coperchio acrilico per evitare la fuga dei topi. Si noti che le registrazioni devono essere eseguite in un ambiente in cui la temperatura, l'umidità e il suono sono controllati.
NOT: I comportamenti possono anche essere registrati senza coperchio se la gabbia è sufficientemente alta.
- Impostare quattro gabbie sotto una telecamera come illustrato nella Figura 1. Impostare uno schermo per impedire ai topi di vedersi. Mettere in ogni mouse per ogni gabbia e impostare un coperchio acrilico per evitare la fuga dei topi. Si noti che le registrazioni devono essere eseguite in un ambiente in cui la temperatura, l'umidità e il suono sono controllati.
- Ago e siringa
- Utilizzare un ago da 29 G o 30 G attaccato a una siringa da 0,5 mL per l'iniezione di sostanze di prova. Se la soluzione della sostanza di prova è altamente viscosa, sono necessari aghi più grandi. Tuttavia, si prega di notare che i grandi aghi pongono ulteriori effetti collaterali fisici.
NOT: È possibile utilizzare un ago collegato a una siringa con un tubo di polietilene.
- Utilizzare un ago da 29 G o 30 G attaccato a una siringa da 0,5 mL per l'iniezione di sostanze di prova. Se la soluzione della sostanza di prova è altamente viscosa, sono necessari aghi più grandi. Tuttavia, si prega di notare che i grandi aghi pongono ulteriori effetti collaterali fisici.
- videocamera
- Utilizzate una videocamera con frequenze fotogrammi sufficientemente grandi (30-60 fotogrammi/s) con una risoluzione relativamente elevata per la misurazione degli inchiostri e dei comportamenti di cancellazione.
- Software per l'analisi video
- Utilizzare un software di editing video per la riproduzione e l'analisi video. Si noti che per un'analisi precisa sono necessarie una modalità di avanzamento rapido e una modalità di riproduzione fotogramma per fotogramma.
- gabbia
Figura 1: Configurazione della videocamera e della gabbia. Vengono utilizzate quattro gabbie acriliche con coperchi acrilici, per prevenire la fuoriuscita dei topi e uno schermo per prevenire il prurito contagioso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Iniezione e registrazione
- Un giorno prima dell'esperimento, rasa la pelliccia sulla guancia del topo con i tagliacapelli (Film 1). Prima della rasatura, non trattenere i topi.
NOT: I topi CD-1 o C57BL/6 sono stati utilizzati principalmente in questo modello4,5. In questo articolo, sono stati utilizzati topi C57BL/6N di sesso maschile di 6-12 settimane. Si noti che la sensibilità alle sostanze chimiche potrebbe essere diversa tra i vari ceppi del mouse3,6,7. - Un giorno dopo la rasatura, spostare il mouse nella gabbia di registrazione per 1 h per acclimatarlo alle condizioni di registrazione. Se viene utilizzata un'applicazione topica, applicarla durante questo periodo di acclimatazione.
NOT: In questo rapporto, 10 - L del 2% (w/v) difenidrossimina sale cloridrato in salina è stato applicato topicamente 30 minuti prima della registrazione. - Impostare una videocamera sopra la gabbia e avviare la registrazione video prima dell'iniezione di sostanze di prova. Iniettare una soluzione di 10 L della sostanza di prova intradermente nella guancia rasata in condizioni di veglia (Film 2). Dopo l'iniezione, riportare il mouse nella gabbia di registrazione.
NOT: In questo rapporto, sono stati utilizzati come sostanze di prova 50 g/10 di istamina, 40 g/10 l di capsaicina o veicolo (7% tween 80 in salina). - Chiudere il coperchio della gabbia e continuare la registrazione video per 30 min.
NOT: Il tempo di registrazione totale dipenderà dalle condizioni sperimentali.
- Un giorno prima dell'esperimento, rasa la pelliccia sulla guancia del topo con i tagliacapelli (Film 1). Prima della rasatura, non trattenere i topi.
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Analisi comportamentale
- Contare gli inchiostri di graffio e i comportamenti di cancellazione, rispettivamente. I topi alzano una gamba posteriore verso la guancia e graffiano più volte in uno o pochi secondi, quindi mettono giù la gamba. Questa serie di azioni viene conteggiata come un incontro di graffio. Lo scratching di altre aree non deve essere conteggiato. I topi usano un singolo prua per pulire ed entrambe le zampe anteriori per la toelettatura. Queste azioni dovrebbero essere distinte. Solo i comportamenti di pulizia vengono conteggiati come comportamenti correlati al dolore.
NOT: Ogni azione è illustrata nelle figure 2, Movie 3, Movie 4e Movie 5.
- Contare gli inchiostri di graffio e i comportamenti di cancellazione, rispettivamente. I topi alzano una gamba posteriore verso la guancia e graffiano più volte in uno o pochi secondi, quindi mettono giù la gamba. Questa serie di azioni viene conteggiata come un incontro di graffio. Lo scratching di altre aree non deve essere conteggiato. I topi usano un singolo prua per pulire ed entrambe le zampe anteriori per la toelettatura. Queste azioni dovrebbero essere distinte. Solo i comportamenti di pulizia vengono conteggiati come comportamenti correlati al dolore.
Figura 2: Attività tipica del mouse durante la registrazione. I pannelli A-C sono illustrazioni che rappresentano il comportamento di cancellazione con la zampa anteriore corretta (A), il comportamento di graffio con la zampa posteriore destra (B) e il comportamento di toelettatura con entrambe le zampe anteriori (C). I topi alzano una gamba posteriore verso la guancia e graffiano più volte in uno o pochi secondi, quindi mettono giù quella gamba. Questa serie di azioni viene conteggiata come un incontro di graffio. Lo scratching di altre aree non deve essere conteggiato. I topi usano un singolo prua per pulire ed entrambe le zampe anteriori per la toelettatura. Queste azioni dovrebbero essere distinte. Solo i comportamenti di pulizia vengono conteggiati come comportamenti correlati al dolore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Modello di iniezione del collo
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Iniezione e registrazione
- Un giorno prima dell'esperimento, rasa la pelliccia sulla nuca del topo con i tagliacapelli dopo circa il 5% di inalazione di isoflurane per 2-3 minuti.
- Un giorno dopo la rasatura, spostare il mouse nella gabbia di registrazione per 1 h per acclimatarlo alle condizioni di registrazione.
- Impostare una videocamera sopra la gabbia (Figura 1) e avviare la registrazione video prima dell'iniezione di sostanze di prova. Iniettare una soluzione di 10 L della sostanza di prova intradermente nel collo rasato in condizioni di veglia. Dopo l'iniezione, riportare il mouse nella gabbia di registrazione.
NOT: In questo articolo sono stati utilizzati come sostanze di prova 50 g/10 g di istamina, 10 g/10 o 40 g/10 di capsaicina o veicolo (7% tween 80 in salina). - Chiudere il coperchio della gabbia e continuare la registrazione video per 30 min.
NOT: Il tempo totale di registrazione dipenderà dalle condizioni sperimentali.
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Analisi comportamentale
- Contare i comportamenti di scratch bout. I topi alzano una gamba posteriore verso il collo e si grattano più volte in uno o pochi secondi, quindi mettono giù quella gamba. Questa serie di azioni viene conteggiata come un incontro di graffio. Lo scratching di altre aree non deve essere conteggiato.
NOT: L'azione di graffio è simile a quella nel modello di iniezione guancia, tranne che la posizione del graffio viene spostata al collo.
- Contare i comportamenti di scratch bout. I topi alzano una gamba posteriore verso il collo e si grattano più volte in uno o pochi secondi, quindi mettono giù quella gamba. Questa serie di azioni viene conteggiata come un incontro di graffio. Lo scratching di altre aree non deve essere conteggiato.
Risultati
Nel modello di iniezione del collo, l'istamina ha indotto forti comportamenti graffianti (Figura 3). Veicolo (7% tween 80 in salina) anche comportamenti graffianti indotti. Una relazione precedente ha mostrato che il prurito indotto dal detersivo per produzione di istamina da cheratinociti8. Tween 80 potrebbe indurre prurito con meccanismi simili, mentre la capsaicina ha ridotto i comportamenti di graffio indotti dai veicoli, contrariamente a una precedente relazione4. È possibile che le differenze di deformazione del mouse possano spiegare questi diversi risultati. Questi risultati indicano che l'effetto del dolore sui comportamenti di graffiè è complicato. Pertanto, la misurazione simultanea del dolore e dei comportamenti correlati al prurito può consentire l'analisi precisa di pruritogeni e algogeni. Nel modello di iniezione delle guance, la capsaicina non ha indotto comportamenti di graffio e solo comportamenti di pulizia indotti, che si pensa siano correlati al dolore9,10,11 ( Figura4). Iniezione di capsaicina anche aumentato i comportamenti di toelettatura (dati non mostrati). Dopo l'iniezione nella guancia, l'istamina ha indotto principalmente comportamenti graffianti con comportamenti di pulizia deboli. L'applicazione di un reagente anti-istamina, difenirammina, graffi inibito. Questo risultato suggerisce che i comportamenti di graffio indotti dall'istamina sono causati dall'azione dell'istamina sui recettori dell'istamina. Qui, ad esempio, gli effetti di LPA nel modello di iniezione guancia sono mostrati (Figura 5). LPA è un mediatore prurito trovato in pazienti collestatici con prurito. Tuttavia, nei modelli murini, LPA è stato segnalato sia come pruritogeno che come algogen12,13,14,15. Pertanto, gli effetti di LPA sono stati studiati in un modello di iniezione delle guance e i risultati hanno mostrato che l'LPA ha indotto graffi, ma non asciuga i comportamenti. Ciò indica che LPA è un pruritogeno, ma non un algogeno, nei topi simili ai suoi effetti negli esseri umani.
Figura 3: Effetti dell'istamina e della capsaicina nel modello di iniezione del collo. (A) Comportamenti di graffio indotti dall'iniezione del veicolo (7% tween 80 in salina, quadrato aperto), istamina (50g/10 l per sito, cerchi pieni) o capsaicina ( 10 g/10 l- l per sito, triangolo aperto; Nel collo sono stati valutati ogni 5 min per un totale di 30 min. (B) Analisi quantitativa dei comportamenti graffianti durante il periodo di 30 min nel pannello A. correzione. I dati sono indicati come media : SEM (n - 6-8). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti di un pruritogeno e di un algono nel modello di iniezione delle guance. I comportamenti di pulizia (A) e graffi (B) indotti mediante iniezione di veicolo (7% tween 80 in salina, quadrato aperto), istamina (50 g/10 llà per sito, cerchi riempiti) o capsaicina (40 g/10 -L per sito, triangolo pieno) nella guancia destra dei topi erano valutazione ogni 5 min per un totale di 30 min. Il gruppo è stato trattato come cerchi aperti con 10 -L del 2% (w/v) diphenhydramine hydrochloride Salt (DHHCL) percutaneamente 30 min prima dell'iniezione di istamina (50g/10 L per sito). DHHCl è stato sciolto in salina. Analisi quantitativa dei comportamenti di cancellazione (C) e graffi (D) durante il periodo di 30 min nei pannelli A e B; n - 8 animali per gruppo. P < 0,05,P < 0,01 di ANOVA seguito dalla correzione Bonferroni. I dati sono mostrati come la media : SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: LPA induce graffi, ma non si puliscono i comportamenti nel modello di iniezione delle guance. I comportamenti di graffio (A) e pulizia (B) indotti per iniezione di veicoli (salini, quadrati aperti) o LPA (100 nmol/10 L per sito, cerchi pieni) nella guancia destra dei topi sono stati valutati ogni 5 min per un totale di 30 min. Analisi quantitativa quantitativa graffi (C) e cancellazione (D) durante il periodo di 30 min nei pannelli A e B; n 17 per il veicolo e n 20 per l'LPA. P < 0,05,P < 0,01 dal test t di Welch. I dati vengono visualizzati come media : SEM. Questa cifra è stata modificata da Kittaka et al.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1: Film che dimostra come radere una guancia del mouse. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Film 2: Film che dimostra l'iniezione nella guancia del mouse. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Filmato 3: Film che illustra il tipico comportamento di cancellazione. Questo filmato viene mostrato a una velocità del 25%. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Filmato 4: Filmato del tipico comportamento graffiante. Si prega di fare clic qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Film 5: Filmato del tipico comportamento di toelettatura. Questo filmato viene mostrato a una velocità del 25%. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Discussione
In questo articolo, viene introdotto un modello di iniezione delle guance che si dimostra utile per l'analisi dei comportamenti legati al dolore e al prurito.
Un rapporto precedente ha mostrato che le sostanze algesiche inducono comportamenti di graffiino in un modello di iniezione del collo del topo4. Al contrario, la capsaicina ha ridotto i comportamenti dei graffi in altri esperimenti di iniezione del collo (Figura 3). Pertanto, l'effetto del dolore sul comportamento di graffi rimane poco chiaro. È quindi necessario sviluppare un metodo per indagare contemporaneamente il dolore e il prurito attraverso test comportamentali. Utilizzando un modello di iniezione delle guance, l'effetto di una sostanza sia sul dolore che sul prurito può essere valutato.
In precedenza è stato segnalato che LPA intracellulare attiva direttamente TRPV1 e TRPA1 come meccanismo di prurito indotta da LPA5. Di conseguenza, il prurito indotto da LPA potrebbe essere indipendente dall'istamina. Uno studio precedente ha anche dimostrato che un modello di iniezione delle guance può essere utilizzato per la valutazione del prurito16indipendente dall'istamina. Pertanto, questo modello può essere utilizzato sia per il prurito dipendente dall'istamina che per il prurito indipendente dall'istamina.
Uno dei passaggi critici in questo esperimento è l'iniezione. Poiché si tratta di un test comportamentale acuto, l'anestesia non può essere utilizzata nella fase di iniezione in quanto potrebbe influenzare questi comportamenti. Pertanto, il mouse deve essere tenuto in modo sicuro al fine di eseguire un'iniezione precisa. Quando la presa sull'animale non è sicura, soprattutto quando si iniettano algogeni forti, i topi possono lottare, portando ad un volume di iniezione impreciso e profondità, seguita da difficoltà nell'interpretare i risultati. Quando si maneggia un mouse, tirare la pelle sulla nuca tra il pollice e l'indice per inibire il movimento del mouse.
Un altro passo critico è l'analisi comportamentale. Poiché graffiare è molto rapido, il video deve essere guardato con attenzione. Inoltre, la pulizia può essere difficile da distinguere dal toelettatura. Pertanto, l'uso di sostanze chimiche di controllo positivo come la capsaicina è raccomandato durante il primo esperimento. Le condizioni di registrazione e riproduzione possono anche influire sul conteggio di entrambi i comportamenti. Se è difficile osservare chiaramente i comportamenti, gli specchi possono essere utilizzati intorno alle gabbie per migliorare gli angoli di visione4.
Va notato che il modello di iniezione delle guance può mostrare una ridotta precisione quantitativa per le sostanze chimiche testate rispetto al modello di iniezione del collo. Come illustrato nella Figura 3 e Figura 4, la stessa quantità di istamina ha indotto più comportamenti graffianti nel modello del collo rispetto al modello guanciale e ha mostrato variazioni minori nel modello di iniezione del collo. Una volta che una sostanza testata ha dimostrato di essere un pruritogeno con bassi effetti algesici con il modello di iniezione delle guance, il modello di iniezione del collo è raccomandato per un'ulteriore analisi quantitativa. Anche con queste limitazioni, il modello di iniezione delle guance è utile per la valutazione precisa delle sostanze di prova, soprattutto nel campo della ricerca prurito.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati ai dottori Steven G. Shimada e Robert H. LaMotte (Yale University School of Medicine, Connecticut) dai cui metodi (riferimento 4) questa tecnica è stata adattata. Ringraziamo anche il signor Kentaro Miyahara per aver creato le illustrazioni del topo. Questo studio è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica dal Ministero dell'Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia in Giappone (N. 15H02501 e 15H05928 a M.T., e dal numero 16K21691 a Hong Kong) e dalla Uehara Memorial Foundation (a Hong Kong). Apprezziamo l'introduzione del metodo di iniezione delle guance da parte del professor LaMotte all'Università di Yale.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Capsaicina | Sigma | M2028 | |
| Difenidramina cloridrato | Wako | 044-19772 | |
| Istamina | Sigma | H7125 | |
| iMovie | Mela | ||
| Acido lisofosfatidico | Avanti Lipidi polari | 325465-93-8 | |
| Myjector | Terumo | ss-05M2913 | |
| Tween-80 | Sigma | P4780 | |
| Videocamera | Panasonic | VX985M |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
