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Articolo metodologico

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

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DOI:

10.3791/58952

12 febbraio 2019

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per un metodo generale di pulse-chase che permette l'analisi cinetica di pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine da seguire in cellule vive.

Abstract

Impulso-insegua radioattivo etichettatura è un potente strumento per lo studio della maturazione conformazionale, il trasporto a loro posizione cellulare funzionale e la degradazione di proteine in cellule vive. Utilizzando radiolabeling tempi brevi (impulso) (< 30 min) e strettamente controllato chase volte, è possibile aggiungere etichette solo una piccola frazione della piscina della proteina totale e seguire sua pieghevole. Quando combinato con non riducente/riducendo l'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e immunoprecipitazione con anticorpi (conformazione-specifici), processi di piegatura può essere esaminato in dettaglio. Questo sistema è stato utilizzato per analizzare il ripiegamento di proteine con una variazione enorme in proprietà quali proteine solubili, proteine transmembrana singole e multi-pass, pesantemente N - e O-glicosil proteine e proteine con e senza bisolfuro di vasto incollaggio. Impulso-insegua metodi sono alla base di studi cinetici in una gamma di funzionalità aggiuntive, tra cui co - e modifiche di posttranslational, oligomerizzazione e polimerizzazione, essenzialmente che consente l'analisi di una proteina dalla nascita alla morte. Impulso-Insegua gli studi sul folding delle proteine sono complementari con altri metodi biochimici e biofisici per lo studio delle proteine in vitro , fornendo una maggiore risoluzione temporale e informazioni fisiologiche. I metodi come descritto all'interno di questa carta sono adattati facilmente per studiare la piegatura di quasi tutta la proteina che può essere espressa nei sistemi mammiferi o insetto-cella.

Introduzione

La piegatura delle anche relativamente semplice proteine coinvolge molti diversi enzimi pieghevoli, chaperoni molecolari e modificazioni covalenti1. Una ricostituzione completa di questi processi in vitro è praticamente impossibile, dato il vasto numero di differenti componenti coinvolti. È altamente auspicabile, pertanto, per studiare il folding delle proteine in vivo, in cellule vive. Impulso-insegua radioattivo tecniche rivelarsi uno strumento potente per studiare la sintesi, pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine nel loro ambiente naturale.

Il metabolica etichettatura delle proteine....

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Protocollo

Tutti i reagenti radioattivi ed erano gestite conformemente alle norme e regolamenti di radiazione locali Università di Utrecht.

1. pulse Chase

  1. Inseguimento di impulso per le cellule aderenti
    Nota: I volumi qui riportati sono basati su piastre di coltura cellulare di 60 mm. Per piatti di 100 mm o 35 mm, moltiplicare i volumi da 1/2 o 2, rispettivamente. Questo protocollo utilizza un tempo di impulso di 10 min e chase volte di 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Questi può essere variati a seconda le proteine specifiche in fase di studio (discusse sotto).
    1. Semi di cellule aderenti (ad es., HEK 293, He....

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Risultati

La piegatura e la secrezione di gp120 di HIV-1 da un inseguimento di impulso aderente è illustrato nella Figura 2. Il gel non riducente (cellule NR nella figura) viene illustrato il folding ossidativo di gp120. Immediatamente dopo l'impulso di etichettatura di gp120 5 min (0 min chase) appare come una banda diffusa superiore nel gel, e col progredire della chase, la band migra verso il basso il gel attraverso ancora più diffusa pieghevole intermedi (IT) fino .......

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Discussione

Impulso-insegua metodi sono stati essenziali per sviluppare la comprensione degli scienziati del ripiegamento proteico nella cellule intatte. Mentre abbiamo cercato di fornire un metodo che è più generale possibile, questo approccio ha il potenziale per variazioni quasi illimitate di studiare i vari processi che si verificano durante la piegatura, il trasporto e la vita delle proteine all'interno della cellula.

Quando si esegue un inseguimento di impulso utilizzando cellule aderenti nei piatti.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziare tutti i membri del laboratorio Braakman, passato e presentano, per le loro discussioni fruttuose e aiutano a sviluppare i metodi presentati in questo articolo. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP7/2007-2013) N ° dell'Unione europea 235649 e i Paesi Bassi organizzazione della ricerca scientifica (NWO) sotto il programma ECHO-N ° 711.012.008.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per microcentrifuga safeseal da 1,5 mLSarstedt72.706.400
Acido aceticoSigmaA6283acido acetico glaciale
BAS Schermo al fosforo di stoccaggio 20x25 cmGE Life Sciences28956475
Blu BromofenoloSigmaB8026Grado di biologia molecolare
Carestream Biomax Pellicole MRKodakZ350370-50EA
Terreni di coltura cellulareVariN/ATerreni di coltura cellulare normali per specifiche linee cellulari utilizzate
Terreni di coltura cellulare, senza metionina/cisteinaVariN/AStessa formulazione dei terreni di coltura normali, ad esempio DMEM/MEM/RPMI, privi di metionina e cisteina
Carta da filtro al carboneWhatman1872047
Puntali per pipette filtrati al carboneMolecolare bioproducts5069B
Antracite vacu-guardWhatman67221001
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma112,553per elettroforesi
CisteinaSigmaC7352Grado di biologia molecolare, Produci 500 mM di magazzino, conservare a -20 
Ditiotreitolo (DTT)Sigma10197777001Grado di biologia molecolare
EasyTag Express35S Miscela di etichettatura delle proteinePerkin ElmerNEG772014MCSono disponibili lotti di etichette di altre dimensioni a seconda dell'uso
EDTASigmaE1644Grado di biologia molecolare
Attrezzatura per l'essiccazione dei gelVariN/A
GliceroloSigmaG5516Carta
cromatografia di grado 3GE Life Sciences3003-917
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)Gibco24020117
Kimwipes salviette per attività delicateVWR21905-026
MESSigma M3671Grado di biologia molecolare
MetanoloSigmaMX0490 
MetioninaSigmaM5308Grado di biologia molecolare, Marca 250 mM di magazzino, conservare a -20
Attrezzature per la fusione/esecuzione di MinigelVariN/A
NaClSigmaS7653Grado di biologia molecolare
N-etilmaleimmideSigmaE3876Grado di biologia molecolare, Produci 1 milione di stock in etanolo al 100%, conservare a -20
PBSSigmaP5368
Proteina-A Sepharose di grado di biologia molecolare perle fastflowGE health-care17-5280-04
Sodio dodecil solfato (SDS)SigmaL3771Grado di biologia molecolare
Triton X-100SigmaT8787Grado di biologia molecolare
Base Trizma (Tris)SigmaT6066Grado di biologia molecolare
Tifone IP Imager biomolecolareAmersham29187194
Unwire Rack per provette 20 mm per bagnomariaNalgene5970-0320PK
per di biologia molecolare

Riferimenti

  1. Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
  2. Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).

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Ristampe e permessi

Tag

Trasporto proteicodegradazione proteicaSDS PAGEimmunoprecipitazioneformazione di ponti disolfuroscissione del peptide segnalelisi cellularecentrifugazione