Qui descriviamo un protocollo per un metodo generale di pulse-chase che permette l'analisi cinetica di pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine da seguire in cellule vive.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase
In questo articolo
Sommario
Abstract
Impulso-insegua radioattivo etichettatura è un potente strumento per lo studio della maturazione conformazionale, il trasporto a loro posizione cellulare funzionale e la degradazione di proteine in cellule vive. Utilizzando radiolabeling tempi brevi (impulso) (< 30 min) e strettamente controllato chase volte, è possibile aggiungere etichette solo una piccola frazione della piscina della proteina totale e seguire sua pieghevole. Quando combinato con non riducente/riducendo l'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e immunoprecipitazione con anticorpi (conformazione-specifici), processi di piegatura può essere esaminato in dettaglio. Questo sistema è stato utilizzato per analizzare il ripiegamento di proteine con una variazione enorme in proprietà quali proteine solubili, proteine transmembrana singole e multi-pass, pesantemente N - e O-glicosil proteine e proteine con e senza bisolfuro di vasto incollaggio. Impulso-insegua metodi sono alla base di studi cinetici in una gamma di funzionalità aggiuntive, tra cui co - e modifiche di posttranslational, oligomerizzazione e polimerizzazione, essenzialmente che consente l'analisi di una proteina dalla nascita alla morte. Impulso-Insegua gli studi sul folding delle proteine sono complementari con altri metodi biochimici e biofisici per lo studio delle proteine in vitro , fornendo una maggiore risoluzione temporale e informazioni fisiologiche. I metodi come descritto all'interno di questa carta sono adattati facilmente per studiare la piegatura di quasi tutta la proteina che può essere espressa nei sistemi mammiferi o insetto-cella.
Introduzione
La piegatura delle anche relativamente semplice proteine coinvolge molti diversi enzimi pieghevoli, chaperoni molecolari e modificazioni covalenti1. Una ricostituzione completa di questi processi in vitro è praticamente impossibile, dato il vasto numero di differenti componenti coinvolti. È altamente auspicabile, pertanto, per studiare il folding delle proteine in vivo, in cellule vive. Impulso-insegua radioattivo tecniche rivelarsi uno strumento potente per studiare la sintesi, pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine nel loro ambiente naturale.
Il metabolica etichettatura delle proteine....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i reagenti radioattivi ed erano gestite conformemente alle norme e regolamenti di radiazione locali Università di Utrecht.
1. pulse Chase
-
Inseguimento di impulso per le cellule aderenti
Nota: I volumi qui riportati sono basati su piastre di coltura cellulare di 60 mm. Per piatti di 100 mm o 35 mm, moltiplicare i volumi da 1/2 o 2, rispettivamente. Questo protocollo utilizza un tempo di impulso di 10 min e chase volte di 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Questi può essere variati a seconda le proteine specifiche in fase di studio (discusse sotto).- Semi di cellule aderenti (ad es., HEK 293, He....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La piegatura e la secrezione di gp120 di HIV-1 da un inseguimento di impulso aderente è illustrato nella Figura 2. Il gel non riducente (cellule NR nella figura) viene illustrato il folding ossidativo di gp120. Immediatamente dopo l'impulso di etichettatura di gp120 5 min (0 min chase) appare come una banda diffusa superiore nel gel, e col progredire della chase, la band migra verso il basso il gel attraverso ancora più diffusa pieghevole intermedi (IT) fino .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Impulso-insegua metodi sono stati essenziali per sviluppare la comprensione degli scienziati del ripiegamento proteico nella cellule intatte. Mentre abbiamo cercato di fornire un metodo che è più generale possibile, questo approccio ha il potenziale per variazioni quasi illimitate di studiare i vari processi che si verificano durante la piegatura, il trasporto e la vita delle proteine all'interno della cellula.
Quando si esegue un inseguimento di impulso utilizzando cellule aderenti nei piatti.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziare tutti i membri del laboratorio Braakman, passato e presentano, per le loro discussioni fruttuose e aiutano a sviluppare i metodi presentati in questo articolo. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP7/2007-2013) N ° dell'Unione europea 235649 e i Paesi Bassi organizzazione della ricerca scientifica (NWO) sotto il programma ECHO-N ° 711.012.008.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga safeseal da 1,5 mL | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acido acetico | Sigma | A6283 | acido acetico glaciale |
| BAS Schermo al fosforo di stoccaggio 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Blu Bromofenolo | Sigma | B8026 | Grado di biologia molecolare |
| Carestream Biomax Pellicole MR | Kodak | Z350370-50EA | |
| Terreni di coltura cellulare | Vari | N/A | Terreni di coltura cellulare normali per specifiche linee cellulari utilizzate |
| Terreni di coltura cellulare, senza metionina/cisteina | Vari | N/A | Stessa formulazione dei terreni di coltura normali, ad esempio DMEM/MEM/RPMI, privi di metionina e cisteina |
| Carta da filtro al carbone | Whatman | 1872047 | |
| Puntali per pipette filtrati al carbone | Molecolare bioproducts | 5069B | |
| Antracite vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | per elettroforesi |
| Cisteina | Sigma | C7352 | Grado di biologia molecolare, Produci 500 mM di magazzino, conservare a -20 |
| Ditiotreitolo (DTT) | Sigma | 10197777001 | Grado di biologia molecolare |
| EasyTag Express35S Miscela di etichettatura delle proteine | Perkin Elmer | NEG772014MC | Sono disponibili lotti di etichette di altre dimensioni a seconda dell'uso |
| EDTA | Sigma | E1644 | Grado di biologia molecolare |
| Attrezzatura per l'essiccazione dei gel | Vari | N/A | |
| Glicerolo | Sigma | G5516 | Carta |
| cromatografia di grado 3 | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes salviette per attività delicate | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Grado di biologia molecolare |
| Metanolo | Sigma | MX0490 | |
| Metionina | Sigma | M5308 | Grado di biologia molecolare, Marca 250 mM di magazzino, conservare a -20 |
| Attrezzature per la fusione/esecuzione di Minigel | Vari | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Grado di biologia molecolare |
| N-etilmaleimmide | Sigma | E3876 | Grado di biologia molecolare, Produci 1 milione di stock in etanolo al 100%, conservare a -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Proteina-A Sepharose di grado di biologia molecolare perle fastflow | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma | L3771 | Grado di biologia molecolare |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Grado di biologia molecolare |
| Base Trizma (Tris) | Sigma | T6066 | Grado di biologia molecolare |
| Tifone IP Imager biomolecolare | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Rack per provette 20 mm per bagnomaria | Nalgene | 5970-0320PK |
Riferimenti
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
