Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4⁺ e CD8⁺ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.

Abstract

Caratterizzazione delle cellule immuni si basa fortemente su multicolor flusso cytometry per identificare sottopopolazioni basate su espressione differenziale dei marcatori di superficie. Installazione di un pannello multicolor classico richiede strumenti high-end, gli anticorpi con etichettati personalizzati e attento studio design per minimizzare la sovrapposizione spettrale. Abbiamo sviluppato un'analisi multiparametrica per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4⁺ e CD8⁺ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) nel sangue periferico mediante la combinazione di sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi. La nostra strategia si basa sull'osservazione che marcatori lignaggio costantemente sono espressi in una combinazione unica di ogni popolazione cellulare. Combinando queste informazioni con un'attenta titolazione degli anticorpi permette ai ricercatori di registrare cinque indicatori aggiuntivi, espandendo il limite ottico della maggior parte dei citometri a flusso. Confronto testa a testa ha dimostrato che la stragrande maggioranza delle popolazioni di cellule immuni nel sangue periferico può essere caratterizzata con precisione paragonabile tra il nostro metodo ed il classico "approccio di indicatore di un fluorocromo-uno", anche se quest'ultimo è ancora più precisi per l'identificazione di popolazioni come T γδ cellule e cellule NKT. Combinazione di sette indicatori utilizzando due fluorocromi permette l'analisi delle popolazioni delle cellule immuni complesse e campioni clinici su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e anche su 2-3 strumenti di campo fluorocromo nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso. Questo approccio è anche molto adatto per lo screening di diverse popolazioni di cellule nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.

Introduzione

Citometria a flusso è una tecnica che è stata sviluppata per analizzare più parametri su singole particelle ad una velocità di diverse migliaia di eventi al secondo¹. Esempi di esemplari analizzati tramite flusso cytometry includono, ma non sono limitati a, cellule, perline, batteri, vescicole e cromosomi. Un sistema fluidico dirige le particelle nel punto di interrogatorio dove ogni particella si interseca il percorso con uno o più laser, e più parametri vengono registrati per ulteriori analisi. Disperde in avanti e laterali, generati dallo scattering della luce pura laser, vengono utilizzati per identificare la popolazione target e recuperare informazioni sulla dimensione relativa e la complessità interna/granularità delle particelle, rispettivamente. Tutti gli altri parametri, che rappresentano la maggior parte dei dati in un analisi cytometric di flusso, sono derivati dalle sonde fluorocromo-etichetta che riconoscono e si legano a specifici obiettivi sulle particelle di interesse.

Citometria a flusso è uno strumento primario per gli studi immunologici identificare e caratterizzare le popolazioni delle cellule. Per sezionare la complessità del sistema immunitario, pannelli multicolor sono in continua evoluzione per espandere il numero di marcatori contemporaneamente registrate per profonda immunophenotyping delle popolazioni delle cellule¹. Questo sta portando allo sviluppo di strumenti più capaci e fluorocromi, con recente citometri a flusso High-end superiore a 20 parametri fluorescenti. Ciò si traduce nella progettazione di studio complesso a causa della sovrapposizione spettrale fluorocromo e costi più elevati connessi con operatori qualificati ed etichettatura su ordinazione dell'anticorpo. In diversi casi, complessità e i costi sono ridotti utilizzando pannelli separati di marcatori per diverse popolazioni cellulari. Questo approccio, tuttavia, è soggetto a errori, riduce le informazioni in ogni pannello e può essere difficile da applicare ai campioni con un numero limitato di cellule. Inoltre, aumentando il numero di marcatori preclude immunophenotyping profondo sugli strumenti con meno parametri fluorescenti. Precedentemente abbiamo sviluppato un protocollo di colorazione per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4⁺ e CD8⁺ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) in cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) combinando sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi anziché sette necessaria utilizzando il tradizionale "un fluorocromo-uno marcatore" approccio (www.hcdm.org)^2,3. Il nostro rapporto iniziale esplorato e convalidato la nozione di combinare sette marcatori in due fluorocromi per immunophenotyping profonda. In questo rapporto, presentiamo un protocollo passo a passo per isolare e macchiare le cellule del sangue periferico, concentrandosi sull'aspetto pratico e risoluzione dei problemi per ottenere una colorazione di successo.

Questo protocollo è basato sull'osservazione che i marcatori lineage hanno un'espressione costante sulla superficie delle cellule e che ogni popolazione delle cellule ha un'esclusiva combinazione di marcatori di lignaggio. In PBMCs, espressione CD3 suddivide le cellule immuni in due categorie principali: i linfociti T CD3 positivi e cellule CD3-negative. All'interno del sottogruppo positivo CD3, CD4⁺, CD8⁺ e cellule T γδ possono essere separate usando gli anticorpi destinati esclusivamente a CD4, CD8 e il recettore γδ. In modo paragonabile, all'interno del sottogruppo negativo CD3, cellule B, cellule NK e dei monociti possono essere identificati in modo univoco utilizzando anticorpi contro CD19, CD56 e CD14, rispettivamente. In un approccio di marcatore fluorocromo-uno uno standard, anti-CD3-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e TCR - γδ gli anticorpi vengono rilevati con sette diversi fluorocromi. Il nostro approccio combina anti-CD3 - CD56 e TCR - γδ anticorpi in un fluorocromo (etichettato per fluorocromo convenienza A) e anti-CD4,-CD8, - CD14 e - CD19 anticorpi in un fluorocromo diverso (fluorocromo B). Questo è possibile tramite una combinazione di titolazione degli anticorpi e l'espressione dell'antigene differenziale. Entrambi CD4⁺ e CD8⁺ T cellule sono positive per l'anticorpo anti-CD3 in fluorocromo A, ma possono essere separati in fluorocromo B massimizzando l'espressione del CD8 segnale durante l'inserimento, con una titolazione ad hoc, il segnale di CD4 tra il CD8 e le cellule di CD3 positivi-CD4/CD8 doppia negazione. Cellule T γδ esprime il livello di CD3 superiore CD4 e CD8, e pertanto possono essere identificati come CD3 alta⁴. Questo segnale è ulteriormente potenziato dall'etichettatura γδ cellule T in fluorocromo A con un anticorpi di anti-TCR γδ, migliorando così la separazione tra CD3 basso T cellule e cellule di alta γδ T CD3. Le cellule B possono essere identificate come CD3^– di fluorocromo A e CD19⁺ in fluorocromo B. Per separare le cellule di NK CD3 negative dalle cellule di B, un anticorpo anti-CD56 fu adibito a fluorocromo A anti-CD3. Questo è possibile perché CD56 espressi sulla cellula NK ad un livello molto inferiore rispetto CD3 su cellule T⁵. Infine, i monociti possono essere individuati tramite una combinazione di proprietà di forward-side scatter ed espressione di CD14 in fluorocromo B.

L'idea di combinare fino a quattro marcatori utilizzando due fluorocromi è stato tentato già con successo prima delle^6,7,8ed è stato utilizzato in un protocollo clinico per identificare popolazioni linfocitarie maligni⁹ . Un rapporto precedente anche combinato sette indicatori (con differente specificità dal marcatori che abbiamo usato nel nostro protocollo) utilizzando due fluorocromi, ma questo approccio invocata una complessa l'etichettatura di ciascun anticorpo con quantità variabile di fluorocromo¹⁰. Questo è in contrasto con il nostro metodo che utilizza anticorpi disponibili in commercio e può essere adattato per la configurazione dello strumento e possa avvantaggiarsi della nuova generazione dei fluorocromi polimero.

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandere i limiti ottici della maggior parte dei citometri a flusso permettendo la registrazione di cinque ulteriori indicatori per interrogare le popolazioni delle cellule complesse. Di conseguenza, avanzata analisi immunologica può essere eseguita su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e 2-3 fluorocromo campo strumenti possono raggiungere notevoli risultati nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso e creare modularità del flusso cytometric pannelli diversi lignaggi al tempo stesso¹¹di targeting. Questo può potenzialmente ridurre il numero di pannelli utilizzati in citometria a flusso modulare immunophenotyping e ridurre i costi, errori e tempo di trattamento. Questo approccio è anche molto adatto nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.

Protocollo

Tutti gli studi dei materiali umani sono stati approvati da Johns Hopkins Institutional Review Board sotto l'Health Insurance Portability and Accountability Act. Campioni di pazienti e dei controlli sono stati de-identificati. PBMCs e sangue dai comandi sani sono stati ottenuti da consenso informato.

Nota: Questo protocollo è stato testato su fresco o congelato isolato cellule del sangue periferico e nel sangue intero.

1. cella preparazione

1. Isolamento delle cellule del sangue periferico (PBMC) da sangue intero
   1. Prelievo di sangue in una provetta verde 10 mL contenente eparina sodica. Dopo che il tubo è stato riempito di sangue, capovolgere immediatamente il tubo più volte a prevenire la coagulazione.
      Nota: Provette contenenti altri anticoagulante come acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o citrato di sodio possono essere utilizzate con risultati comparabili. Se una diversa quantità di sangue viene raccolto, i passaggi seguenti nel protocollo devono essere ridimensionati di conseguenza.
   2. Trasferire con cautela il sangue prelevato in una provetta conica da 50 mL. Diluire il sangue con una pari quantità di tampone fosfato salino (PBS) senza calcio e magnesio.
   3. Aggiungere 15 mL di terreno gradiente di densità (ad es., Ficoll) verso il basso di un nuovo provetta conica da 50 mL e overlay attentamente il sangue diluito in cima mezzo gradienti di densità, evitando qualsiasi miscelazione tra densità gradiente medio e sangue diluito.
      Nota: Questo è un passo fondamentale per una corretta separazione delle PBMC dai globuli rossi.
   4. Centrifugare a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente (TA), con nessun freno per evitare interruzioni dell'interfaccia.
   5. Dopo la centrifugazione, attentamente aspirare lo strato superiore utilizzando una pipetta ed eliminarlo, prestando attenzione a non rimuovere le cellule a livello di interfaccia tra il plasma e densità gradiente medio, che è dove si stratifica PBMCs. Raccogliere il numero di celle possibile dall'interfaccia senza toccare il pellet di globuli rossi in fondo la provetta conica da 50 mL e il trasferimento in una nuova provetta conica 50 mL.
   6. Aggiungere PBS per portare il volume finale di 25 mL e mescolare capovolgendo. Centrifugare a 300 x g per 10 min a RT con il freno su per rimuovere eventuali contaminazioni di medio gradiente di densità dalla sospensione cellulare.
   7. Aspirare accuratamente il surnatante senza inquietante pellet cellulare. Aggiungere PBS per portare il volume finale di 25 mL e mescolare capovolgendo. Centrifugare a 200 x g per 10 min a RT con il freno a piastrine Rimuovi.
   8. Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere PBMCs in 1 mL di PBS/0.1% di sodio azide. Azoturo di sodio riduce la tappatura, spargimento, interiorizzazione degli anticorpi e recupero di aumento delle cellule, ma la sua tossicità può compromettere la vitalità cellulare. Per questo motivo, la sodio azide dovrebbe essere evitata in tutti i passaggi se le cellule saranno coltivate per esperimenti successivi. Isolamento delle cellule e la macchiatura senza sodio azide hanno dato risultati simili alla macchiatura eseguite in presenza di sodio azide.
      Attenzione: La sodio azide può causare la morte che interessano il sistema nervoso centrale. Può provocare ustioni alla pelle e agli occhi.
   9. Diluire le cellule per il conteggio con il trasferimento di 30 µ l di PBMCs in una microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi aggiungere 120 µ l di PBS e 150 µ l di blu di Trypan per determinare il numero di cell e vitalità (01:10 cellulari diluizione). Risospendere accuratamente.
   10. Trasferire 10 µ l in un emocitometro, conteggio le cellule di conseguenza per il conteggio usate da camera e determinano il numero di cellule vitali. Cellule vitali = numero di Trypan blue cellule negative totale x 10 (il fattore di diluizione utilizzato in questo protocollo) x 10⁴.
       Nota: In media, 7-15 x 10⁶ di PBMCs dovrebbero essere raccolti da 10 mL di sangue.
   11. Risospendere le cellule a 10 x 10⁶ millilitri di PBS/0.1% sodio azide
       Nota: PBMC può essere congelati e conservati in azoto liquido per un lungo periodo di tempo. Tuttavia, l'espressione di marcatori come recettori per le chemochine può essere modificato da questa procedura.
2. Preparazione delle celle da PBMC congelati
   Nota: diverse procedure di congelamento possono colpire cellulare recupero e attuabilit๲. PBMC per questi esperimenti sono stati congelati appositamente formulato congelamento media o siero bovino fetale (FBS)/10% solfossido dimetilico (DMSO) con risultati simili.
   Attenzione: DMSO può essere leggermente pericoloso in caso di inalazione (irritante del polmone), contatto (irritante, Permeatore), del contatto oculare (irritante), di ingestione con la pelle.
   1. Rimuovere PBMC congelati da azoto liquido e metterli su ghiaccio. Trasferire il cryovial dal ghiaccio direttamente nel bagno di acqua di 37 ° C. Mantenere il cryovial alla superficie dell'acqua e agitare delicatamente i flaconi fino a quando rimangono un pellet di ghiaccio. Trasferire il cryovial torna sul ghiaccio.
   2. Rimuovere l'acqua con un panno spruzzato di etanolo 70%. Lentamente aggiungere 1 mL di PBS/0.1% sodio azide a 4 ° C e trasferire con cautela la cella di una provetta conica da 15 mL. Aggiungere lentamente freddo PBS/0.1% sodio azide a 4 ° C per raggiungere un volume finale di 15 mL.
   3. Centrifugare a 300 x g per 10 min. rimuovere con attenzione il sovranatante, risospendere le cellule in 1 mL di PBS/0.1% di sodio azide.
      Nota: Le cellule possono anche essere risospesi in RPMI 10% FBS con risultati simili.
   4. Diluire la cella per il conteggio con il trasferimento di 30 µ l di PBMCs in una microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi aggiungere 120 µ l di PBS e 150 µ l di blu di Trypan per determinare il numero di cell e vitalità (01:10 cellulari diluizione). Risospendere accuratamente.
   5. Trasferire 10 µ l in un emocitometro, conteggio le cellule di conseguenza per il conteggio usate da camera e determinano il numero di cellule vitali. Cellule vitali = numero di Trypan blue cellule negative totale x 10 (il fattore di diluizione utilizzato in questo protocollo) x 10⁴.
   6. Risospendere le cellule a 10 x 10⁶ / mL in PBS/0.1% sodio azide.
3. Preparazione delle cellule da sangue intero
   1. Prelievo di sangue in una provetta verde 10 mL contenente eparina sodica. Dopo che il tubo è stato riempito di sangue, capovolgere immediatamente il tubo più volte a prevenire la coagulazione.
      Nota: Provette contenenti altri anticoagulante come EDTA o citrato di sodio può essere utilizzato con risultati comparabili. Se una diversa quantità di sangue viene raccolto, i passaggi seguenti nel protocollo devono essere ridimensionati di conseguenza.
   2. Trasferire 200 µ l di sangue intero in una provetta 12 x 75 mm ricoperto, aggiungere 2 µ l di sodio azide e agitare delicatamente per 2 s.

2. cellula di colorazione

Nota: Scegliere coppie di fluorocromi con sovrapposizione virtualmente no spettrale è importante per ridurre la diffusione dei dati a causa di alta ricaduta di un fluorocromo in altro rivelatore di fluorocromo. Per ottenere un'identificazione ottima ai sottoinsiemi di cellule, fluorocromi con un rendimento quantico alta dovrebbero essere usati come coppie di anticorpo PE-BV421 e PE-APC.

1. Macchiatura di PBMC freschi e surgelati
   1. Trasferire 100 µ l di PBMC (1 x 10⁶ cellule) di una piastra a 96 pozzetti fondo V.
      Nota: Qualsiasi numero di celle inferiore a 1 x 10⁶ può essere utilizzato con simili risultati².
   2. Centrifugare a 350 x g per 3 min a RT e aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere a ciascun bene 100 µ l di PBS contenente un colorante live/dead risolvibile che reagisce con l'ammina libera sulle proteine per 10 min etichettare le cellule morte.
   3. Preparare per ogni campione 30 µ l di una miscela contenente tutti gli anticorpi (anti-CD3.-CD56, TCRγδ in A fluorchrome e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in fluorchrome B). Concentrazione di anticorpi sono indicati nella tabella 1 e Table2. In questa fase, titolati anticorpi contro molecole target diversi e in differenti fluorocromi possono essere aggiunti pure (per esempio, la tabella 3).
      Nota: Concentrazione di anticorpi può variare a seconda del produttore e il numero di lotto. Di conseguenza, dovrebbero essere fatto prove preliminari per ottenere il segnale ottimo. PBS, BSA PBS/0.5%, PBS/0.2% di sodio azide o PBS/0.5% BSA/0.1% sodio azide sono stati utilizzati con risultati simili per diluire gli anticorpi². Cella può essere macchiato anche in volumi diversi da 30 µ l di integrare facilmente questa metodologia al già esistente che macchia i protocolli.
   4. Centrifugare a 350 x g per 3 min a RT e aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il cocktail di anticorpi ad ogni pozzetto e Risospendere accuratamente senza generare bolle. Incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
      Nota: È possibile a macchiare i campioni a 4 ° C con risultati simili.
   5. Aggiungere 150 µ l di buffer di colorazione e centrifugare a 350 x g per 3 min a RT e aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in 200 µ l di PBS e acquisire i dati su un citometro a flusso. Se vengono modificate colorazione volumi, assicurati almeno una diluizione 20 volte del mix originale anticorpo usato per lavare l'eccesso di anticorpi.
      Nota: Cellule marcate possono essere corretti con in PBS/2% paraformaldeide, conservate in frigorifero a 4 ° C durante la notte e poi acquisite su un citometro a flusso il giorno seguente.
      Attenzione: Paraformaldeide è nocivo se ingerito e può causare irritazione della pelle
2. Macchie di sangue intero
   1. A ciascuna provetta 12 x 75 mm ricoperto, aggiungere il cocktail di anticorpi (anti-CD3.-CD56, TCRγδ di fluorocromo A e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in fluorocromo B) e incubare a temperatura ambiente per 30 min a temperatura ambiente al buio. Concentrazione di anticorpi sono indicati nella tabella 4. In questa fase, titolato anticorpi contro molecole target diversi e in differenti fluorocromi possono essere aggiunti pure. Concentrazione di anticorpi può variare a seconda del produttore e il numero di lotto. Di conseguenza, dovrebbero essere fatto prove preliminari per ottenere il segnale ottimo.
      Nota: È possibile a macchiare i campioni a 4 ° C con risultati simili.
   2. Centrifugare a 350 x g per 3 min a RT e aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare. Preparare una soluzione di 1 x il globulo rosso di tampone di lisi seguendo le istruzioni del produttore.
      Nota: La soluzione di Lisi deve essere a temperatura ambiente prima dell'uso.
   3. Aggiungere 2,0 mL di tampone di lisi di globuli rossi: 1x in ogni provetta, tappare bene e mescolare capovolgendo. Coprire con pellicola e lasciate riposare per 15 min.
   4. Rotazione verso il basso a 300 x g per 5 min. Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare.
   5. Aggiungere 2 mL di PBS e centrifugare a 300 x g per 5 min.
      Nota: A questo punto, il pellet cellulare dovrebbe avere una colorazione bianca pallida che indica una lisi di successo del globulo rosso. Aspirare accuratamente il surnatante per non disturbare il pellet cellulare e Risospendere delicatamente le cellule in 200 µ l di PBS.
   6. Colare le cellule attraverso tubi 12 x 75 mm con tappi di filtro 40 µm per rimuovere aggregati cellulari e acquisizione di dati su un citometro a flusso.

3. titolazione di anticorpi

Nota: Titolazione di anticorpi è la fase più critica per l'ottenimento di dati di alta qualità, riproducibili. Titolazione dell'anti-CD3-CD8,-CD14, - CD19 e TCR - γδ segue la procedura standard mediante il quale la concentrazione dell'anticorpo per separare in modo ottimale i picchi positivi e negativi è derivata da massimo macchiatura indice^13,14. Diluizioni presso la punta o il più vicino al picco sul lato aumentante della curva Indice macchia dovrebbero essere selezionato (Figura 1A-C). L'anticorpo anti-CD4 è titolato per posizionare il picco della popolazione CD4 positivo tra singole popolazioni positivi CD3 e CD3 + CD8 + T cellule, più vicino al CD3 singolo segnale positivo di discriminare meglio le popolazioni CD8dim (CD8 + T γδ cellule e cellule NK T). Lungo la stessa linea, CD56 titolazione ha lo scopo di posizione NK CD56⁺ cellule tra il CD3⁺ e il CD3^– popolazione.

1. Macchia massimo indice curva
   Nota: titolazione dell'anti-CD3-CD8,-CD14, - CD19 e TCR - γδ segue la procedura standard mediante il quale la concentrazione dell'anticorpo per separare in modo ottimale i picchi positivi e negativi è derivata da un massimo di macchiatura Indice curva¹⁵. Se gli anticorpi contro altri marcatori vengono aggiunti al pannello, hanno anche bisogno di essere titolato con una curva di indice colorazione massima.
   1. Preparare una diluizione di anticorpo 2 volte da riempimento 10 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 40 µ l di tampone di colorazione. Nel primo pozzetto, aumentare il volume finale di 80 µ l di tampone colorazione e aggiungere l'anticorpo di interesse ad una concentrazione 4 volte la concentrazione consigliata dal costruttore.
   2. Mescolare bene e trasferire ben 40 µ l al secondo. Mescolare bene e ripetere questo passaggio per i tutti gli altri pozzi.
   3. Macchia di 10 campioni di PBMC o sangue intero con 30 µ l di 10 differenti diluizioni 2 volte di anticorpi seguendo il protocollo descritto prima.
   4. Acquisire dati con un citometro a flusso e tracciare il segnale da ogni diluizione (Figura 1A).
   5. Porta sulle popolazioni positive e negative per ogni concentrazione di anticorpi. Aumento della concentrazione di anticorpi può portare a una più alta priorità bassa. Di conseguenza, ridimensionare il cancello negativo di conseguenza.
   6. Per ogni concentrazione di anticorpi, estrarre informazioni sulla mediana e deviazione standard per l'intensità di fluorescenza della popolazione negativa e la mediana per l'intensità di fluorescenza della popolazione positiva. Calcolare per ogni concentrazione di anticorpi l'indice di macchia con questa formula: (intensità fluorescente mediana della popolazione positiva — intensità fluorescente mediana della popolazione negativa) ÷ (deviazione standard 2 x dell'intensità fluorescente della negativo della popolazione) (Figura 1B).
   7. Tracciare la macchia Indice vs. la concentrazione di anticorpi espressa come frazione della diluizione dell'anticorpo (ad es., 01:10 diluizione = 0.1) e identificare la concentrazione dell'anticorpo con il valore di indice massimo macchia (Figura 1).
2. Titolazione di anticorpi anti-CD4 e - CD56
   Nota: titolazione di anticorpi Anti-CD4 e - CD56 si basa sulla titolazione precedente gli altri indicatori nel pannello due-fluorocromo. Per l'anticorpo anti-CD4, la titolazione mira a mettere l'anti-CD4 di segnale tra il CD8 doppia⁺/CD3⁺ segnale e il CD3 singola popolazione positiva (Figura 1).
   1. Titolo l'anti-CD4 e CD56 anticorpi con una strategia di diluizione 2 volte come descritto prima, aggiungendo ulteriori concentrazioni in mezzo per identificare con precisione l'intervallo di concentrazione che permette di separare CD4⁺ T cellule e cellule NK dall'altra cellula popolazioni.
   2. Titolo dell'anticorpo anti-CD4 inserendo il segnale anti-CD4 tra la doppia CD8⁺/CD3⁺ segnale e il CD3 singola popolazione positiva (Figura 1).
      Nota: Cura speciale dovrebbe essere fatto per separare chiaramente CD4⁺ T cellule da CD8⁺ dim popolazioni.
   3. Titolo dell'anticorpo di anti-CD56 seguendo una strategia simile per la titolazione di anticorpi anti-CD4, inserendo le cellule NK tra il CD3-negativo e le popolazioni di CD3-positive.

4. strategia di gating

1. Identificare le popolazioni delle cellule linfocitarie e monocytic e rimuovere le cellule morte e la maggior parte delle cellule del sangue rosso residue dall'analisi.
   1. Selezionare l'intera popolazione che contiene linfociti e monociti basati su zona avanti vs side scatter (FSC-A vs SSC-A). Rimuovere gli aggregati cellulari dall'analisi tramite larghezza di forward scatter altezza vs forward scatter (FSC-H vs FSC-W) e larghezza di laterale scatter altezza vs side scatter (SSC-H vs SSC-W).
   2. Utilizzare un marcatore di discriminazione live/dead per escludere le cellule morte positive luminose e residuale globuli rossi dall'analisi. Cancello su linfociti e monociti sulla base del diverso profilo FSC-A e SSC-A.
2. Due-fluorocromo sette-marcatore gating strategia di popolazione linfocitaria.
   Nota: all'interno del sottogruppo positivo CD3, CD4⁺, CD8⁺ e cellule T γδ possono essere separate usando gli anticorpi destinati esclusivamente a CD4, CD8 e il recettore γδ. In modo paragonabile, all'interno del sottogruppo negativo CD3, cellule B, cellule NK e dei monociti possono essere identificati in modo univoco utilizzando anticorpi contro CD19, CD56 e CD14, rispettivamente.
   1. Selezionare la porta del linfocita e crea una stampa di puntino con su ogni asse uno dei due fluorocromi utilizzati nel presente protocollo (Figura 2B).
   2. Cancello il CD8⁺ T cellule identificate come CD3⁺/CD8⁺ doppio cellule positive all'angolo superiore destro della dot-trama (Figura 2B). Escludere la popolazione di CD8 dim che potrebbe contenere cellule NKT. Cancello il CD4⁺ T cellule identificate come popolazione tra CD8⁺ T cellule e il CD3 singolo positivi popolazioni. Porta sulle cellule T γδ identificato come alta CD3 cellule. Suddividere le cellule T γδ in CD8 positivi e negativi di CD8.
   3. Cancello il identificato come la popolazione tra CD3 positivi delle cellule NK e cellule CD3-negative. Suddividere le cellule NK in CD8 positivi e negativi di CD8. Porta sulle cellule B, identificato come CD3-negativi CD19⁺ popolazione all'angolo inferiore destro della trama del puntino.
   4. Selezionare i cancelli del monocito e crea una stampa di puntino con su ogni asse uno dei due fluorocromi utilizzati nel presente protocollo (Figura 2). Cancello il CD3^–/CD14⁺ popolazione.

Risultati

L'installazione e l'analisi di un esperimento di citometria a flusso delle cellule del sangue periferico umane macchiato con sette indicatori di lignaggio (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-anticorpi γδ CD19, - CD56 e - TCR) utilizzando solo due fluorocromi sono presentati.

Risultati rappresentativi sono descritte per anti-CD8 e - CD56 titolazione di anticorpi. Per ogni anticorpo (in questo esempio, anti-CD8), sono stati registrati da...

Discussione

Il protocollo presentato qui ha dimostrato di essere abbastanza flessibile e insensibile ai cambiamenti di macchiatura buffer, la temperatura e la preparazione delle cellule del sangue periferico a causa l'alta espressione di marcatori di lignaggio sulla superficie delle cellule. La fase più critica per l'ottenimento di dati di alta qualità, riproducibili è la titolazione di anticorpi. Di nota, dato che la titolazione degli anticorpi deve sempre essere eseguita durante l'installazione di un pannello di cytometric di flus...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CD3	BD Biosciences	562426	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences		555398 Anticorpo per la colorazione RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Anticorpo per la colorazione RRID: AB_2744293
Cellule morte	Life technologies	L-23105	Vivo/morto discriminazione
Falcon 5 mL provetta in polistirene a fondo tondo con filtro cellulare tappo a scatto	BD Bioscience 352235		filtrare la sospensione cellulare prima di passare attraverso il citometro a flusso
Falcon 5 mL provetta in polistirene a fondo tondo Falcon 5 mL	BD Bioscience	352001	per colorare il sangue intero
Recupero Coltura cellulare Mezzo di congelamento	Thermo fisher	12648010	Celle
di congelamentoPiastra con fondo a V a 96 pozzetti	Thermo fisher	249570	piastra per colorazione
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences Citometro		flusso
FCS Express 6	Software De Novo		Analisi FACS
Graphpad	Software		Analisi dei dati