Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation

Sommario

Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.

Abstract

La leucina ricca di chinasi 2 (LRRK2) è il gene più frequentemente mutato nella malattia ereditaria del Parkinson (PD) e tutte le mutazioni patogene dell'LRRK2 provocano l'iperattivazione della sua funzione di chinasi. Qui, descriviamo un saggio facile e robusto per quantificare l'attività della via della chinasi LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici dell'uomo misurando la fosforolazione controllata da LRRK2 di uno dei suoi substrati fisiologici, Rab10 alla trenolina 73. L'analisi dell'immunoblotting descritta richiede un anticorpo completamente selettivo e fosfospecifico che riconosca l'epitopo Rab10 Thr73 fosforerilato da LRRK2, come l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10. Esso utilizza neutrofili del sangue periferici umani, perché il sangue periferico è facilmente accessibile e i neutrofili sono un costituente abbondante e omogeneo. È importante sottolineare che i neutrofili esprimono livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10. Un potenziale inconveniente dei neutrofili è la loro elevata attività intrinseca di proteasi serina, che richiede l'uso di inibitori della proteasi molto potenti come la diisopropylfluorofosfati (DIFP) organosa. Tuttavia, i neutrofili sono una risorsa preziosa per la ricerca sull'attività del percorso della chinasi LRRK2 in vivo e dovrebbero essere considerati per l'inclusione nelle collezioni di biorepository della PD.

Introduzione

I tentativi di rallentare o fermare il morbo di Parkinson (PD) sono finora falliti. La scoperta di mutazioni iperattive nella leucina ricca ripetizione chinasi 2 (LRRK2) che causano e/o aumentano il rischio di PD ha portato allo sviluppo di inibitori della chinasi LRRK2^1,2,3. Questi sono ora entrati negli studi clinici⁴. L'esatta funzione di LRRK2 non è chiara, ma un importante progresso è stata l'identificazione di un sottoinsieme di proteine Rab GTPase, tra cui Rab10, come il primo substrati fisiologici in buona fede della chinasi LRRK2^5,6,7. Le sfide chiave nell'era delle terapie che modificano la malattia sono i marcatori biochimici dello stato di attivazione della chinasi LRRK2 e l'impegno mirato degli inibitori della chinasi LRRK2.

Finora, il principale marcatore farmacocinetico per gli inibitori di LRRK2 in vivo è stato un gruppo di residui di serine costituiti da fosforesti di LRRK2, in particolare serine 935, che diventano deforfatiti in risposta a diversi inibitori di LRRK2^8,9. Tuttavia, la fosfororylazione serina 935 non è correlata all'attività intrinseca della china lRRK2 cellulare perché non è direttamente fosforilata da LRRK2 ed è ancora fosforilata in lRRK2^10. L'attività della chinasi LRRK2 si correla bene con l'autofosfororylazione della serina 1292, ma in termini pratici non è una lettura adatta per l'attività endogena della chinaltra LRRK2 mediante l'analisi immunoblot di estratti di cellule intere a causa dell'attuale mancanza di anticorpi affidabili e fosforici per questo sito^10,11.

Abbiamo sviluppato un saggio robusto e facile per quantificare l'attività della vaginasi l'LRRK2 nelle cellule del sangue periferiche umane che misura l'fosfororylazione controllata da LRRK2 della sua proteina bersaglio fisiologica Rab10 alla trelina 73¹¹. Il sangue periferico è facilmente accessibile tramite venesezione, che è un basso rischio e una procedura rapida che causa un disagio minimo. Ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferici umani perché costituiscono un'abbondante popolazione di cellule bianche (37-80% di tutti i globuli bianchi) e una popolazione omogenea di cellule che esprime livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10¹¹. Inoltre, i neutrofili del sangue periferico possono essere isolati in modo rapido ed efficiente utilizzando un approccio immunomagnetico negativo. Per garantire che la successiva fosfororylazione Rab10 osservata sia mediata da LRRK2, ogni lotto di neutrofili viene incubato con o senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2 (usiamo e raccomandiamo MLi-2)^2,12. Questo è seguito da lisi cellulare in un buffer contenente l'inibitore della proteasi (DIisophofosfato) (DIFP), che è necessario per sopprimere l'attività intrinseca della proteasi serina che è nota per essere ad alta neutrofili¹³. Per l'analisi finale mediante immunoblotting quantitativa, si consiglia di utilizzare l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10 che rileva specificamente il Rab10 Thr73-phosphoepitope e non reagisce incrociatamente con altre proteine Rab fosforolate¹⁴. La selettività e la specificità di questo anticorpo è stata convalidata in modelli di sovraespressione di diverse proteine Rab e una linea cellulare Knock-out A549 Rab10¹⁴. Così, misuriamo la differenza nella fosforilazione Rab10 nei lismi neutrofili che sono stati trattati con e senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2². In alternativa, i campioni potrebbero anche essere analizzati con altri metodi, come la spettrometria di massa quantitativa.

In conclusione, la fosfororylazione Rab10 controllata da LRRK2 è un marcatore superiore dell'attività della chinasi LRRK2 alla fosforolazione LRRK2 a serine 935 e i neutrofili ematici periferici umani sono una risorsa preziosa per la ricerca della PD in LRRK2. Il nostro protocollo fornisce un saggio robusto e facile per interrogare l'attività del percorso LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici e consente la stratificazione biochimica di individui con aumento dell'attività della chinasi LRRK2¹⁵. È importante sottolineare che tali individui possono beneficiare del futuro trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2.

Protocollo

Secondo la normativa locale del Regno Unito, tutte le manipolazioni e il pipettaggio del sangue umano sono intrapresi in un armadietto di sicurezza biologica di categoria 2. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il comitato di revisione etica locale e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Preparazione

1. Preparare 0,1 mL di EDTA Stock Solution 1 contenente 100 mM EDTA in salina con buffer fosfato (PBS).
2. Preparare 60 mL di EDTA Stock Solution 2 contenente 1 mM EDTA in PBS.
3. Preparare il buffer di lisi contenente 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM, 5 mM di pirofafato di sodio, 0,27 M di saccarosio, 0,1% (v/v)-mercaptoetanolo, 1x cocktail inibitore della proteasi, 1g/mL microcystin-LR e 0,5 mM di fluorofosofato di diisopillo (DIFP).
   NOTA: Gli autori utilizzano abitualmente un prodotto privo di EDTA, ma dovrebbe funzionare anche un cocktail con inibitore della proteasi contenente EDTA. Il buffer di lisi può essere effettuato in anticipo senza il mercaptoetanolo, gli inibitori della proteasi, la microcistina-LR e la DIFP, e conservato a 4 gradi centigradi fino all'uso. Assicurarsi che gli inibitori di proteasi, la microcistina-LR e la DIFP vengano aggiunti solo immediatamente prima dell'uso.
   NPITA': DIFP è tossico e deve essere maneggiato con cura in una cappa di fumi a seguito della valutazione locale dei rischi per la salute e la sicurezza. DIFP può essere aggiunto al buffer di lisi e utilizzato immediatamente. In alternativa, il buffer di lisi completo contenente tutti gli altri componenti, incluso DIFP, può essere rivestito a -80 gradi centigradi per un uso successivo per almeno 4 settimane.

2. Isolamento dei neutrofili dal sangue intero

1. Raccogliere 10 mL di sangue in un tubo di raccolta del sangue. Mescolare delicatamente invertendo i tubi 7-8x.
2. Trasferire 10 mL di sangue in un tubo conico da 50 mL.
3. Aggiungere al sangue 100 l di soluzione EDTA Stock Solution 1. Mescolare delicatamente.
4. Aggiungete 500 l del cocktail di isolamento (50 l/mL) dal kit di isolamento dei neutrofili (Tabella dei materiali) all'intero campione di sangue.
5. Vorticare le perle magnetiche dal kit di isolamento neutrofilo per 30 s prima dell'uso al fine di risospendere le perline magnetiche molto fini.
6. Aggiungere 500 l di perline magnetiche al campione di sangue e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte.
7. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
8. Riempire il tubo a 50 mL con EDTA Stock Solution 2. Mescolare con molto delicatamente pipetting su e giù 2-3x.
9. Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione del tubo.
10. Incubare per 10 min a RT.
11. Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL.
    NOTA: Non toccare il lato del tubo che è in contatto con il magnete ed evitare la raccolta e la perturbazione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Lasciare circa 10 mL della sospensione del globulo rosso dietro nella parte inferiore del tubo.
12. Vorticare le perline magnetiche per 30 s prima dell'uso e aggiungere 0,5 mL delle perline magnetiche al tubo contenente i neutrofili arricchiti. Mescolare delicatamente invertendo il tubo.
13. Incubare a RT per 5 min.
14. Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare agitazioni successive.
15. Incubare a RT per 5 min.
16. Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL.
    NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo.
17. Per garantire la completa rimozione delle perline magnetiche dalla miscela cellulare, posizionare il tubo contenente le cellule arricchite nel magnete.
18. Incubare per 10 min a RT.
19. Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che ora contiene neutrofili puri in un nuovo tubo conico 50 mL.
    NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo.
20. Mescolare le celle isolate con 1 mM EDTA Stock Solution 2 ad un volume finale di circa 41 mL. Pipette su e giù per mescolare.
21. Dividere la soluzione equamente in due tubi con circa 20 mL in ogni tubo.
22. Centrifuga entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.
23. Durante questa centrifuga estraendo il congelatore MLi-2 dell'inibitore (concentrazione di 200 m/1.000x) dal congelatore a -80 gradi centigradi e lasciare a RT per un uso successivo.
24. Immediatamente dopo la fase di centrifugazione e senza agitazione dei tubi, versare il supernatante senza disturbare i pellet neutrofili. Risospendere ogni pellet cellulare in 10 mL di colture cellulari (Tabella dei materiali) a RT con il pipettaggio dolce delle cellule su e giù 4x.

3. Trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2 dei neutrofili puri

1. Etichettare un tubo "DMSO" e l'altro tubo "MLi-2".
2. Al tubo etichettato "DMSO", aggiungere 10 L di DMSO e mescolare delicatamente convogliando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL. Al tubo con etichetta "MLi-2", aggiungere 10 o L di 200 MLi-2 soluzione stock (concentrazione finale 200 nM) e mescolare delicatamente pipettando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL.
3. Incubare i campioni per 30 min a RT. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 min durante l'incubazione.
4. Durante il periodo di incubazione, rimuovere lo stock DIFP da 0,5 M dal congelatore -80 gradi e posizionarlo in una cappa di fumi sul ghiaccio. Rimuovere 1 soluzione di riserva di microcistina-LR mg/mL dal congelatore -80 gradi centigradi e lasciare scongelare rt. Togliere dal congelatore un'aliquota (0,25 mL) del buffer di lisi, lasciarlo scongelare a RT, quindi posizionarlo sul ghiaccio per un uso successivo.
5. Preparare 1 mL di supporto di coltura cellulare contenente 1 OL di DMSO e chiamare questo buffer di sospensione DMSO. Preparare 1 mL di supporti RPMI contenenti 1 L L di 200 MLi-2 e chiamare questo buffer di sospensione MLi-2.
6. Dopo il periodo di incubazione di 30 min, centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.
7. Scartare con cura il supernatante in ogni tubo senza disturbare il pellet di neutrofilino.
8. Per il campione etichettato DMSO resospendere delicatamente il pellet in 1 mL del buffer di sospensione DMSO e per il tubo etichettato MLi-2, risospendere il pellet in 1 mL del buffer di sospensione MLi-2.
9. Trasferire i pellet cellulari risospesi nei corrispondenti tubi di centrifugazione etichettati "DMSO" e "MLi-2" e centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 3 min.
10. Durante la fase di centrifugazione, preparare il buffer di lisi. Nel cofano del fume aggiungere con attenzione 0,25 l di 0,5 M di soluzione DIFP e 0,25 L di 1 mg/mL microcistina-LR al buffer di lisi da 0,25 mL. Mescolare e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.
    NOTA: Aggiungere DIFP al buffer di lisi entro 15 min di lisi cellulare, perché DIFP è relativamente instabile in una soluzione acquosa.
11. Subito dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione e completamente tutti i supernatali con una pipetta senza disturbare il pellet di neutrofilino e posizionare i tubi sul ghiaccio.
12. Aggiungere immediatamente 100 l di tampone di lisi contenente DIFP e microcistina-LR ad ogni tubo. Utilizzando una pipetta da 100-200 gradi, sospendere i pellet cellulari conilando su e giù circa 5-10x.
13. Liscile le cellule sul ghiaccio per 10 min.
14. Centrifuga tubi a 20.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.
15. Trasferire i supernatanti "DMSO" e "MLi-2" contenenti i lismi neutrofili in nuovi tubi di centrifugazione. Scartare il pellet di detriti.
    NOTA: I lisati neutrofili sono ora pronti per l'uso o possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi per analisi future.

Risultati

Il nostro saggio permette di interrogare l'attivazione della chinasi LRRK2 associata alla PD nei neutrofili del sangue periferici umani con la fosforo laphorylazione Rab10 dipendente da LRRK2 come lettura. I neutrofili sono una popolazione omogenea e abbondante di globuli bianchi periferici che esprime alti livelli di proteine LRRK2 e Rab10 (Figura 1). L'unica altra popolazione cellulare tra le restanti cellule mononucleari del sangue periferiche (PBMC) con un alto numero di copie di entramb...

Discussione

Compelling evidenze cliniche, genetiche e biochimiche indicano un ruolo importante per LRRK2 e in particolare la sua funzione di chinasi nella malattia di Parkinson⁷. Gli inibitori della chinasi LRRK2 sono stati sviluppati e stanno entrando negli studi clinici^2,4,12. Come tale, è necessario sfruttare LRRK2 come biomarcatore per l'impegno con il bersaglio e per la stratificazione del paziente. Il nostro pr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL Puntali per pipette	Sarstedt	70.762	o equivalente
1,5 mL Microprovette	Sarstedt	72.690.001	o equivalente
10 mL Puntali per pipette	Sarstedt	86.1254.025	o equivalente
10 μ L Puntali per pipette	Sarstedt	70.113	o
equivalente 15 mL provetta falcon	Cellstar	188 271	o
equivalente 200 μ L Puntali per pipette	Sarstedt	70.760.002	o
equivalente 25 mL Puntali per pipette	Sarstedt	86.1685.001	o
equivalente provetta di falco da 50 mL	Cellstar	227 261	o equivalente
BD Vacutainer Hemogard Chiusura Plastica K2-EDTA Tubo	BD	BD 367525	o
equivalente Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuga	Beckman		o equivalente con rotatore a secchiello da nuoto per provette falcon da 15 mL e 50 mL a velocità 1000-1200 x g
Cabina di sicurezza biologica di categoria 2.
cocktail di inibitori della proteasi cOmplete (senza EDTA)	Roche	11836170001
DIFP (diisopropilfluorofosfato)	Sigma	D0879	Preparare la soluzione madre 0,5M in isopropanolo utilizzando precauzioni speciali.
Dimetilsolfossido	Sigma	6250
Ghiaccio secco o azoto
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	ThermoFisher	14190094	o equivalente Magnete
Easy 50 EasySep	Stemcell	18002	per contenere 1 provetta conica da 50 ml
Kit di isolamento diretto dei neutrofili umani EasySep	Stemcell	19666	Questo contiene Soluzioni chiamate " Cocktail di isolamento" e " RapidSpheres perline magnetiche
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuga 5417R centrifuga	Eppendorf
Etanolo, in flacone
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma	E6758
Ghiaccio
Isopropanolo (grado anidro)	Sigma	278475
tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerofosfato, 5 mM pirofosfato di sodio, 0,27 M saccarosio, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanolo, 1x cocktail di inibitori della proteasi cOmplete (senza EDTA) (Roche), 1 μ g/ml di microcistina-LR, 0,5 mM di diisopropilfluorofosfato (DIFP).			in alternativa tampone di lisi congelato in aliquote senza Microcistina-LR, DIFP disponibile da MRC-PPU Reagenti (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inibitore II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	o equivalente (inibitore LRRK2 potente e selettivo)
Microcistina-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml in DMSO e conservare a -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot sistema di imaging	Odyssey
Pennarello
Dispositivi
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	o
pirofosfato di sodio	Sigma	S22
saccarosio	Sigma	S0389
β-glicerofosfato	Sigma	50020
β-mercaptoetanolo	Sigma	M3148
Anticorpi consigliati per Western blotting
Anticorpo anti-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-&alfa;-tubulina	Cell Signaling Technologies	5174	utilizzato a diluizione 1:2000
Anti-topo di capra IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	utilizzato a diluizione 1:10.000
Anti-topo di capra IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	utilizzato a diluizione 1:10.000
Capra anti-coniglio IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	utilizzato a diluizione 1:10.000
MJFF-totale Rab10 anticorpo di topo	generato da nanoTools (nanotools.de)	non applicabile*	utilizzato a 2 μ g/ml di concentrazione finale; * L'anticorpo MJFF-total Rab10 generato da nanoTools (www.nanotools.de) [11] sarà commercializzato dalla Michael J Fox Foundation nel 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	usato a 1 μ g/ml di concentrazione finale
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagenti e servizi	UDD2	utilizzato a 1 μ g/ml di concentrazione finale