Lo scopo del metodo qui presentato è quello di mostrare come i microarray di microambiente (MEMA) possono essere fabbricati e utilizzati per interrogare l'impatto di migliaia di semplici microambienti combinatori sul fenotipo delle cellule coltivate.
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Articolo metodologico
Utilizzo di microarray per interrogare l'impatto microambientale sui fenotipi cellulari nel cancro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere l'impatto del microambiente sul fenotipo delle cellule è un problema difficile dovuto alla complessa miscela di fattori di crescita solubili e proteine associate a matrici nel microambiente in vivo. Inoltre, i reagenti prontamente disponibili per la modellazione di microambienti in vitro in genere utilizzano complesse miscele di proteine che sono incompletamente definite e soffrono di variabilità in lotti. La piattaforma microarray microambiente (MEMA) consente la valutazione di migliaia di semplici combinazioni di proteine microambientali per il loro impatto sui fenotipi cellulari in un unico test. I MEMA sono preparati in piastre di pozzo, che consente l'aggiunta di singoli ligandri per separare pozzi contenenti proteine a matrice extracellulare (ECM) suddivise. La combinazione del ligando solubile con ogni ECM stampato forma una combinazione unica. Un tipico test MEMA contiene più di 2.500 microambienti combinatori unici a cui le cellule sono esposte in un unico test. Come test case, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata placcata sulla piattaforma MEMA. L'analisi di questo analisi ha identificato i fattori che migliorano e inibiscono la crescita e la proliferazione di queste cellule. La piattaforma MEMA è altamente flessibile e può essere estesa per l'uso con altre questioni biologiche al di là della ricerca sul cancro.
Introduzione
La raccolta di linee cellulari tumorali su plastica in monostrati bidimensionali (2D) rimane uno dei principali cavalli di battaglia per i ricercatori oncologici. Tuttavia, il microambiente è sempre più riconosciuto per la sua capacità di impatto sui fenotipi cellulari. Nel cancro, il microambiente tumorale è noto per influenzare più comportamenti cellulari, tra cui la crescita, sopravvivenza, invasione, e la risposta alla terapia1,2. Le colture cellulari monostratore tradizionali in genere mancano di influenze microambientali, il che ha portato allo sviluppo di analisi tridimensionali più complesse (3D) per f....
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Protocollo
NOT: Una panoramica dell'intero processo MEMA, incluso il tempo stimato, è descritta nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di MEMA in lastre a 8 pozze. Il protocollo può essere adattato per altre piastre o diapositive.
1. Preparazione di buffer proteici, diluenti e coloranti
- Fiale di ECMs Equilibrat ligando, e citochine a temperatura ambiente (RT) e centrifuga brevemente. Aggiungere il volume appropriato del buffer RT appropriato come indicato nella scheda dati del prodotto. Seguire la raccomandazione del pr....
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Risultati
Per semplificare gli impatti microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule e per identificare le condizioni che hanno promosso o inibito la crescita e la proliferazione cellulare, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata seminata su una serie di otto MEMA con 8 carri come descritto nel protocollo. Questo test ha esposto le cellule a 48 diversi EPER e 57 diversi ligandi, per un totale di 2736 condizioni microambientali combinatori. Dopo 71 h in coltura, le cellule sono state pulsate con EdU, f.......
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Discussione
L'importanza della "dimensionalità" e del contesto è stata un fattore motivante nello sviluppo di sistemi di coltura in vitro come strumenti nella caratterizzazione delle cellule tumorali attraverso la loro interazione con il microambiente11,e la capacità di in vitro sistemi di coltura per imitare l'ambiente in vivo è una forza trainante dietro la ricerca di migliorare quei sistemi di coltura. I sistemi in vitro, tuttavia, rimangono strumenti significativi di ricerca sul cancro proprio a causa del.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione HG008100 (J.W.G., L.M.H.) niH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Sistema robotico Arrayer utilizzato nel protocollo | |
| Nikon HCA | Sistema di | imaging ad alto contenuto Nikon progettato attorno al microscopio invertito Nikon Eclipse Ti | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glicerolo | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| Piastra microarray a 384 pozzetti, pozzetto cilindrico | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 pozzetto | piatto Thermo Fisher | 267062 | |
| Soluzione di paraformaldeide al 16% | Microscopia elettronica Scienza | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodio Azide | Sigma | S2002 | |
| Maschera cellulare | Sonde molecolari | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | |
| ECM Collagene I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagene Tipo II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagene Tipo III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagene Tipo IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagene Tipo V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R e D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-caderina (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Brononectina | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoaderina/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontina (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectina | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectina | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Trombospondina-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican R | & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastina | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillina | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligando |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligando |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligando |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligando |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligando |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligando |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligando |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligando |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | ligando |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Legante |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Legante |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Legante |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Legante |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Legante |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligando |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligando |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligando |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligando |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligando |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligando |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligando |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligando |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligando |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligando |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligando |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligando |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligando |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligando |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligando |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligando |
| IL15 | RnD_Systems_Own 247-ILB-005 | Ligando | |
| TNF | RnD_ Systems_Own | 210-TA-020 | Ligando |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligando |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligando |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligando |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligando |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligando |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligando |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligando |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligando |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligando |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligando |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligando |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligando |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligando |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligando |
Riferimenti
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....
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Ristampe e permessi
