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NOT: Una panoramica dell'intero processo MEMA, incluso il tempo stimato, è descritta nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di MEMA in lastre a 8 pozze. Il protocollo può essere adattato per altre piastre o diapositive.
1. Preparazione di buffer proteici, diluenti e coloranti
- Fiale di ECMs Equilibrat ligando, e citochine a temperatura ambiente (RT) e centrifuga brevemente. Aggiungere il volume appropriato del buffer RT appropriato come indicato nella scheda dati del prodotto. Seguire la raccomandazione del produttore per le concentrazioni di scorte.
NOT: Un elenco completo dei ligandi e degli EPER con le loro scorte e le loro concentrazioni finali è riportato nelle tabelle 1 e nella tabella 2. Sia i ligandi che gli EMM sono tipicamente utilizzati alla più alta concentrazione della gamma raccomandata dal produttore che suscita un effetto biologico nei saggi di coltura standard di 2 giorni. Maneggiare le proteine delicatamente e in armadietti di biosicurezza sotto il flusso laminare per evitare la contaminazione.
- Incubare fiale con dondolo delicato a RT per 1 h. Non vortice proteine in quanto ciò può causare loro la denatura.
- Proteine aliquote per lo stoccaggio a lungo termine in modo che tutti gli usi siano monouso solo per evitare la degradazione con cicli di congelamento/scongelamento ripetuti. Conservare le proteine lofilizzate a -80 gradi centigradi (se non diversamente specificato) fino a quando necessario. Fare attenzione a raccogliere tutti i metadati per riferimento futuro, ad esempio: (i) nome della proteina, (ii) data preparata, (iii) numero di lotto/batch, (iv) fornitore, (v) numero di catalogo, concentrazione (vi), volume (vii) e (viii) preparatore.
- Preparare il buffer diluente contenente 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2 e sterilizzare il filtro. Mantenere questo buffer sterile e memorizzare in RT.
- Preparare il buffer di colorazione contenente 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2e 0,02% NaN3 in pbx (Phosphate-buffered). Filtrare e conservare a 4 gradi centigradi.
2. Preparazione di una piastra sorgente ECM
- Rimuovere gli stock di proteine ECM da stampare e scongelare sul ghiaccio. Registrare tutti i numeri di lotto per il rilevamento dei metadati.
- I tubi di proteine scongerate pulivano delicatamente per garantire una corretta sospensione e spin giù in una centrifuga.
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Crea miscele di stampa ECM (EPM) e un fiduciario fluorescente da utilizzare da un robot a movimentazione liquida che creerà le lastre casuali di 384 pozze.
NOTA: Le lastre di origine 384-well verranno utilizzate da una stampante di serie di pin touch per creare gli array stampati in 8 lastre ben.
- Etichettare i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml per ogni EPM e fiduciario.
- Preparare ogni EPM combinando 125 l di buffer diluente (vedere il punto 1.4) con il volume appropriato del brodo ECM e portare la miscela fino a un volume totale di 250 gradi con PBS. Le concentrazioni finali in ogni tubo EPM saranno 1x proteina ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol e 100 mM Tris.
- Preparare un fiduciario fluorescente sciogliendolo nell'appropriato buffer specificato dal produttore e trasferire 250 l in un tubo fiduciario etichettato.
3. Creazione della piastra di origine utilizzando un gestore di liquidi
- Progettare un layout a lamiera a 384 pozze che perlizzi le posizioni degli ECC ed è ottimizzato per la testa del pin della stampante di array utilizzata. Progettare il posizionamento del fiduciario in modo che venga stampato nella riga 1, colonna 1 posizione di ogni bene per facilitare l'orientamento della matrice.
NOT: Per garantire dati affidabili, vengono utilizzati un totale di 14-15 repliche di ogni ECM. Includere repliche aggiuntive di collagene o di un altro ECM che produce un robusto attaccamento per la valutazione dell'uniformità della legatura. Il layout potrebbe dover utilizzare più lastre di 384 pozze a seconda del numero di ECC di interesse.
- Trasferire i tubi EPM a un gestore liquido, mantenendo i tubi a 4 gradi centigradi con un rack di tubi raffreddati o utilizzando un robot per la movimentazione del liquido situato in una stanza fredda.
- Utilizzando il software del gestore liquido, eseguire un programma per trasferire 15 l- di ogni EPM e il fiducialo ai pozzi predesignati all'interno delle 384-well targhe di origine.
- Pipet PBS in qualsiasi pozzi inutilizzati per aumentare l'umidità e proteggere contro la disidratazione durante il processo di stampa.
NOT: Vedere Figura 2 per un esempio di un set di piastra di origine 384-well che è ottimizzato per una testa di pin 4 x 7 e include un collagene I blocco e PBS.
- Sigillare le lastre e tenere a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la stampa.
4. Stampa meMBR utilizzando un robot di stampa array
NOT: La parte seguente del protocollo descrive specificamente la preparazione e l'uso di MEMA per studiare l'impatto di diverse proteine microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule MCF7. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare diversi ligando, EMM e cellule per studiare altre linee cellulari e punti finali di interesse.
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Utilizzando una stampante touch pin, stampare EPM e punti fiduciari in 8 lastre di pozzo. Stampare più repliche di ogni condizione ECM per garantire la riproducibilità.
NOTA: per ottenere una formazione ottimale dei punti è possibile utilizzare altri formati di lamiera o diapositive, ma potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione del buffer per ottenere una formazione ottimale dei punti.
- Stampare gli ECU per il MEMA utilizzando perni di 350 m di diametro disposti in una configurazione della testina di stampa 4 x 7. Stampare le matrici nelle lastre 8-well come 20 colonne per 35 righe, per un totale di 700 punti. Array più grandi sono possibili in queste piastre, ma sono dotati di un compromesso di maggiori effetti di bordo sia in legare cellulare e colorazione.
- Dopo la stampa, conservare le lastre in un desiccatore per un minimo di 3 giorni prima dell'uso.
5. Creazione di piastre di trattamento ligando
- Progetta un layout a lamiere da 96 po' che include i ligandi di interesse. Per facilitare il trattamento di molte piastre MEMA contemporaneamente, progettare questa piastra con spaziatura che consente l'uso di un tubo multicanale con 4 punte distanziate per trasferire liquidi tra i pozzi di 8-well MEMA e una piastra di 96 pozzetti.
NOT: In questo protocollo viene utilizzato il set completo di ligandi elencati nella tabella 2.
- Scongela i ligogi sul ghiaccio. Brevemente scorrere e girare verso il basso ogni tubo.
- Diluire i ligandi a un magazzino di lavoro 200x utilizzando il buffer consigliato dal produttore (in genere PBS).
- Tubo 10 l di ogni 200x ligand brodo nel pozzo corrispondente all'interno della piastra 96-pozze.
- Sigillare e conservare le piastre a -20 gradi centigradi.
NOT: Crea piastre di trattamento del ligando in lotti, catturando tutti i metadati per l'analisi a valle.
6. Coltivare le cellule sulle MEMA
- Bloccare meME per 20 min con 2 mL per pozzo di buffer di blocco non incrostato contenente 1% agente di blocco non incrostazione (Tabella dei materiali) in acqua a doppia distillazione (ddH2O).
- Aspirati buffer di blocco e triplo risciacquo pozzi con PBS. Per evitare l'idratazione, lasciare il volume finale di PBS in pozze fino a quando non è pronto per la placcatura cellulare.
NOT: È estremamente utile avere due bench worker per le fasi di coltura cellulare sulle MEMA. Un banco può eseguire passaggi di aspirazione, mentre il secondo esegue passaggi di addizione. Si consiglia di utilizzare un pipet multicanale da 1 mL con punte distanziate per abbinare la piastra di 8 pozzetti per la pipettatura e uno splitter Y con due pipette Pasteur per aspirare più pozzi contemporaneamente.
- Seme 2 x 105 cellule MCF7 per pozzo in 2 mL del mezzo medio di Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
NOT: Prima di un esperimento MEMA completo, eseguire un esperimento di titolazione cellulare per ottimizzare il numero di celle in modo che i punti MEMA abbiano numeri di cella elevati (ma non siano confluenti) alla fine della durata sperimentale desiderata.
- Dopo 2-18 h di adesione, aspirare medio e sostituire con 2 mL di mezzo a crescita ridotta (DMEM con 0.1% FBS).
NOT: Siero ridotto (ad esempio, 0,1% FBS) o condizioni di esaurimento del fattore di crescita in questo momento può essere utilizzato per isolare l'impatto stimolatore di specifici ligandi.
- Scongelare una piastra di trattamento del ligando sul ghiaccio. Centrifuga scongelata piastra a 200 x g per 1 min.
- Trasferire 200 l di mezzo da ogni pozzo nella piastra di coltura al pozzo appropriato nella piastra di trattamento. Pipet su e giù per mescolare il volume di ligando con medio e trasferire questa miscela di nuovo al pozzo appropriato nella piastra MEMA.
- Roccia leggermente a mano e riportando le lastre MEMA all'incubatrice. Coltura per la durata dell'esperimento in presenza della combinazione ligand/ECM a 37 e 5% di CO2.
NOT: Un tipico esperimento MEMA dura 72 h; esperimenti di maggiore durata possono richiedere la sostituzione del mezzo e il ritrattamento con legamento.
- Pulse MEMA pozzi a 71 h con 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) per una concentrazione finale di 10 M. Incubare in condizioni sperimentali con EdU per 1 h a 37 s C e 5% CO2.
NOT: Altri trattamenti con cellule vive possono anche essere utilizzati in questo momento.
7. Fissaggio e colorazione delle MEMA
- Dopo 72 h e tutti i trattamenti a cellule vive, aspirate pozzi. Fissare MEMAs in 2 mL per pozzo di 2% paraformaldeide (PFA) per 15 min a RT.
- AspiraTo PFA. Permeabilizzare con 2 mL per pozzo dello 0,1% surfactant nonionico per 15 min.
- Aspirata il surfactant nonionico e lavare con 2 mL per pozzetto di PBS. PbS di Aspirate. Lavare con 2 mL di PBS con 0,05% di polisoromatto 20 (PBS-T).
NOT: La superficie MEMA è idrofobica, e il mancato lavaggio con PBS-T prima dell'incubazione di macchie e anticorpi comporterà la formazione di vuoti nei pozzi durante le fasi di incubazione e darà origine a manufatti di colorazione.
- Aspira TOPB-T. Aggiungere reagenti di reazione di rilevamento EdU. Incubare per 1 h a RT, a dondolo e protetto dalla luce. Dopo 1 h incubazione, spegnire la reazione con il buffer di slittamento commerciale fornito.
NOT: Il rilevamento EdU e la colorazione/anticorpo possono essere eseguiti in 1,5 mL per pozzo per ridurre i costi.
- Aspirare il tampone di tintura e lavare con PBS-T prima dell'incubazione con macchie o anticorpi.
- Incubare pozzi MEMA con anticorpi contro l'istone H3K9me3 (1:1,000) e fibrillarin (1:400) in buffer di colorazione contenente 2% (w/v) siero albumina bovina (BSA), 1 mM MgCl2 e 0.02% NaN3 per la notte a 4 gradi centigradi.
NOT: Eseguire titrations anticorpale per determinare le concentrazioni ottimali prima di utilizzarle su un set MEMA completo.
- Dopo l'incubazione primaria di anticorpi o macchie, lavare i pozzi 2x con PBS e una volta con PBS-T.
- Aggiungere gli anticorpi secondari (IgG anti-tono d'asino e IgG anti-coniglio d'asino, entrambi 1:300) e 0,5 g/mL 4' 6-diamidino-2-fenillindole (DAPI). Incubare per 1 h a RT al buio.
- Lavare i pozzi 2x con 2 mL per pozzetto di PBS, lasciandoli negli ultimi 2 mL PBS.
- Procedere con l'imaging o conservare i MEMA macchiati per l'imaging successivo in PBS a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
8. Imaging di MEMA
- Immagine MEMA su un sistema di imaging automatizzato con canali di rilevamento fluorescente appropriati.
- Output dei dati immagine risultanti in un sistema di gestione delle immagini. Segmentare le celle e calcolare i livelli di intensità utilizzando CellProfiler8.
9. Analisi dei dati
NOT: L'analisi dei dati consiste nella normalizzazione, nella correzione delle variazioni e nel riepilogo dei dati derivati di CellProfiler non elaborati. In questo caso, l'ambiente R con codice personalizzato viene utilizzato per eseguire tutti i passaggi. Tuttavia, qualsiasi ambiente statistico o programma software può essere utilizzato per eseguire le azioni equivalenti. Un esempio del codice personalizzato open source per l'ambiente R per l'analisi è disponibile all'indirizzo: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Pre-elaborare e normalizzare i dati immagine segmentati.
- Determinare il numero di cellule spot utilizzando i nuclei macchiati DAPI.
- Intensità EdU auto-gate per etichettare le celle come EdU. Misurare la proliferazione utilizzando la proporzione di cellule EdU in ogni punto.
- Mediani riassumono le macchie citoplasmatiche e le misurazioni della morfologia nucleare a livello spot.
- Eseguire la rimozione della normalizzazione delle variazioni indesiderate (RUV) sui dati per migliorare la qualità dei dati9.
NOT: Questo approccio viene applicato a ogni segnale di intensità e morfologia in modo indipendente come matrice con matrici che utilizzano le righe e le macchie come le colonne come descritto in precedenza9.
- Applicare la normalizzazione di bivariate loess ai residui normalizzati RUV utilizzando la riga della matrice e la colonna della matrice come variabili indipendenti per correggere gli effetti spaziali o correlati all'intensità.
- Una volta completata la normalizzazione, la mediana riepiloga le repliche per ogni condizione di microambiente per la creazione di report e un'ulteriore analisi.