Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Negli ultimi 30 anni, il selvaggio-tipo adenoassociati sono stati progettati per creare vettori AAV ricombinanti, che hanno dimostrato di essere eccezionalmente utili strumenti per il trasferimento genico nei CNS^{1,2,3,4, 5,6} e la terapia genica si avvicina a malattia (comprese le terapie approvate da FDA ed EMA)^4,7. Loro idoneità all'uso nello SNC deriva in gran parte dalla loro capacità di infettare le cellule post-mitotiche, divisione, in genere trovato nel CNS⁸. Tuttavia, vettori AAV-based hanno anche il vantaggio di permettere un'espressione a lungo termine di qualsiasi determinato transgene terapeutico^4,9 mentre indurre una risposta immunitaria più mite rispetto ad altri vettori virali^{7, 8,10,11,12}.

Gli elementi principali di qualsiasi vettore AAV sono il genoma e le proteine del capside. Selvaggio-tipo adenoassociati sono singolo filamento (ss) virus a DNA con un genoma di circa 5 kilobasi (kb)¹³. Per la produzione di vettori AAV ricombinanti, i geni rep e cap (necessari per la replica di genoma e l'assemblaggio del capside virale) vengono eliminati dal genoma di AAV il selvaggio-tipo e forniti in trans, lasciando spazio per un Cassetta di espressione contenente il transgene^14,15. Le sequenze ripetizione terminale invertite (ITRs) del genoma virale originale sono gli unici elementi conservati in un vettore AAV, come questi sono essenziali per la replica e imballaggio^3,10,14. Vettori di AAV possono essere progettati per migliorare l'espressione del transgene; una mutazione in uno dei ITRs conduce alla formazione di un ciclo di tornante efficacemente consente la generazione di un complementare DNA strand^3,7,15. Il principale vantaggio di questa configurazione, definito un genoma di self-complementari (sc), è che ignora la necessità di sintesi secondo-filo tipica del ciclo convenzionale di AAVs, aumentando considerevolmente la velocità e i livelli di espressione del transgene ¹. Tuttavia, l'utilizzo di un genoma di scAAV riduce la capacità di carico del vettore di circa 2,4 kb. Questo include sequenze di transgene, nonché eventuali sequenze regolatrici come promotori o siti di legame per microRNA, per limitare l'espressione a cella specifica tipi¹⁶.

Le proteine del capside AAV determina l'interazione tra cellula di vettore-ospite e conferisce un grado di tropismo di tessuto o tipo di cella per un sierotipo AAV, che può essere sfruttato anche per limitare l'espressione del transgene in posizioni specifiche. Diversi sierotipi AAV si trovano in natura, mentre gli altri sono stati prodotti nei laboratori attraverso approcci ricombinanti (cioè, PHP. B). Inoltre, alcuni capsidi conferiscono anche altre caratteristiche utili, quali la capacità di attraversare la BBB, conseguente la consegna di transgeni in tutto il sistema nervoso centrale dopo somministrazione sistemica. Ciò è stato dimostrato per AAV9, così come per il PHP recentemente descritto. B capside¹⁷. Di conseguenza, questi sierotipi stanno dimostrando di essere particolarmente rilevante per nuovi approcci di terapia genica per i disordini di neurodegenerative^1,17,18.

L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere un metodo conveniente per la produzione su piccola scala di vettori AAV con alto titolo e purezza. Anche se i risultati presentati qui utilizzano il PHP. Capside di B e una cassetta di espressione scAAV, il protocollo è adatto per la produzione di diversi sierotipi di vettore AAV e configurazioni di genoma, permettendo la massima flessibilità sperimentale. Tuttavia, il vettore resa e purezza finale può variare secondo il sierotipo selezionato.

Il protocollo stesso è una variante del metodo classico tri-transfezione per la produzione di vettori virali e incorpora l'uso di un gradiente di iodixanol per vettore pulito-up, che, rispetto all'uso classico di gradienti di cesio cloruro (CsCl), è stato segnalato per produrre vettori AAV di purezza superiore a in un modo più efficienti in termini di tempo, il^19,20,21.

I passaggi di transfezione, la purificazione e la concentrazione sono destinati a essere eseguiti secondo buona pratica di laboratorio (BPL) in un laboratorio di cultura del tessuto voto per il lavoro di vettore virale. Ogni attività deve essere eseguita in conformità con la legislazione locale e nazionale riguardante la produzione di vettori virali e utilizzare. Lavori devono essere eseguiti sotto cappa a flusso laminare e in condizioni di sterilità. All'interno della struttura di vettore, si raccomanda di indossare un grembiule di laboratorio, oltre al cappotto del laboratorio di coltura del tessuto normale. Inoltre, una doppia coppia di guanti, come pure Copriscarpe plastica, deve essere indossata in ogni momento.

Prima di iniziare la produzione di vettore, garantire tutte le attrezzature necessarie e plasmidi sono disponibili. 1) pCapsid plasmide contiene il gene rep che codifica quattro proteine non strutturali necessari per la replica, vale a dire Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 e il tappo gene che codifica per tre proteine strutturali del capside, vale a dire VP1, VP2 e VP3. 2) pHelper plasmide contiene i geni E4, E2Ae VA da adenovirus, che facilitano la produzione di AAV in HEK293T cellule. 3) pTransgene plasmide contiene la cassetta di espressione del transgene, affiancata da due ITRs. Questi plasmidi possono essere sintetizzati de novo in laboratorio utilizzando sequenze disponibili online²². Per plasmidi fatti de novo, soprattutto quelli contenenti romanzo transgeni, sequenziamento è necessario assicurarsi che il transgene e ITRs siano corretti. In alternativa, premade plasmidi possono essere acquistati direttamente attraverso il repository online plasmide. Quando necessario, plasmidi possono essere amplificati e purificati mediante kit standard, secondo istruzioni^{23 del produttore}.

Titolo di vettore e purezza possono influenzare negativamente la capacità di trasduzione del vettore. Protocolli aggiuntivi sono forniti per valutare la qualità del prodotto vettore. I vettori finali sarà utili per gli studi della funzione cella CNS in applicazioni sia in vitro che in vivo .

Tabella 1: Composizione delle soluzioni necessarie.

1. Tri-transfezione delle cellule HEK293T

Nota: Per la composizione del buffer e le soluzioni utilizzate nel protocollo, fare riferimento alla tabella 1 .
Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo dura circa 4 giorni.

1. Scongelare una fiala di cellule 293T cellule embrionali umane del rene (HEK) in un bagno di acqua a 37 ° C.
   Nota: Utilizzare solo le celle che sono state attraversate in meno di 20 x per garantire efficienza di trasfezione ottimale.
2. Cellule di HEK293T seme ad una densità di 2 x 10³ 6 x 10³ cellule/cm² in DMEM10 in piastre di coltura cellulare diametro 15cm.
3. Crescere le cellule a confluenza di 70 – 80% in un incubatore standard impostato a 37 ° C, con 95% umidità e 5% CO₂.
   Nota: La produzione di un lotto di vettori AAV utilizzando questo protocollo richiede 18 piastre di coltura delle cellule (15 cm di diametro). Una confluenza di cella di 70-80% corrisponde a 6 x 10³ a 7 x 10³ cellule/cm², mantenuto in 17 – 20 mL di terreno di coltura di DMEM10.
4. Preparare polyethylenimine (PEI) / DNA mix ad un rapporto di concentrazione di 1/3.5 (w/w).
   1. Preparare il mix di DNA per 18 piastre di coltura di cellule in una provetta conica da 50 mL con 360 µ g di 180 µ g di pTransgene in 18 mL di NaCl 150 mM, 180 µ g di pCapsid e pΔF6.
   2. Distribuire la miscela di DNA tramite tre provette coniche da 50 mL (6 mL di DNA mescolare a tubo conico).
   3. Preparare la miscela di PEI per sei delle cellule piastre di coltura in una nuova provetta conica 50 mL di miscelazione 840 µ g di PEI (1 µ g / µ l) in 6 mL di NaCl 150 mM.
   4. Preparare la miscela di PEI/DNA aggiungendo 6 mL della miscela PEI (preparata al punto 1.4.3), goccia a goccia, a uno dei tubi conici contenenti il mix di DNA (preparato al punto 1.4.2) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
      Nota: Dopo 20 minuti di incubazione, la miscela di PEI/DNA diventerà leggermente torbida.
5. Prendere sei piastre di coltura delle cellule fuori dell'incubatrice ed aspirare completamente il mezzo da ogni piatto di cultura in una cappa a flusso laminare. Rimuovere le tracce del mezzo lavando i piatti con 5 mL di soluzione tampone fosfato di preriscaldati Dulbecco (DPBS).
6. Garantire la distribuzione di DPBS su tutta la superficie inclinando leggermente il piatto.
7. Delicatamente aspirare il DPBS e aggiungere 12 mL di DMEM1 ad ogni piatto.
   Nota: Evitare di staccare le cellule aggiungendo lentamente, il mezzo da una pipetta collocata al bordo del piatto.
8. Mescolare il PEI/DNA pipettando su e giù per 3x - 5x. Aggiungere 2 mL della miscela PEI/DNA per ciascuno dei sei celle cultura piatti in modo goccia a goccia, distribuendola accuratamente su tutta la superficie. Una volta che la miscela viene aggiunto a ogni piatto, posizionare i piatti indietro nell'incubatore. Ripetere i passaggi 1.4.3– 1.8 per i restanti piatti di cultura.
9. Incubare le cellule trasfettate per 5 h a 37 ° C, con umidità 95% e 5% CO_2.
10. Aggiungere un ulteriore 12 mL di DMEM10 ad ogni piatto di cultura senza rimuovere il supporto pre-esistente (volume medio totale = 25 mL).
11. Incubare le cellule trasfettate alto per la post-transfezione 72 h a 37 ° C, con 95% umidità e 5% CO₂.

Complementare figura 1: morfologia delle cellule HEK 293T visualizzata da microscopia di contrasto fase (a sinistra), con conferma di espressione di GFP visualizzata tramite fluorescenza imaging (a destra). (A) riuscita transfezione delle cellule HEK293T con un pTransgene di GFP-codifica è confermata da formazione immagine di fluorescenza. (B) HEK293T cellule trattate esclusivamente con reagenti di transfezione non mostrano alcuna espressione di GFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

12. Raccogliere il mezzo e la post-transfezione di 72h di cellule. Utilizzare un raschietto di cella per scollegare attentamente le cellule dalla piastra di coltura. Raccogliere il mezzo e le cellule in una provetta conica da 50 mL tenuta su ghiaccio.
    Nota: Il contenuto di due piastre di coltura delle cellule possa essere raccolti in una provetta conica singolo 50 mL. Alla fine di questo passaggio, ciascuna delle nove provette conterrà circa 50 mL di terreno.
13. Centrifugare le provette coniche a 420 x g per 10 min a 4 ° C con l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga impostata al massimo.
14. Attentamente e scartare il surnatante da ciascuna provetta. Non usare pipette per prevenire la perdita di materiale. Invece, delicatamente versare il surnatante in un contenitore di smaltimento dei rifiuti e posizionare le provette contenenti il pellet cellulare torna sul ghiaccio.
15. Risospendere ogni cellulare in 2 mL di tampone di Lisi direttamente nella provetta conica 50 mL pipettando su e giù per 5 – 10 volte. Non centrifugare. Piscina i lisati da tre tubi insieme.
    Nota: A questo punto, ci saranno tre provette coniche da 50 mL, contenenti ciascuna una mL 6 delle cellule del sedimento in tampone di lisi.

2. purificazione di vettore AAV

Nota: Le prestazioni di questa sezione protocollo prende circa 1 giorno. Eseguire le seguenti operazioni simultaneamente su ogni le tre provette coniche da 50 mL contenente le cellule risospese in tampone di lisi (vedere nota precedente).

1. Congelare e scongelare le cellule sedimento 3 x per lisare loro e rilasciare le particelle AAV. Eseguire il passaggio di congelamento inserendo i tubi in un secchio contenente ghiaccio secco mescolato con etanolo. Eseguire lo scongelamento mettendo immediatamente le cellule in un bagno di acqua a 37 ° C.
2. Dopo la terza fase di scongelamento, centrifugare a 1.167 x g per 15 min a 4 ° C.
   Nota: Si formerà un evidente pellet composto da detriti cellulari. Quando si maneggiano i tubi, evitare movimenti bruschi come questi possono causare il distacco del pellet nel surnatante, che comprometterà la purezza del vettore finale.
3. Trasferire con cautela i surnatanti per pulire provette coniche da 50 mL e quindi aggiungere nucleasi a ciascuna provetta, ad una concentrazione finale di 50 U/mL di surnatante.
4. Incubare per 30 min a 37 ° C. Agitare le provette coniche da 50 mL a mano ogni 10 min per garantire che le nucleasi è ben amalgamata con il surnatante.
5. Chiarire il surnatante mediante centrifugazione a 13.490 x g per 20 min a 4 ° C.
6. Montare un filtro da 0,45 µm una siringa da 10 mL e posizionarlo sopra un tubo conico pulito 50 mL. Rimuovere lo stantuffo con cautela e riempire la siringa con il surnatante da passo 2.5.
7. Usare lo stantuffo per forzare il lisato attraverso il filtro. Utilizzare un nuovo filtro e la siringa per ogni tubo del surnatante ottenuto nel passaggio 2.5.
   Nota: La frazione ottenuta è nota come 'greggio lisato'.
8. Preparare ciascuna delle frazioni iodixanol 15%, 25%, 40% e 60% in quattro provette coniche da 50ml separati, secondo le istruzioni riportate nella tabella 1.
9. Preparare le pendenze di iodixanol in tre tubi di ultracentrifugazione utilizzando il seguente ordine di frazioni di iodixanol: 8 mL di iodixanol di 15%, 5,5 mL di iodixanol di 25%, 5 mL di iodixanol di 40% e 4,5 mL di iodixanol di 60%.
   Attenzione: Iodixanol può causare irritazione agli occhi, la pelle e i tratti gastrointestinali e respiratorie. Durante la manipolazione di iodixanol, indossare guanti e lavorare sotto cappa a flusso laminare.
   1. Pipettare 8 mL di 15% iodixanol in ogni provetta ultracentrifugazione.
   2. Pipettare 5,5 mL di soluzione al 25% di iodixanol in un tubo conico di pulito 50 mL (Figura 1A).
   3. Utilizzare una pipetta di Pasteur non graduata (come il collo del tubo ultracentrifugazione è troppo stretto per pipette graduate convenzionale) per dosare attentamente 5,5 mL della soluzione di iodixanol di 25% di sotto del 15% iodixanol soluzione (Figura 1B).
      Nota: Questo può essere raggiunto con successo aggiungendo il iodixanol in tre fasi, dal momento che la pipetta di Pasteur può contenere solo circa 2 mL.
   4. Aggiungere le soluzioni di iodixanol 40% e 60% come descritto nel passaggio 2.9.3. Non disturbare le interfacce diverse iodixanol durante la stratificazione.
      Nota: La corretta preparazione delle frazioni differenti iodixanol può essere assicurata dalla conferma visiva grazie il rosso fenolo aggiunto per le frazioni di iodixanol (vedere le istruzioni riportate in tabella 1). Dal momento che ogni frazione ha una densità specifica, verrà non intermix durante la fase di stratificazione, se viene eseguita correttamente (Vedi Figura 1).
10. Strato il greggio lisato sopra il gradiente di iodixanol di 15% con una pipetta Pasteur. Procedere goccia a goccia per non disturbare l'interfaccia tra il greggio lisato e la soluzione di iodixanol.
11. Riempire il tubo di ultracentrifugazione con buffer di lisi finché il menisco raggiunge la base del collo del tubo per garantire che il tubo non crollare sotto le altissime forze generate durante l'ultracentrifugazione (Figura 1).
12. Chiudere i tubi di ultracentrifugazione utilizzando coperchi appropriati. Utilizzare una bilancia digitale per assicurarsi che tutti i tre tubi di ultracentrifugazione hanno lo stesso peso. Se necessario, regolare il peso, aggiungendo più buffer di lisi in cima il 'lysato grezzo'.
    Nota: La differenza di peso tra i tubi di ultracentrifugazione deve essere inferiore a 0,1 g per garantire il funzionamento sicuro dell'ultracentrifuga. Ultracentrifughe sono potenzialmente pericolosi pezzi di attrezzatura e devono essere utilizzati solo da personale adeguatamente addestrato.
13. Centrifugare le provette a 301.580 x g, utilizzando un rotore ad angolo fisso titanio, per 1 h e 40 min a 12 ° C, utilizzando la massima velocità di accelerazione e decelerazione.
14. Inserire delicatamente un ago smussato in acciaio inox al 40% e 60% iodixanol interfaccia.
    1. Inserire l'ago di una siringa da 5 mL (Figura 1E).
    2. Aspirare solo la frazione chiara, contenente le particelle di vettore.
       Nota: Il volume totale raccolto è di circa 2,5-3 mL. Evitare la raccolta di materiale dall'interfaccia 25 – 40%, dato che ciò consentirà di aumentare il livello di contaminazione del batch di vettore finale, a causa della presenza di proteine non auspicabile.
    3. Elaborare la frazione raccolta (desalificazione e concentrazione) o conservarlo durante la notte a 4 ° C.

Figura 1: installazione per iodixanol gradiente purificazione e accumulazione di vettore successivo. (A) prima di pipettaggio le pendenze di iodixanol diversi nella provetta ultracentrifugazione, Pipettare un adeguato volume di ogni soluzione di iodixanol in un tubo conico separato. (B) quindi utilizzare un Pasteur pipetta di trasferire in sequenza ogni soluzione di iodixanol per il tubo di ultracentrifugazione: strati di una concentrazione di iodixanol sempre più alta devono essere aggiunto nella parte inferiore del tubo sotto i layer precedenti. Strato (C) il vettore grezzo lisato sulla parte superiore una volta la sfumatura è stato preparato. Questo sistema di raccolta del vettore non utilizza aghi taglienti, che presentano un rischio di ' ferite '. (D), una in acciaio inox 316-siringa ago viene inserito attraverso il gradiente di iodixanol fino all'interfaccia di iodixanol di 40/60%. (E) Vector particelle si trovano nella fase di iodixanol di 40% e sono raccolti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. la dissalazione e la concentrazione del vettore AAV

Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo impiegano circa 2 ore.

1. Sciacquare il filtro a membrana del filtro centrifugo aggiungendo 5 mL di 1X PBS-MK e centrifugare per 5 min a 4.000 x g.
2. Aggiungere 5 mL di 1X PBS-MK per la frazione di vettore AAV raccolta, mescolare e poi aggiungere il volume totale per il filtro. Con l'aggiunta di 1X PBS-MK, torbidità è osservato. Centrifuga a 4.000 x g fino a quando il volume presente sul filtro a cono è stato ridotto a 1 mL. Scartare il flusso continuo accumulato nel tubo di raccolta esterna.
3. Aggiungere 13 mL di 1X PBS-MK per il filtro a cono e ripetere la centrifugazione passo tante volte quanto necessario (minimo x 3), finché non ci è nessuna torbidità più osservata quando fresco 1X PBS-MK è aggiunto.
4. In finale lavare passaggio, aggiungere 13 mL di PBS + 0,01% (v/v) di tensioattivo non ionico e centrifugare a 4.000 x g , fino a quando il volume è ridotto a 300 – 350 µ l.
5. Raccogliere la restante frazione presente sul filtro pipettando il volume intero in una provetta sterile costeggiava microcentrifuga.
   Nota: Questa frazione contiene il vettore AAV dissalato e concentrato. Nei passaggi seguenti del presente protocollo, questa frazione è denominata la frazione 'primaria'. Assicurarsi di gestire il tubo sotto il cofano e conservare a 4 ° C.
6. Risciacquare il filtro con 200 µ l di 1 x PBS-MK per raccogliere le particelle di vettore residuo trattenute sul filtro. Raccogliere in una microcentrifuga sterile.
   Nota: Si tratta di uno stock di vettore diluito, che può essere adatto per alcune applicazioni che richiedono i titoli più bassi di vettore. In futuri passi, questa frazione è denominata la frazione 'secondaria'.
7. Per lo stoccaggio a breve termine, archiviare il vettore fraction(s) a 4 ° C (meno di 2 settimane). Aliquotare e archivio il vettore a ‑ 20 ° C quando il deposito a lungo termine è necessario.
8. Eseguire il controllo di qualità come descritto nella sezione 4.

4. titolazione del vettore da reazione a catena della polimerasi quantitativa

Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo prende circa 3 h.

1. Curva standard
   1. Linearizzare il plasmide di espressione del transgene (pTransgene) utilizzato per la transfezione delle cellule HEK 293T nella sezione 1.
   2. Preparare la miscela di digest di restrizione in una microcentrifuga 0,5 mL (fare riferimento alla tabella 2 per la composizione del mix di digest di restrizione).
      Nota: Regolare la composizione del mix del digest restrizione secondo l'enzima utilizzato e le relative linee guida dal produttore.
   3. Incubare il mix di digest di restrizione per 1h a 37 ° C.
   4. Controllare l'efficienza della digestione restrizione eseguendo il plasmide linearizzato su gel di agarosio 0.8% (p/v) a 100 V per digestione completa di 1 h. del plasmide dovrebbe produrre un singolo frammento di dimensione definita.
   5. Purificare il plasmide lineare DNA utilizzando un kit di purificazione di PCR, seguito istruzioni²⁴, del produttore e misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro misurando l'assorbimento a 260 nm. Dopo la titolazione, conservare la restante aliquota del plasmide lineare a ‑ 20 ° C per un ulteriore uso.
   6. Calcolare le molecole (cioè copie di DNA) dello stock del plasmide per microlitro come segue.
      1. In primo luogo, calcolare il peso molecolare del plasmide. Supponendo che il peso medio di una coppia di basi (bp) di DNA è 650 Dalton (Da) e che una mole di un bp pesa 650g, si possono stimare il peso molecolare di qualsiasi modello di DNA double-stranded prendendo il prodotto della sua lunghezza (in bp) e il peso per coppia di basi.
         Peso molecolare di plasmide [g/mol] = dimensione del plasmide [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Successivamente, calcolare il numero di moli del plasmide per microlitro.
         Talpe del plasmide per microlitro = concentrazione di plasmide [g / µ l] / plasmide peso molecolare [g/mol]
         Nota: L'inverso del peso molecolare è il numero di moli del plasmide presente in 1 g di materiale.
      3. Quindi, calcolare il numero di molecole di plasmide per microlitro, utilizzando il numero di Avogadro (6.022 x 10²³ molecole/mole).
         Molecole del plasmide per microlitro = talpe del plasmide per microlitro [talpe / µ l] x numero di Avogadro [molecole/mole]
      4. Infine, diluire lo stock di plasmide (molecole / µ l) per ottenere un 100 µ l di soluzione con la concentrazione di 1 x 10⁹ molecole (vettore genomi (vg) per microlitro) desiderata.
         Stock di plasmide (100 µ l) = (concentrazione desiderata [molecole / µ l] x 100 µ l) / molecole plasmide [molecole / µ l]
   7. Effettuare diluizioni seriali dello stock del plasmide (1 x 10⁹ vg / µ l) in triplici copie:
      10 µ l di brodo di plasmide vg / µ l di 1 x 10⁹ + 90 µ l di H₂O = 1 x 10⁸ vg / µ l soluzione
      10 µ l di diluizione di 1 x 10⁸ vg / µ l + 90 µ l di H₂O = 1 x 10⁷ vg / µ l soluzione
      10 µ l di diluizione di 1 x 10⁷ vg / µ l + 90 µ l di H₂O = 1 x 10⁶ vg / µ l soluzione
      10 µ l di diluizione di 1 x 10⁶ vg / µ l + 90 µ l di H₂O = 1 x 10⁵ vg / µ l soluzione
      Continuare ottenere una soluzione di 1 x 10¹ vg / µ l.
   8. Mantenere le diluizioni seriali dello stock standard plasmide su ghiaccio fino al loro caricamento sul piatto qPCR (vedere paragrafo 4.3).

Tabella 2: Composizione mix restrizione del digest.

Tabella 3: calcolatore di volume del plasmide Stock. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Estrazione del DNA dal vettore AAV
   1. Mescolare 2 µ l dell'AAV vector stock (la frazione primaria dal punto 3.5) con 198 µ l della dnasi I buffer (1x) in tubi in striscia (provette per PCR) e aggiungere 2 µ l di dnasi I.
      Nota: Dnasi che si degrada qualsiasi materiale genetico che non è contenuto all'interno di un capside del vettore (che falserebbe i risultati qPCR). Questa soluzione è denominata diluizione 'dil1 x 10^-2'.
   2. Incubare per 30 min a 37 ° C, seguita da 10 min a 95 ° C.
      Nota: Il protocollo può essere interrotta a questo punto e il materiale può essere conservato a tempo indeterminato a 4 ° C, per evitare il deterioramento del prodotto.
   3. Aggiungere 2 µ l di proteinasi K per la soluzione di dil1 x 10^-2 (punto 4.2.1) e incubare per 60 min a 50 ° C, seguita da 20 min a 95 ° C.
      Nota: Questo passaggio sarà smontare il capside del vettore AAV e rilasciare il genoma di vettore AAV nella soluzione. Aggiungere proteinasi K in eccesso come il contenuto del campione proteico (capside) non è noto. Si noti che è essenziale per garantire che tutte le attività di proteinasi K viene rimosso dalla denaturazione, prima del qPCR, per evitare problemi di degradazione (parziale) della polimerasi che influenzano il risultato finale.
   4. 01:10 preparare diluizioni seriali della proteinasi K trattati dil1 x 10^-2 soluzione (punto 4.2.3) in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, come segue:
      10 µ l di dil1 x 10^-2 + 90 µ l di H₂O = diluizione dil1 x 10^-3
      10 µ l di dil1 x 10^-3 + 90 µ l di H₂O = diluizione dil1 x 10^-4
      10 µ l of dil1 x 10^-4 + 90 µ l di H₂O = diluizione dil1 x 10^-5
   5. Mantenere le diluizioni seriali di DNA estratto dal vettore sul ghiaccio fino al loro caricamento sul piatto qPCR (vedere paragrafo 4.3).
3. Titolazione di SYBR Green qPCR basati sul rilevamento
   1. Preparare il mix master qPCR in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, sia per il campione e gli standard. Utilizzare 10 µ l di SYBR Green Master Mix, 1 µ l di primer forward (stock di 10 µM), 1 µ l di primer reverse (stock 10 µM) e 3 µ l di H₂O per reazione. Vedi il protocollo nella tabella 4 per sequenze dell'iniettore.
   2. Pipettare il mix master qPCR su e giù, ma non centrifugare.
   3. Aggiungere 15 µ l di mix master qPCR, seguito da entrambi 5 µ l di curva standard preparata nella sezione 4.1 o il DNA estratto dal vettore AAV nella sezione 4.2, in ciascun pozzetto. Includono tre pozzetti contenenti solo il mix master della qPCR, come controllo negativo. Fare riferimento alla Figura 2 per il layout di piastra.
   4. Sigillare la piastra con una pellicola sigillante e centrifugare brevemente la piastra qPCR a 1.500 x g per 30 s a 4 ° C.
   5. Eseguire la reazione di qPCR su una piastra-base in tempo reale PCR amplificazione e rilevazione dello strumento, utilizzando le condizioni suggerite in tabella 5.

Tabella 4: Sequenze Primer progettate contro il promotore CBA.

Figura 2: layout di piastra per titolazione vettoriale basato su qPCR. I campioni sono a colori: verde = curva standard; Blu = H₂O controllo; grigio = frazione primario; arancione = frazione secondaria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 5: Protocollo termale in bicicletta per la titolazione di SYBR qPCR base verde.

4. Analisi dei dati per determinarne il titolo di vettore AAV
   1. Riempire le celle di dati del foglio di calcolo (tabella 6A) con i valori di Ct ottenuti per le diverse diluizioni del campione di riferimento preparati nella sezione 4.1 per generare una curva standard.
      Nota: Verrà mostrata l'equazione della curva standard (y = un ln (x) + b) insieme con l'efficienza di² R(tabella 6B). Una qPCR deve avere un'efficienza vicina al 100% e R² vicino a 1.0 (≥ 0,96).
   2. Utilizzare i valori calcolati di a e b per riempire le celle di dati corrispondenti nel foglio di calcolo (tabella 6).
   3. Completare il foglio di calcolo con i valori di Ct ottenuti per le diverse diluizioni del campione AAV preparato nella sezione 4.2.
   4. Calcolare il titolo di vettore AAV medio in genomi di vettore per microliter della frazione' primaria' utilizzando la seguente formula:
      
      Nota: il fattore 400 è utilizzato per singoli incagliati genomi, mentre genomi sc utilizzano un fattore di moltiplicazione di 200²⁵. In realtà, come quantità di DNA doppio durante ogni ciclo di qPCR, sc che DNA è rilevato 2 x rispetto ad un genoma di ss. Lo scopo della titolazione consiste nel calcolare la concentrazione in termini di genomi di vettore per microlitro. Una correzione è necessaria per l'esecuzione la qPCR quando utilizzando 2 µ l di materiale (punto 4.2.1) di partenza. dil rappresenta i fattori di diluizione dal punto 4.2.4. Il titolo della 'secondario' frazione vettore AAV (punto 3.6) può essere calcolato simultaneamente.

Tabella 6: modello per l'analisi dei dati di qPCR. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

5. purezza controllo da SDS-PAGE e macchiatura d'argento

Nota: Le prestazioni di questa sezione del protocollo prende circa 5 h.

1. Utilizzare etanolo al 70% (v/v) per pulire accuratamente le lastre di vetro utilizzate per la colata di gel.
2. Assemblare il sistema di colata di gel. Garantire che i fondi delle lastre vetrate non sono scheggiati, per evitare perdite della miscela acrilammide nel cast del gel.
3. Preparare l'accatastamento e separano le soluzioni gel di risoluzione in due provette coniche da 50 mL. Omettere il tetrametiletilendiammina (TEMED) e il 10% (p/v) ammonio persolfato (APS), come essi sono responsabili per la polimerizzazione del gel. Aggiungerli immediatamente prima del getto il gel.
   Nota: La percentuale finale di acrilammide nel gel influenza il profilo di separazione delle proteine: in genere, una concentrazione finale di 10% (v/v) di acrilammide sarà sufficiente per testare la purezza di una preparazione di vettore AAV.
4. Miscelare delicatamente agitando il tubo contenente i componenti del gel. Non centrifugare, poiché l'ossigenazione eccessiva può compromettere la polimerizzazione.
5. Aggiungere TEMED e 10% (w/v) APS per la soluzione di gel di risoluzione. Mescolare e poi versare in titolare del gel fino a quando non raggiunge 1-2 cm sotto la parte superiore della piastra piccolo bicchiere.
6. Mettere uno strato di butanolo saturo d'acqua sulla parte superiore la miscela di acrilammide. In tal modo la formazione di una superficie piana durante la polimerizzazione. Non lasciare il gel sotto alcol per più di 30 min in quanto consente di disidratare il gel e compromettere il funzionamento.
   Attenzione: Butanolo è pericoloso in caso di contatto con la pelle. Presenta anche un rischio di incendio. Maneggiare con cura.
7. Attendere che il gel per polimerizzare e poi versare il butanolo. Suggerimento: Controllare per vedere se il mix di gel in eccesso nel tubo ha solidificato. Polimerizzazione si verifica in meno di 20 min. lavare la superficie del gel con H₂O e poi asciugare con asciugamani di carta, facendo attenzione a non per disturbare la superficie del gel.
8. Aggiungere TEMED e 10% (w/v) APS per il gel d'impilamento e versare il gel nel supporto gel sulla superficie del gel di separazione.
9. Posizionare il pettine fornito in gel. Eseguire questa azione con un movimento costante per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno dei pozzetti.
10. Attendere almeno 20 min per il gel di polimerizzare. Suggerimento: Controllare che se il gel in eccesso mix di tubo conico ha solidificato.
11. Preparare i due missaggi (tabella 7) per sia il primario e il secondario AAV vettore frazioni (punti 3.5 e 3.6, rispettivamente).

Tabella 7: Composizione delle miscele campione richiesto per la macchiatura d'argento.

12. Completamente denaturare le miscele campione di riscaldamento li per 5 min a 95 ° C. Montare il serbatoio di elettroforesi, prestando attenzione all'orientamento dell'elettrodo.
13. Riempire il serbatoio con 1x buffer di catodo all'interno dell'Assemblea dell'elettrodo e 1 x anodo tampone all'esterno.
    Nota: Anodo buffer può essere riciclato da run-to-run. Buffer di catodo fresco deve essere sempre utilizzato.
14. Rimuovere il pettine dal gel e pulire i pozzetti del gel con buffer di 1x catodo.
15. Caricare 1 µ l di scaletta della proteina in un pozzo. Caricare le miscele di campione in diversi pozzi sullo stesso gel (Figura 3). Esegua il gel a 50 V fino a quando i campioni immettere il gel di risoluzione. Quindi aumentare la tensione a 100 V fino a quando il fronte di tintura raggiunge il limite inferiore del gel.
16. Estrarre con cura il gel da lastre di vetro e utilizzare l'argento colorazione kit (secondo istruzioni²⁶) del produttore per visualizzare le proteine virali (VP1, VP2 e VP3 subunità) che compongono il capside AAV, anche quanto a controllare per possibili contaminazione della proteina (Figura 3).

Figura 3: valutazione della purezza vettoriale mediante SDS-PAGE e macchiatura d'argento. Utilizzando un gel Tricine-SDS, 5 µ l di varie preparazioni di vettore sono stati separati. Proteine sono state successivamente rilevate dalla macchiatura d'argento. Vettori sono considerati puri VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) e VP3 (60 kDa) sono visibili in un 1:1:10 ratio (lane 1), senza fondo eccessiva (lane 2) o fasce non specifiche (corsia 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

AAV9 è stato considerato, fino a poco tempo, per essere il più efficace sierotipo di vettore AAV di attraversare la BBB e transducing cellule del SNC, dopo somministrazione periferica. Un significativo passo avanti nel design del capsid è stato raggiunto quando Deverman et al ha riferito l'uso di un metodo di selezione del capsid denominato Cre basati su ricombinazione AAV-mirati evoluzione (Crea)17. Utilizzando questo metodo, hanno identificato un nuovo capside, denominato PHP. B, che hanno riferito come in grado di trasdurre la maggior parte degli astrociti e neuroni in più regioni dello SNC, dopo iniezione sistemica17. A questo punto, dovrebbe essere notato che anche se PHP. B fornisce risultati positivi in topi C57/Bl6 (che era il ceppo utilizzato negli esperimenti isolamento iniziale), rapporti preliminari suggeriscono la che sua efficienza può variare in un modo dipendente dalla deformazione. Ulteriori esperimenti saranno, senza dubbio, fare più luce su questo problema31.

Tuttavia, nonostante questi problemi, PHP. B offre interessanti possibilità per la manipolazione del gene non invadente nel SNC di topi, compresi gli esperimenti di terapia genica proof-of-concept in modelli di malattia. Come tale, abbiamo scelto di valutare l'efficienza di espressione del transgene utilizzando PHP. B contro AAV9, che è stato il vettore 'gold standard' per la trasduzione di CNS dopo somministrazione periferica dal 20092. Per eseguire un confronto diretto dei due sierotipi, in condizioni ottimali per l'espressione del transgene, abbiamo utilizzato un modulo di configurazione di genoma sc32. Entrambi i vettori ha trasportato il transgene per proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore onnipresente pollo β-actina (CBA). Topi C57/Bl6 femminili al giorno postnatale 42 (circa 20 g di peso) hanno ricevuto una dose di 1 x 1012 vg per topo di entrambi scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP. Amministrazione di vettore è stata eseguita tramite iniezione della vena della coda. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico di KU Leuven.

Postinjection di tre settimane, i topi hanno subito perfusione perfusione con PBS ghiacciata, seguita da 4% (p/v) ghiacciata paraformaldeide (PFA). I loro cervelli sono state raccolte e subì ulteriori postfixation da un'incubazione overnight nel fissativo stesso, prima del trasferimento a 0,01% (p/v) Na-azide/PBS per deposito fino a ulteriori analisi. In seguito, i cervelli sono stati sezionati usando un microtomo vibra e immunohistochemistry è stato effettuato su 50 µm sezioni spesse.

Per valutare i livelli di espressione del transgene, sezioni sono state macchiate con gli anticorpi primari contro GFP (coniglio anti-GFP), con il rilevamento utilizzando anticorpi secondari coniugati a una tintura fluorescente (anti-coniglio Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Misure di intensità di fluorescenza (in unità arbitrarie [au]) ha confermato un significativo aumento nell'espressione di GFP quando un sc genoma e PHP. Capside di B sono stati utilizzati rispetto al AAV9. Sono stati osservati aumenti GFP nel cervello (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0,0032), il cervelletto (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0,0032) e del tronco cerebrale (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (Figura 4).

Figura 4: consegna sistemica di scAAV2/PHP. B-CBA-GFP conduce ad un'alta espressione di GFP nello SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mouse) è stato amministrato ai topi C57/Bl6 6 settimane-vecchio tramite iniezione della vena della coda. GFP è stato rilevato usando immunohistochemistry su postinjection di 3 settimane sezioni coronali del cervello. (A) il cervello e (B) sono mostrati il cervelletto e il tronco cerebrale. Scala bar = 1 mm. (C) la quantificazione dell'intensità di fluorescenza relativa è stata eseguita per determinare i livelli di segnale GFP raggiunto con ogni vettore (10 sezioni per topo; tre topi per gruppo vettoriale). È stato effettuato un test ANOVA unidirezionale, seguiti da t di uno studente due code-test; i dati sono espressi come media ± deviazione standard; p < 0.01; au. unità arbitrarie. pCapsid, utilizzato per la produzione di vettore AAV, contiene il gene rep da sierotipo 2 e del gene tappo da sierotipo PHP. B o AAV9, di conseguenza. Questa figura è stata modificata da Rincon et al.32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.