Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source

Sommario

Le dimensioni e la forma delle particelle a fanghi attivi sono parametri importanti che sono misurati utilizzando metodi diversi. Imprecisioni derivano da campionamento non rappresentativo, immagini non ottimali e parametri di analisi soggettiva. Per ridurre questi errori e facilitare la misurazione, presentiamo un protocollo specificando ogni passo, tra cui una pipeline software opensource.

Abstract

Bioreattori sperimentale, come ad esempio quelli trattamento delle acque reflue, contengono particelle la cui dimensione e la forma sono parametri importanti. Ad esempio, la dimensione e la forma di fiocchi di fango attivo può indicare le condizioni a Microscala e anche direttamente influenzare quanto bene il fango si deposita in un chiarificatore.

Forma e dimensione delle particelle sono entrambe le misurazioni misleadingly 'semplice'. Molti problemi sottili, spesso non indirizzate in protocolli informali, possono sorgere quando campionamento, imaging e l'analisi di particelle. Metodi di campionamento possono essere prevenuti o non forniscono sufficiente potenza statistica. I campioni stessi potrebbero essere mal conservati o subiscono alterazione durante immobilizzazione. Immagini non siano di qualità sufficiente; sovrapposizione di particelle, profondità di campo, il livello di ingrandimento e vari rumori possono tutti producono scarsi risultati. Analisi scarsamente specificata possono introdurre bias, come quella prodotta dalla segmentazione e soglia manuale dell'immagine.

Convenienza e velocità effettiva sono desiderabili al fianco di riproducibilità. Un metodo conveniente, alta velocità di trasmissione può consentire più frequente misurazione delle particelle, producendo molte immagini contenenti migliaia di particelle. Un metodo che utilizza reagenti poco costosi, un comune microscopio da dissezione e software di analisi di open source disponibile liberamente permette risultati sperimentali ripetibili, accessibili, riproducibili e parzialmente automatizzata. Inoltre, il prodotto di tale metodo può essere ben formattato, ben definito e facilmente comprensibili dal software di analisi dati, sia all'interno del laboratorio analisi e condivisione dei dati tra laboratori di interpolazione.

Vi presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi necessari per produrre un prodotto del genere, tra cui: campionamento, campione preparazione e immobilizzazione in agar, acquisizione di immagini digitali, analisi digitale delle immagini ed esempi di generazione specifico esperimento figura dalla risultati dell'analisi. Abbiamo anche incluso una pipeline di analisi di dati open source per supportare questo protocollo.

Introduzione

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un metodo ben definito, ripetibile e parzialmente automatizzata per determinare le distribuzioni di dimensioni e forma delle particelle in bioreattori, specialmente quelli che contengono flocculi di fanghi e aerobica granuli^{1 , 2}. la spiegazione razionale dietro questo metodo erano per migliorare l'accessibilità, la semplicità, la velocità effettiva, e ripetibilità delle nostre esistente di protocolli interni^3,4, facilitare la misurazione delle particelle per gli altri e facilitare la condivisione e confron....

Protocollo

1. raccogliere campioni per analisi delle particelle

1. Determinare il volume del campione per i reattori specifici che produrrà sufficiente particelle per analisi statistica¹⁰ (> 500), evitando la sovrapposizione delle particelle.
   1. Si supponga che una gamma di 0,5-2 mL per campione di liquore misto è sufficiente per i campioni di fango attivo con un solidi misti liquore sospesa (MLSS) tra 250 e 5.000 mg/L.
   2. In caso contrario, preparare tre piastre di agar di prova utilizzando 0,5, 2 e 5 mL di campione (passaggi 1.2 attraverso 2,7).
   3. Visivamente, una stima che (se qualsiasi) volumi di campione migliore soddisfa....

Risultati

File generati
Il processo illustrato nella Figura 1 produrrà due file per ogni immagine analizzati. Il primo file è una virgola separati file di testo (CSV) di valore dove ogni riga corrisponde a una singola particella e le colonne descrivono vari criteri di misurazione delle particelle come zona, circolarità e solidità e definiti nel manuale ImageJ¹⁷. I file CSV di esempio sono inclusi come informazioni supplementa.......

Discussione

Anche se il sistema di analisi dell'immagine è abbastanza robusto e QC sono misure per garantire immagini poveri vengono rimossi, giusta attenzione per i problemi specifici nel campionamento, preparazione e acquisizione di immagini può migliorare sia la precisione dei dati e la proporzione di immagini passando QC.

Concentrazione di campionamento
Supponendo che è stato prelevato un campione rappresentativo, il passo più importante è quello di garantire la presenza per analis.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di candeggina al 10%	Chlorox	31009	Per la disinfezione degli spazi di lavoro.
Provetta da centrifuga da 15 mL con tappo	Corning	430790	Per campione.
Pallone di Erlenmeyer da 50 mL	Corning	4980-50	Altri recipienti sono adatti purché possano contenere > 40 mL di campione e consentire la miscelazione
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	O altrimenti sufficiente per la manipolazione dell'agar
Agar	BD	214010	Solid, per preparare il 7,5% di gel. 7 mL per campione.
software di analisi dati	N/A	N/A	R o Python
Acqua deionizzata	N/A	N/A	Sufficiente per preparare macchie e agar. Se non disponibile, il tocco dovrebbe andare bene.
Computer desktop	N/A	N/A	L'analisi delle immagini non richiede molta CPU, qualsiasi computer desktop "ordinario" intorno al 2017 dovrebbe essere sufficiente.
Disco rigido esterno	Seagate	STEB5000100	Non completamente richiesto, ma estremamente utile dato il numero e la dimensione delle immagini. 2 o più TB di spazio di archiviazione suggeriti.
versione 1.51d	di FIJI	NIH	è il core di ImageJ. I plugin sono aggiornati al momento della scrittura. Disponibile all'indirizzo: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	versione 2.19.1 o successiva	Disponibile all'indirizzo: https://git-scm.com/
Software di acquisizione immagini	ToupView	versione 3.7.5177	Qualsiasi compatibile con la fotocamera, potrebbe essere fornito con la fotocamera. Dovrebbe consentire il salvataggio di immagini TIFF con dati di calibrazione spaziale.
Stadio meccanico (X/Y) OMAX		A512	Non completamente richiesto, ma aiuta notevolmente l'acquisizione delle immagini.
Blu di metilene	Fisher	M291-100	solido, per preparare una soluzione all'1% p/v. 5 uL di soluzione per campione.
Fotocamera per microscopio	OMAX	A35140U	Qualsiasi fotocamera digitale compatibile con il microscopio. Si consiglia una risoluzione che fornisca almeno 5 um per pixel con un ingrandimento 10x e una gamma dinamica di almeno 8 bit per pixel per canale di colore.
Micrometro ottico da tavolino	OMAX	A36CALM1	O comunque sufficiente per la calibrazione spaziale.
Piastra di Petri, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per campione.
DIP	N/A	N/A Camice	da laboratorio, guanti e occhiali standard.
Sparmoria macro	NCSU	versione 0.2.1	Disponibile su github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Microscopio stereo/da dissezione	Nikon	SMZ-2T	Dovrebbe fornire un ingrandimento da 10 a 20x e consentire foto digitali sia con una fotocamera integrata che con un punto di montaggio per un CCD.

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