Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source

Sommario

Le dimensioni e la forma delle particelle a fanghi attivi sono parametri importanti che sono misurati utilizzando metodi diversi. Imprecisioni derivano da campionamento non rappresentativo, immagini non ottimali e parametri di analisi soggettiva. Per ridurre questi errori e facilitare la misurazione, presentiamo un protocollo specificando ogni passo, tra cui una pipeline software opensource.

Abstract

Bioreattori sperimentale, come ad esempio quelli trattamento delle acque reflue, contengono particelle la cui dimensione e la forma sono parametri importanti. Ad esempio, la dimensione e la forma di fiocchi di fango attivo può indicare le condizioni a Microscala e anche direttamente influenzare quanto bene il fango si deposita in un chiarificatore.

Forma e dimensione delle particelle sono entrambe le misurazioni misleadingly 'semplice'. Molti problemi sottili, spesso non indirizzate in protocolli informali, possono sorgere quando campionamento, imaging e l'analisi di particelle. Metodi di campionamento possono essere prevenuti o non forniscono sufficiente potenza statistica. I campioni stessi potrebbero essere mal conservati o subiscono alterazione durante immobilizzazione. Immagini non siano di qualità sufficiente; sovrapposizione di particelle, profondità di campo, il livello di ingrandimento e vari rumori possono tutti producono scarsi risultati. Analisi scarsamente specificata possono introdurre bias, come quella prodotta dalla segmentazione e soglia manuale dell'immagine.

Convenienza e velocità effettiva sono desiderabili al fianco di riproducibilità. Un metodo conveniente, alta velocità di trasmissione può consentire più frequente misurazione delle particelle, producendo molte immagini contenenti migliaia di particelle. Un metodo che utilizza reagenti poco costosi, un comune microscopio da dissezione e software di analisi di open source disponibile liberamente permette risultati sperimentali ripetibili, accessibili, riproducibili e parzialmente automatizzata. Inoltre, il prodotto di tale metodo può essere ben formattato, ben definito e facilmente comprensibili dal software di analisi dati, sia all'interno del laboratorio analisi e condivisione dei dati tra laboratori di interpolazione.

Vi presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi necessari per produrre un prodotto del genere, tra cui: campionamento, campione preparazione e immobilizzazione in agar, acquisizione di immagini digitali, analisi digitale delle immagini ed esempi di generazione specifico esperimento figura dalla risultati dell'analisi. Abbiamo anche incluso una pipeline di analisi di dati open source per supportare questo protocollo.

Introduzione

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un metodo ben definito, ripetibile e parzialmente automatizzata per determinare le distribuzioni di dimensioni e forma delle particelle in bioreattori, specialmente quelli che contengono flocculi di fanghi e aerobica granuli^{1 , 2}. la spiegazione razionale dietro questo metodo erano per migliorare l'accessibilità, la semplicità, la velocità effettiva, e ripetibilità delle nostre esistente di protocolli interni^3,4, facilitare la misurazione delle particelle per gli altri e facilitare la condivisione e confronto dei dati.

Ci sono due grandi categorie di analisi di misurazione delle particelle - Metodi inferenziali e direct imaging utilizzando tali qualità come dispersione della luce⁵. Sebbene metodi di verosimiglianza possono essere automatizzati e hanno grande velocità effettiva, l'attrezzatura è costosa. Inoltre, mentre metodi di verosimiglianza possono determinare con precisione la dimensione equivalente di una particella⁶, non forniscono informazioni dettagliate forma⁷.

A causa della necessità per i dati di forma, abbiamo basato il nostro metodo su formazione immagine diretta. Mentre esistono alcuni metodi di imaging ad alta velocità, essi hanno tradizionalmente richiesto costosi hardware commerciale o soluzioni personalizzate costruito^8,9. Il nostro metodo è stato sviluppato per impiegare hardware comune, accessibile e software che, anche se soffre di una riduzione nella capacità produttiva, produce immagini di particelle molto più rispetto al minimo necessario per molte analisi¹⁰.

I protocolli esistenti non possono specificare importante campionamento e procedura di acquisizione immagine. Altri protocolli possono specificare passaggi manuali che introducono pregiudizi soggettivi (ad esempio ad hoc Sogliatura¹¹). Un metodo ben definito che specifica campionatura, immobilizzazione e immagine acquisizione passaggi combinati con software di analisi liberamente disponibile migliorerà sia all'interno del laboratorio immagine analisi e comparazioni tra i laboratori. Degli obiettivi principali di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro e strumenti che dovrebbero portare a risultati riproducibili da laboratori diversi per lo stesso esempio.

Oltre a normalizzare il processo di analisi di immagine, i dati prodotti da questa pipeline viene registrati in una ben definita e ben formattato file¹² adatto per l'uso di dati popolari analisi pacchetti^13,14, esperimento di interpolazione analisi specifiche (ad esempio di generazione personalizzata figura) e facilitare condivisione dei dati tra laboratori.

Questo protocollo è suggerito specialmente per i ricercatori che richiedono dati di forma delle particelle, non hanno accesso a metodi di verosimiglianza, non si desiderano sviluppare la propria pipeline di analisi di immagine e desiderano condividere i loro dati facilmente con gli altri

Protocollo

1. raccogliere campioni per analisi delle particelle

1. Determinare il volume del campione per i reattori specifici che produrrà sufficiente particelle per analisi statistica¹⁰ (> 500), evitando la sovrapposizione delle particelle.
   1. Si supponga che una gamma di 0,5-2 mL per campione di liquore misto è sufficiente per i campioni di fango attivo con un solidi misti liquore sospesa (MLSS) tra 250 e 5.000 mg/L.
   2. In caso contrario, preparare tre piastre di agar di prova utilizzando 0,5, 2 e 5 mL di campione (passaggi 1.2 attraverso 2,7).
   3. Visivamente, una stima che (se qualsiasi) volumi di campione migliore soddisfano i criteri elencati al punto 1.1.
   4. Se le particelle si sovrappongono ancora per il campione di 0,5 mL, ripetere i passaggi da 1.1.2 e 1.1.3 con tre campioni di 0,5 mL diluiti con un aggiunto 0,5, 1 e 2 mL di tampone fosfato salino per determinare il grado a cui un campione di 0,5 mL deve essere diluito prima del punto 2.1.
      Nota: I passaggi 1.1 − 1.1.4 devono essere eseguito solo una volta ogni esperimento, o se il reattore Sommario cambiamento tale che le misurazioni successive non soddisfano più i criteri elencati nel punto 1.1.
2. Acquisire un campione rappresentativo di una porzione ben mescolata del reattore da afferrante ~ 40 mL in un bicchiere o una provetta da 50 mL, mescolando delicatamente e versando immediatamente il volume del campione determinato di grab ben mescolato in una provetta da centrifuga da 15 mL. Diluire il campione, necessario, come determinato dal passaggio 1.1.4.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e il campione può essere conservato in frigorifero (4 ° C) fino a 48 ore. Non congelare il campione.
   Attenzione: comuni supporti di conservazione (ad es. formaldeide/formammide) non sono adatti. L'ampia superficie della piastra, in combinazione con il contenitore aperto, calore dalla sorgente luminosa e potenzialmente poco ventilate microscopia installazione produrre condizioni di pericolo inutilmente per poco guadagno in qualità dell'immagine.

2. preparare piastre di agar di particelle macchiate, immobilizzate

1. Aggiungere 5 µ l di blu di metilene 1% (p/v) per ogni campione, poi il tappo e capovolgere delicatamente a almeno 3 volte per mescolare. Permetta che i campioni a macchiare per almeno 5 ma non più di 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Preparare circa 10 mL per campione del 7,5% (p/v) agar in acqua deionizzata.
   Nota: Agar possono essere prodotte prima del tempo e conservati a tempo indeterminato se sterilizzati. Agarosio può essere sostituito, ma non migliora sostanzialmente immagini.
3. Sciogliere l'agar utilizzando un forno a microonde o bagnomaria e lasciare per raffreddare leggermente prima dell'uso. Garantire l'agar è completamente sciolto e versa facilmente. Globuli solidi di agar si macchiano in modo diverso, producendo immagini di scarsa qualità.
4. Trasferimento sufficiente sciolto 7,5% (p/v) agar per la provetta da centrifuga per portare il volume totale tubo a fra 6,5 e 9 mL.
5. Richiudere le provette da centrifuga e capovolgere delicatamente almeno 3 volte per mescolare.
6. Mentre si punta il tappo lontano da se stessi o in una cappa, aprire il tappo. Versare il contenuto di tubo in una plastica di 100 mm di Petri mentre delicatamente a dondolo il piatto per ottenere un rivestimento completo, liscio e una visivamente uniforme distribuzione delle particelle.
   Attenzione: Il calore da agar può produrre una leggera sovrappressione nel tubo. Questo spesso produce un sibilo udibile e ha il potenziale per espellere piccole goccioline di agar caldo.
7. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, fino a quando l'agar solidifica le piastre.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Archivio placcato invertito e sigillato (ad esempio, in un sacchetto di plastica tenuto o con la pellicola di paraffina) per fino a 48 ore in frigorifero (4 ° C).

3. acquisizione di immagini di particelle usando un stereomicroscopio e fotocamera digitale

1. Posizionare il volto scoperto piastra fino sul palco di uno stereomicroscopio microscopio capace di 10x di ingrandimento x 20. Illuminare il campione da sotto con la luce diffusa anche utilizzando attrezzature quali un basamento illuminatore LED o luce targa.
2. Aprire il software di acquisizione immagine, verificare che il percorso della luce microscopio è impostato su fotoe clicca sulla fotocamera appropriata dall'elenco fotocamera.
3. Regolare il microscopio in modo che più le particelle appaiono nel software nel piano focale con bordi ben definiti, grandi. Utilizzare un ingrandimento di 10-20 x per misurare le particelle pur mantenendo un piano focale relativamente profondo.
   1. Rimuovere la piastra di agar temporaneamente e posizionare il micrometro sulla scena. Regolare la messa a fuoco fino a quando le graduazioni sul micrometro appaiono perfettamente a fuoco nel software di acquisizione immagini.
   2. Se non precedentemente calibrato, registrare il pixel rapporto micro per l'ingrandimento corrente.
      1. Impostare lo zoom al 100% facendo clic Zoom > dimensioni reali e selezionare Opzioni > Calibra quindi allineare la barra di calibrazione rosso nella finestra principale lungo l'asse del micrometro, con le barre verticali centrata sulla graduazione 0 e 200 µm. Nella finestra di dialogo Calibra , immettere l'attuale livello di ingrandimento e la lunghezza effettiva di 200 µm.
   3. Se già calibrato seleziona ingrandimento dalla barra dei menu, e selezionare l'ingrandimento corrente livello e confermare la calibrazione.
      1. Selezionare misure > Riga > arbitrario linea. Fare clic sull'intersezione della graduazione 0 e asse lungo del micrometro. Fare nuovamente clic sull'intersezione a 200 e il lungo l'asse. A corretta calibrazione dovrebbe visualizzare circa 200 µm. eliminare la riga facendo clic su di esso, premendo CANC, e premendo Sì nella finestra di conferma.
         Nota: Le istruzioni per selezionare la fotocamera e la taratura sono specifiche per il software utilizzato per questo hardware. Funzioni simili dovrebbero essere disponibili in altri software di imaging. L'obiettivo è quello di determinare il pixel rapporto micron dell'immagine per misura di dimensione delle particelle accurata.
4. Sostituire la piastra di agar e regolare la messa a fuoco fine per ottenere il massimo dettaglio nel software di imaging.
5. Regolare il software di imaging in modo che si ottiene la massima qualità dell'immagine.
   1. Aumentare la profondità di bit per il valore massimo consentito, selezionando il pulsante di opzione nel pannello della barra laterale fotocamera Profondità di Bit . Impostare il software per acquisire immagini in scala di grigi selezionando il pulsante di opzione nel pannello Colore/grigio della barra laterale della fotocamera .
   2. Comprimere i pannelli della barra laterale aperta tra esposizione e istogramma. Ridurre il guadagno a 1.0 e aumentare l'esposizione fino a quando una chiara immagine viene visualizzata nella finestra grafica e fino a quando l'istogramma viene visualizzato come una distribuzione che non viene ritagliata da delle estremità della casella di istogramma.
   3. Regolare l'istogramma per evitare l'eccessivo e la sottoesposizione. Nel pannello Istogramma della barra laterale della fotocamera, far scorrere il limite sinistro dell'istogramma per appena fuori i valori più bassi e il limite destro per appena fuori i valori più alti.
6. Salvare l'immagine come un TIFF non compresso, comprese le informazioni di ingrandimento nei metadati dell'immagine, utilizzando il File > Salva con nome nella finestra di dialogo, selezionando il formato TIFF e verificando che la casella Salva con informazioni sulla calibrazione è controllato.
   Nota: Salvare i metadati dell'immagine, tra cui calibrazione spaziale, possono variare tra i programmi di acquisizione. FIJI¹⁵, il software sottostante utilizzato dalla pipeline e capisce le varianti più comuni. Le informazioni importanti da registrare sono l'altezza in pixel, larghezza e le unità associato.
7. Utilizzando sia una fase mobile o manualmente lo spostamento della placca stessa, selezionare un'altra zona, che non si sovrappongono le immagini precedenti, seguendo un percorso che alterna da sinistra a destra e destra-sinistra come uno si muove verso il basso la piastra; conosciuto anche come 'tosaerba criterio di ricerca'. Ripetere il passaggio 3.6 per immagini sufficienti sono prodotte per catturare almeno 500 particelle visivamente stimate, più sono meglio.
   Nota: Modelli alternative (ad es.., circolare, casuale) sono accettabili, ma dovrebbe essere segnalato. L'acquisizione di immagini multiple sovrapposte per combinazione in un mosaico tramite cuciture digitale produce una dimensione di file risultante che ostacola notevolmente la lavorazione a valle e artefatti da impunture può essere introdotto e attualmente non è raccomandata.
8. Conservare le piastre fino a dopo analisi dell'immagine per potenziali imaging follow-up. Dopo formazione immagine finale, scartare come appropriato per rifiuti biologici.

4. misurare e analizzare le sagome delle particelle

1. Installare i pacchetti di software di analisi di immagine richiesta
   1. Installare FIJI (una versione migliorata del ImageJ v1.52e di National Institutes of Health seguendo le istruzioni a: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Installare git, se non già presente, seguendo le istruzioni a: https://git-scm.com/downloads
   3. Acquisire il codice di analisi delle particelle da clonando il repository git¹⁶.
      1. Nella riga di comando, è possibile recuperare l'ultima versione del codice digitando:
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Installare il seguente codice di analisi le istruzioni nel file di testo README.md trovate nella directory principale del repository clonato.
            Nota: Usare git è preferito, come recupererà automaticamente l'ultima versione del codice. Se git non è disponibile, è anche possibile scaricare il codice come un file zip sulla pagina di rilascio a: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Modificare un file di testo elenco le directory da elaborare, insieme con i parametri facoltativi. Fare riferimento alla sottodirectory esempi/analisi per un elenco di parametri ed esempi.
2. Eseguire l'analisi sulla riga di comando digitando:
   < FIJI-percorso > \ImageJ-win64.exe - console - macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   dove < FIJI-percorso > è la directory in cui si trova ImageJ-win64.exe e < paramsfile > la posizione del file di testo che descrive l'installazione di analysis
   Nota: Il nome del file eseguibile può variare, a seconda di quale sistema operativo FIJI è installato. A seconda del numero e dimensione delle immagini, l'analisi potrebbe richiedere alcuni minuti a ore e verrà eseguito automaticamente.
3. Eseguire un controllo di qualità
   1. Esaminare i file di controllo di qualità si trova nella sottodirectory sovrapposizione della directory di output specificata. Nota immagini con spurie, perse e scarsamente particelle catturate, tutto apparente come contorni ombreggiati che non corrispondere allo sfondo. Riferirsi alla Figura 3 per alcuni esempi di tali. I dati delle particelle sono ora pronti per la generazione di figura di analisi specifico per esperimento.
4. Rifiutare o piastre intere o singole particelle specificando il codice di analisi il file indicati e/o particella ID verrà ignorato. Fare riferimento a esempi/censura nel repository per il pertinente codice R e Python.
5. Generare figure specifiche esperimento utilizzando i risultati di analisi di immagine per ogni immagine sono memorizzati in un file di testo separato da virgole ordinata¹² nella sottodirectory risultati della directory di output specificata. Consultare le sottodirectory esempi/figure/R ed esempi/figure/Python per esempi di come leggere i file dei risultati.

Risultati

File generati
Il processo illustrato nella Figura 1 produrrà due file per ogni immagine analizzati. Il primo file è una virgola separati file di testo (CSV) di valore dove ogni riga corrisponde a una singola particella e le colonne descrivono vari criteri di misurazione delle particelle come zona, circolarità e solidità e definiti nel manuale ImageJ¹⁷. I file CSV di esempio sono inclusi come informazioni supplementa...

Discussione

Anche se il sistema di analisi dell'immagine è abbastanza robusto e QC sono misure per garantire immagini poveri vengono rimossi, giusta attenzione per i problemi specifici nel campionamento, preparazione e acquisizione di immagini può migliorare sia la precisione dei dati e la proporzione di immagini passando QC.

Concentrazione di campionamento
Supponendo che è stato prelevato un campione rappresentativo, il passo più importante è quello di garantire la presenza per analis...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di candeggina al 10%	Chlorox	31009	Per la disinfezione degli spazi di lavoro.
Provetta da centrifuga da 15 mL con tappo	Corning	430790	Per campione.
Pallone di Erlenmeyer da 50 mL	Corning	4980-50	Altri recipienti sono adatti purché possano contenere > 40 mL di campione e consentire la miscelazione
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	O altrimenti sufficiente per la manipolazione dell'agar
Agar	BD	214010	Solid, per preparare il 7,5% di gel. 7 mL per campione.
software di analisi dati	N/A	N/A	R o Python
Acqua deionizzata	N/A	N/A	Sufficiente per preparare macchie e agar. Se non disponibile, il tocco dovrebbe andare bene.
Computer desktop	N/A	N/A	L'analisi delle immagini non richiede molta CPU, qualsiasi computer desktop "ordinario" intorno al 2017 dovrebbe essere sufficiente.
Disco rigido esterno	Seagate	STEB5000100	Non completamente richiesto, ma estremamente utile dato il numero e la dimensione delle immagini. 2 o più TB di spazio di archiviazione suggeriti.
versione 1.51d	di FIJI	NIH	è il core di ImageJ. I plugin sono aggiornati al momento della scrittura. Disponibile all'indirizzo: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	versione 2.19.1 o successiva	Disponibile all'indirizzo: https://git-scm.com/
Software di acquisizione immagini	ToupView	versione 3.7.5177	Qualsiasi compatibile con la fotocamera, potrebbe essere fornito con la fotocamera. Dovrebbe consentire il salvataggio di immagini TIFF con dati di calibrazione spaziale.
Stadio meccanico (X/Y) OMAX		A512	Non completamente richiesto, ma aiuta notevolmente l'acquisizione delle immagini.
Blu di metilene	Fisher	M291-100	solido, per preparare una soluzione all'1% p/v. 5 uL di soluzione per campione.
Fotocamera per microscopio	OMAX	A35140U	Qualsiasi fotocamera digitale compatibile con il microscopio. Si consiglia una risoluzione che fornisca almeno 5 um per pixel con un ingrandimento 10x e una gamma dinamica di almeno 8 bit per pixel per canale di colore.
Micrometro ottico da tavolino	OMAX	A36CALM1	O comunque sufficiente per la calibrazione spaziale.
Piastra di Petri, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per campione.
DIP	N/A	N/A Camice	da laboratorio, guanti e occhiali standard.
Sparmoria macro	NCSU	versione 0.2.1	Disponibile su github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Microscopio stereo/da dissezione	Nikon	SMZ-2T	Dovrebbe fornire un ingrandimento da 10 a 20x e consentire foto digitali sia con una fotocamera integrata che con un punto di montaggio per un CCD.