Articolo metodologico

Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap

DOI:

10.3791/58966

⸱

1 febbraio 2019

 , 
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per un dosaggio di comunicazione intercellulare di romanzo gap junction progettato per lo screening ad alta resa di prodotti chimici di gap junction-modulanti per drug discovery e valutazione tossicologica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Giunzioni di Gap (GJs) sono i canali della membrana cellulare che permettono la diffusione delle molecole più piccolo di 1 kDa tra celle adiacenti. Come hanno ruoli fisiologici e patologici, c'è necessità di high throughput screening (HTS) saggi di identificare modulatori GJ in drug discovery e tossicologia saggi. Un saggio di comunicazione intercellulare di giunzione (I-YFP-GJIC) romanzo ioduro-giallo fluorescente proteina-gap soddisfa questa esigenza. È un'analisi basata su celle tra cui accettore e donatore di cellule che sono state progettate per esprimere stabilmente una variante della proteina fluorescente gialla (YFP), cui fluorescenza sensibile è spenta mediante ioduro o SLC26A4, un trasportatore di ioduro, rispettivamente. Quando lo ioduro viene aggiunto a una coltura mista di due tipi cellulari, entrano le cellule erogarici tramite il trasportatore SLC26A4 e diffusa alle celle adiacenti acceptor tramite GJs dove essi placare la fluorescenza YFP. YFP fluorescenza è misurata pozzetto da altro in modalità cinetica. Il tasso d'estinzione YFP riflette l'attività GJ. Il test è affidabile e abbastanza veloce da utilizzarsi per HTS Il protocollo per il dosaggio di-YFP-GJIC utilizzando le cellule LN215, cellule di glioma umano, è descritto.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Giunzioni di Gap (GJs) fungono da canali intercellulari per consentire la diffusione di piccole molecole di < 1 kDa come nutrienti, metaboliti e molecole di segnalazione tra celle adiacenti. Gli elementi giunzionali includono un hemichannel o una connessone in ogni cellula e ogni connessone costituisce sei connexins (Cxs)1. GJs e Cxs sono stati utilizzati nelle analisi di tossicologia degli agenti cancerogeni quali idrocarburi policiclici aromatici (PAH), che sono GJ inibitori2,3,4. GJIC interrotte è stato associato con nongenotoxic carcinogenesi5,6. Come un potenziale bersaglio terapeutico, GJ partecipazione è stata segnalata in particolari sottotipi di sequestri7,8, protezione da cardiaco e cervello ischemia/riperfusione pregiudizio9, emicrania con aura10, danno epatico farmaco-indotto6,11e12di guarigione della ferita. High throughput screening (HTS) saggi sono tenuti a identificare le sostanze chimiche GJ-modulanti o anticorpi per la scoperta di nuovi farmaci, per le analisi di tossicologia e per identificare nuovi regolatori cellulari della attività GJ. Saggi di HTS è utilizzabile anche per indagare le relazioni struttura-attività di GJ modulatori2,13,14,15.

Alcuni saggi GJIC includono trasferimento della tintura o tecniche di dual patch clamp. Lucifero giallo CH (LY) ed estere di calceina acetossimetil (calceina-AM) sono stati utilizzati nelle analisi di dye-transfer. Le cellule non sono permeabili a LY, che è stato introdotto da microiniezione, raschiare caricamento o elettroporazione. Una volta all'interno della cellula, LY si diffonde nelle vicine cellule via GJs e attività GJ è analizzata dalla misura del LY migrazione16. Saggi di calceina-AM coinvolgono di solito recupero di gap-fluorescenza dopo photobleaching17,18. Calceina-AM è un cellulare-permeante colorante che è convertito intracellulare in calceina impermeabile da un intrinseco dell'esterasi. Il test richiede un microscopio confocale per osservare il trasferimento di calceina-AM in una cella da coloro che la circondano dopo laser photobleaching. Se GJs funzionale sono presenti, la fluorescenza viene recuperata e calceina-AM in celle adiacenti entra nelle cellule photobleached. Attività GJ è analizzata dalla misura di recupero di fluorescenza delle cellule photobleached. Sublimazione saggi sono laboriosa e che richiede tempo o hanno basse sensibilità. Dual patch di bloccaggio è un metodo elettrofisiologico che misura di conduttanza giunzionale. È relativamente sensibile, con una dipendenza diretta della conduttanza al numero di open GJs19; Tuttavia, è tecnicamente esigente, richiede tempo e costoso20. L'analisi YFP-GJIC è stata sviluppata per l'uso in HTS

La figura 1 illustra i componenti e i passaggi del test GJIC-YFP, che utilizza celle acceptor esprimendo una variante YFP ioduro sensibili cuscinetto H148Q e I152L (YFPQL) e le cellule erogarici esprimendo un trasportatore di ioduro (SLC26A4)21 . Le due mutazioni di YFPQL consentono tempra di fluorescenza di ioduro22. Gli ioduri vengono aggiunti al co-coltivate acceptor e cellule del donatore; Essi non entrano le cellule accettore, ma sono presi dai trasportatori SLC26A4 presenti sulle cellule del donatore. Gli ioduri nelle cellule del donatore si diffondono attraverso GJs funzionante in celle adiacenti acceptor dove essi placare la fluorescenza YFPQL . Se GJs sono chiuso o bloccato dagli inibitori, ioduro non può entrare nelle cellule di acceptor per placare la fluorescenza. Il tasso d'estinzione YFPQL riflette l'attività GJ. La procedura di dosaggio-YFP GJIC è né complicato né in termini di tempo. È compatibile con HTS e può essere utilizzato per verificare gli effetti di un gran numero di composti su GJ attività in un periodo relativamente breve. Richiede solo acceptor e cellule del donatore e due soluzioni saline bilanciate. Il protocollo descritto di seguito è basato su cellule LN215 cui principali Cx è Cx4321. Il ricevitore di LN215-YFPQL e LN215-sono cellule erogarici− sono state generate da trasduzione con lentivirus esprimere YFPQL o SLC26A421,23.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. generazione di lentivirus esprimere YFPQL e SLC26A4

  1. Crescere le cellule embrionali umane del rene di HEK293T all'80% confluenza su piastre di coltura di 100 mm. Per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) completati con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina è il terreno di coltura utilizzato in tutto il protocollo per mantenere HEK293T ed altre cellule di seguito indicate.
  2. Cappotto 6 pozzetti cultura piastre con l'aggiunta di 2 mL di 0,005% di soluzione di sterile poli-L-lisina (PLL) ad ogni pozzetto per 10 min. aspirare la soluzione di PLL e sciacquare la superficie due volte con 2 mL di acqua sterile.
  3. Lavare il HEK293T cellule con 10 mL di fosfato tampone salino (PBS) e trattano i monostrati di cellule umane in ogni piatto di 100 mm con 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,25% a 37 ° C per 3 min. aggiungere 5 mL di terreno di coltura e risospendere le cellule.
  4. Contare le celle in un emocitometro e regolare la densità della sospensione delle cellule a 250.000 cellule/mL nel terreno di coltura e aggiungere 500.000 cellule in 2 mL di terreno di coltura ad ogni bene di piastre da 6 pozzetti rivestite con lisina. Incubare le cellule in un 5 umidificata CO295% aria atmosfera a 37 ° C per 24 h e quindi sostituire il terreno di coltura con DMEM senza penicillina e streptomicina.
  5. In una provetta da 1,5 mL, diluire 20 µ l di reagente di transfezione con 500 µ l di DMEM senza siero o antibiotici. Mescolare delicatamente pipettando e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min.
  6. Nel frattempo, dispensare 250 µ l di DMEM in ciascuna delle due provette da 1,5 mL e quindi aggiungere 1500 ng di pLVX-EIP-YFPQL o pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng di psPAX2 e 375 ng di pMD2.G a ciascuno. I due plasmidi lentivirali sono stati descritti in precedenza21. Aggiungere 250 µ l di reagente di transfezione diluito in ogni provetta di plasmide, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  7. Dopo 20 minuti, aggiungere 500 µ l di complessi di reagente e plasmide di transfezione nelle provette da 1,5 mL goccia a goccia per ogni piastra di coltura ben al punto 1.4 e mix da dondolo avanti e indietro la piastra. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 per 12 h.
  8. Sostituire il mezzo con 2,5 mL di terreno nuovo e incubare per 48 h. Quindi posizionare la piastra di coltura sul ghiaccio per 5 min mantenere il medium condizionato contenente lentivirus refrigerate per mantenere infettività.
  9. I supporti contenenti il lentivirus di prelievo e trasferimento a provette coniche da 15 mL. Centrifugare a 3.000 x g a 4 ° C per 3 min e quindi rimuovere il galleggiante HEK293T cellule dal surnatante mediante filtrazione a 0,4 µm.
  10. Conservare i supporti contenenti il lentivirus a 4 ° C per l'uso entro 2 giorni. Per un uso successivo, conservare le 200 µ l aliquote a − 80 ° C.

2. generazione di LN215-YFPQL e LN215-io− cellule attraverso la trasduzione lentivirale

  1. Crescere le cellule LN215 in piastre di coltura di 100 mm a 80% confluenza in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS) 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina come descritto sopra.
    Nota: Se il dosaggio YFP-GJIC è condotto utilizzando una linea cellulare diverso, utilizzare il terreno di coltura appropriato. LN215-YFPQLe LN215-io– cellule possono essere fornite dalla Fondazione Università-industria, Università di Yonsei. Si prega di contattare l'autore corrispondente.
  2. Un giorno prima di trasduzione, lavare le cellule con 10 mL di PBS, trattano due volte con 2 mL di tripsina-EDTA 0,25% a 37 ° C per 3 min. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno di coltura con una pipetta sierologica 10ml e regolare la densità a 50.000 cellule/mL. Aggiungere 20.000 celle in 400 µ l di media in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 24 pozzetti per trattamento nessun virus control, YFPQLe SLC26A4 cellule.
  3. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C, trasduce due pozzi sostituendo il terreno di coltura con 400 µ l di una miscela 1:1 di pLVX-EIP-YFPQL o pLenti6P-SLC26A4 lentivirus e terreno di coltura fresco completati con polybrene ad una concentrazione finale di 4 µ g/mL. Per nessun controllo virus, sostituire con terreno di coltura.
  4. Incubare le cellule a 37 ° C per 15 h, aspirare il supporto contenente lentivirus, aggiungere il terreno di coltura fresco e incubare le cellule per 72 h.
    Attenzione: Per evitare la contaminazione di lentivirus tra pozzi, utilizzare nuovi suggerimenti o pipette per ciascun pozzetto quando si aspirare il terreno di coltura contenente lentivirus o dispensa il terreno di coltura fresco.
  5. Lavare che le cellule in ciascuna ben due volte con 0,5 mL di PBS, trattano con 300 µ l di tripsina-EDTA per 3 min. Risospendere le cellule in 2 mL di terreno di coltura e piastra in piastre di coltura sei pozzetti con 2 con puromicina µ g/mL.
  6. Coltura le cellule in media che contengono 2 con puromicina µ g/mL, fino a quando tutte le celle nel controllo bene sono morte (forma rotonda o galleggianti quando osservato nel microscopio), che richiede solitamente una settimana. Aggiornare i terreni di coltura contenente con puromicina ogni altro giorno durante il periodo di selezione. Se LN215-YFPQL o LN215-I– confluenti culture diventare prima che abbia completato la selezione, il trasferimento alle cellule di 100 mm piattino e continuano selezione come descritto al punto 2.5.

3. preparazione delle soluzioni necessarie per il dosaggio

  1. Preparare 500 mL di soluzione C (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, glucosio di 10 mM, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2e 1 mM CaCl2) e 500 mL di soluzione (10 mM HEPES, 140mm NaI, glucosio di 10 mM, 5 mM KCl e 1 mM CaCl2).
  2. Regolare il pH di entrambe le soluzioni a 7.4 con 1 N NaOH, sterilizzare le soluzioni di filtrazioni a 0,4 µm per l'archiviazione. Conservare a 4 ° C fino a 1 mese. Controllare il pH prima dell'uso.

4. placcatura del LN215-YFPQL e LN215-io− cellule

  1. Cultura LN215-YFPQL e LN215-io− cellule in piastre 100 mm separatamente in terreno di coltura per raggiungere le popolazioni necessarie per l'analisi. LN215-YFPQL e LN215-io− cellule nel 40% e 80% confluenza nelle piastre di 100 mm, rispettivamente, sono sufficienti per l'analisi di una piastra a 96 pozzetti.
  2. Un giorno prima di condurre l'analisi GJIC-YFP, lavare ogni piastra di coltura di 100 mm con 10 mL di PBS. Trattare ogni piatto con 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA di 0,25% e incubare a 37 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in ogni piatto in 4 mL di terreno di coltura e trasferimento in provette coniche da 15 mL.
  3. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1.000 x g per 3 min. scartare il supernatante e risospendere ogni cellulare con 5 mL di terreno di coltura. Rompere eventuali grumi di cellule in singole celle pipettando su e giù circa 20 volte con una pipetta sierologica di 10 mL.
  4. Contare le celle in un emocitometro e diluire le cellule nel terreno di coltura per rendere le sospensioni delle cellule di LN215-YFPQL a 80.000 cellule/mL e LN215-io− a 160.000 cellule/mL.
  5. Mescolare 7 mL di LN215-YFPQL e 7 mL di LN215-ho− sospensioni di cellule in un serbatoio. Aggiungere 100 µ l della miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.
    Nota: Per aggiungere 100 µ l della miscela in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti delle cellule, è necessario circa 10 mL di sospensione cellulare mista. Si consiglia di rendere più sospensione cellulare rispetto a quello necessario.
  6. Incubare le cellule a umidificare aria di 95% di 5% CO2a 37 ° C per 24 h. Il LN215-YFPQL e LN215-io−coltura cellulare dovrebbe essere 100% confluenti quando l'analisi è condotta.

5. condurre l'analisi GJIC -YFP

Nota: Utilizzare un microscopio a fluorescenza con 20 ingrandimenti e un filtro GFP per controllare le piastre da 96 pozzetti per essere sicuri che non ci sono nessun ciuffi di LN215-YFPQL o LN215-SLC26A4 cellule e che le colture cellulari sono completamente confluenti e ben distribuite prima condurre l'analisi.

  1. Almeno 30 min prima di fare il dosaggio, girare su una micropiastra e impostare a 37 ° C.
  2. Lavare il tubo di un iniettore automatico con 3 mL di etanolo al 70%, da 3 mL di acqua distillata e quindi 3 mL di soluzione a una portata di 300 µ l/s.
  3. Caldo il C-io-soluzioni e a 37 ° C nel bagno d'acqua.
    Nota: Come 100 µ l di ogni soluzione è necessaria per ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti, circa 10 mL di ciascuna soluzione è necessario per ogni dosaggio. Un ulteriore 10 mL della soluzione è necessaria per l'innesco di ogni piatto (totale di 20 mL) e un ulteriore 25 mL della soluzione-C è necessaria per il lavaggio di ogni piatto (totale di 35 mL).
  4. Aspirare il terreno di coltura o capovolgere la piastra per svuotarlo; Tocca fuori residuo medio.
    Nota: Siero bovino fetale residuo nei media crescita causa fluorescenza di fondo e un declino nella qualità di analisi.
  5. Aggiungere 200 µ l di soluzione C in ciascun pozzetto da un serbatoio usando una pipetta multicanale. Aspirare la soluzione di C o capovolgere la piastra per svuotare e toccare soluzione residua.
  6. Aggiungere 50 µ l µ l C-soluzione, 1 µ l di brodo chimico 2,5 mM (Vedi tabella 1) o dimetilsulfossido (DMSO) come un veicolo e poi 50 µ l µ l C-soluzione ad ogni pozzetto con una pipetta multicanale.
    Nota: Maggior parte dei reagenti in una libreria di chimica sono dissolto in DMSO e fino a 1% (v/v) è consentito nella maggior parte delle analisi cell-based24. Come DMSO ha una densità maggiore rispetto all'acqua, reagenti dissolti in DMSO tendono ad andare giù verso il basso quando aggiunto ai pozzetti della piastra cultura, che disturba le concentrazioni delle soluzioni di saggio. Questo può essere aggirato aggiungendo 50 µ l di soluzione C, reagenti in DMSO e 50 µ l C di - soluzione nell'ordine. L'ultima 50 µ l di soluzione C è per la miscelazione.
  7. Incubare le cellule a 37 ° C in aria, non in 5% CO2. Il tempo di incubazione possa essere modificato, ma 10 min è solitamente sufficiente per modulatori di canale ionico ad agire.
  8. Durante l'incubazione, impostare il programma di lettore di micropiastre per iniettare 100 µ l di soluzione ad ogni pozzetto a 1 s e per misurare la fluorescenza per 10 s a intervalli di 0,4 s. Impostare il lettore a leggere fluorescenza dal basso. La velocità d'iniezione consigliata è 135 µ l/s. Set la lunghezza d'onda di eccitazione a 485 nm e leggere l'emissione a 520 nm.
    Nota: Le impostazioni dettagliate per i programmi di lettore di micropiastre sono come segue.
    1. Fare clic sul pulsante Gestisci protocolli .
    2. Fare clic sul pulsante nuovo . Selezionare l' Intensità di fluorescenza nella sezione metodo di misura e Modalità di bene nella lettura sezione modalità. Successivamente, fare clic sul pulsante OK . Verrà visualizzata la nuova scheda.
    3. Nel menu dei Parametri di base , impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 485 nm e l'emissione a 520 nm. Selezionare il Fondo ottica a fluorescenza di leggere dal basso. Set misura ora di inizio a essere "0 s", il numero di intervalli per essere "25", numero di lampeggi per pozzetto e intervallo di essere "20" e intervallo di tempo di essere "0,4 s".
    4. Dal menu Layout , Disegna regione della piastra per essere letto.
    5. Nel menu delle Concentrazioni/volumi/Shacking , impostare il lettore di micropiastre per iniettare 100 µ l di soluzione ad ogni pozzetto con 135 µ l/s di velocità di iniezione.
      Nota: Evitare velocità di iniezione più veloce perché possono causare distacco delle cellule.
    6. Nel menu tempo di iniezione , impostare l'ora di inizio iniezione a 1 s. Quindi, fare clic sul pulsante Avvia la misurazione .
  9. Dopo l'incubazione, posizionare le piastre da 96 pozzetti nel lettore di micropiastre e avviare la misurazione facendo nuovamente clic tasto di Inizio misurazione .

6. calcolo dell'attività GJIC

  1. Calcolare le percentuali di YFPQL tempra e attività GJIC come23
    YFPQL tempra (%) =figure-protocol-1
    Attività GJIC (%) =figure-protocol-2
    Nota: In linea di principio, GJIC attività dovrebbe essere calcolata dalla differenza delle percentuali di fluorescenza YFP in pozzetti con cellule accettore e donatore e accettore-cella corrispondente solo pozzi. Tuttavia, come LN215-YFPQL cellule mostrano trascurabile YFP tempra di ioduro dopo 10 s, non prendiamo la sfondo YFP tempra in considerazione quando lo svolgimento di HTS utilizzando LN215-YFPQL e LN215-io– cellule.

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Risultati

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Ventinove cultura 96 pozzetti piastre sono state utilizzate per lo screening di 2.320 prodotti chimici per identificare nuovi modulatori GJIC dall'analisi GJIC-YFP utilizzando il LN215-YFPQL e LN215-io− cellule. I risultati ottenuti con un piatto rappresentativo sono mostrati nella Figura 2. La percentuale di fluorescenza YFP in ciascun pozzetto viene visualizzata come un grafico a linee in Figura 2A...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi YFP-GJIC può essere usata per HTS perché è robusto, veloce e poco costoso. Un'analisi HTS è considerata robusta se la Z'-factor è superiore a 0,525. Vedere Zhang et per una descrizione dell'analisi statistica utilizzata per valutare l'idoneità del sistema HTS dosaggi25. Quando le cellule LN215 sono state usate, la Z'-fattore era > 0,5 senza alcuna ottimizzazione del dosaggio. Se vengono utilizzati altri tipi di cella nel dosaggio e suo Z'-fattore è < 0,5, la robus...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della pubblica istruzione (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 e 2018R1A6A1A03023718).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a 96 pozzettiSPL30096
Cloruro di calcio (CaCl2)SigmaC5670Soluzione
D-(+)-GlucosioSigmaG7021Soluzione C, Soluzione
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma276855
HEPESSigmaRES6003H-B7Soluzione C, Soluzione
Lipofectamina 2000Reagente di trasfezioneInvitrogen11668-027
Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2 6H2O)SigmaM2393C-solution
Lettore di micropiastre BMG LabTech POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G Addgene#12259
PolybrenesigmaH9268
Soluzione di poli-L-lisinasigmaP4707
Cloruro di potassio (KCl)SigmaP5405C-soluzione, I-soluzione
psPAX2 #12260
Puromicina DicloridratosigmaP8833
Cloruro di sodio (NaCl)SigmaS5886Soluzione C, Soluzione
di I Irossido di sodio (NaOH)SigmaS2770
Ioduro di sodio (NaI)Sigma383112Soluzione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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