Articolo metodologico

Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

DOI:

10.3791/58971

⸱

25 gennaio 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un apparato sperimentale per un'analisi della valutazione dell'integrità del DNA nelle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Abstract

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Cellule staminali e derivati da cellule staminali hanno un potenziale immenso come terapia rigenerativa per varie malattie degenerative. Il DNA è il magazzino dei dati genetici in tutte le cellule, comprese le cellule staminali, e la sua integrità è fondamentale per la sua capacità rigenerativa. Cellule staminali subiscono rapida propagazione nei laboratori per ottenere i numeri necessari per il trapianto. Crescita accelerata delle cellule porta alla perdita di integrità del DNA dai metaboliti accumulati, come reattive dell'ossigeno, del carbonilico e agenti alchilanti. Trapianto di queste cellule porterebbe a scarso attecchimento e rigenerazione dell'organo deterioramento. Inoltre, trapiantando cellule con DNA danneggiato porta a mutazioni, instabilità del DNA, senescenza cellulare e possibilmente, life-threatening malattie come il cancro. Di conseguenza, c'è un'esigenza immediata di un metodo di controllo di qualità valutare l'idoneità della cella per il trapianto. Qui, forniamo dettagliate protocolli per la valutazione dell'integrità del DNA delle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Introduzione

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La prova sperimentale e clinica dimostra che il trapianto di cellule moderatamente può migliorare le prestazioni contrattile del ventricolo sinistro della mancata cuori1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Recenti progressi hanno aperto ulteriormente accattivante opportunità per rigenerazione cardiovascolare; Questi includono l'espressione forzata di fattori di riprogrammazione di cellule somatiche per indurre pluripotenza e differenziare queste cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in diversi lignaggi cardiache, soprattutto del cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. il materiale ereditario in ogni cellula, compresi i iPSCs generata artificialmente e CM iPSC-derivato (iPS-CM), è il DNA. Le istruzioni genetiche memorizzate nel DNA determina la crescita, lo sviluppo e funzione di cellule, tessuti, organi e organismi. Il DNA non è inerte; metaboliti, come reattivi dell'ossigeno carbonilico e specie dell'azoto, di cella e gli agenti d'alchilazione può DNA causa danni in vitro e in vivo14,15,16,17. D'importanza, il danno del DNA si verifica in modo intuitivo in ogni cellula, con una frequenza significativa. Se questi danni non sono corretti, che porterà a mutazione del DNA, senescenza cellulare, la perdita di integrità del DNA e delle cellule e possibilmente, malattie, compreso i cancri mortali. Quindi, mantenendo l'integrità del DNA è essenziale per qualsiasi cella, soprattutto iPSCs, che ha un enorme potenziale nella clinica.

Per valutare la quantità e l'integrità del DNA genomico isolato, costose attrezzature sono disponibile sul mercato. Tuttavia, non ci sono nessun metodi semplici ed economici per valutare l'integrità del DNA in cellule senza isolare le cellule. Inoltre, utente-indotta di degradazione del DNA durante l'isolamento del DNA è uno dei principali svantaggi nell'uso di questi metodi. Le singole cellule gel elettroforesi (noto come analisi della cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 tecniche sono approcci fondamentali nei laboratori di ricerca per valutare il danno del DNA. Questi due metodi non richiedono attrezzature costose o isolato il DNA di genomic per analizzare DNA integrità8,20,21. Da allora, queste tecniche sono state effettuate con cellule intere; degradazione di DNA/RNA/proteina indotta da utente durante la preparazione del campione non influiranno questi protocolli. Qui, per valutare il danno del DNA e la risposta al danno al DNA in cellule staminali e derivati da cellule staminali, forniamo dettagliati protocolli per eseguire sia il comet assay e γH2A.X immunolabeling. Inoltre, la combinazione di questi due approcci, proponiamo una valutazione ingenuo che può essere utilizzata per valutare l'idoneità della cella per il trapianto.

Il test della cometa, o cella singola elettroforesi del gel, misura le rotture del DNA nelle cellule. Incorporato in basso punto di fusione dell'agarosi le cellule vengono lisate per nucleoids modulo contenente DNA supercoiled. All'elettroforesi, piccoli pezzi di DNA frammentato e filamenti di DNA rotti migrano attraverso i pori di agarosio, considerando che il DNA intatto, a causa della loro enorme dimensione e la loro coniugazione con la proteina della matrice, avrà una migrazione con restrizioni. Il modello di DNA macchiato con un microscopio a fluorescenza imita una cometa. La testa di cometa contiene DNA intatto e la coda è composta da frammenti e rotta filamenti di DNA. La frazione di danno del DNA può essere misurata con l'intensità di fluorescenza del DNA danneggiato (coda della cometa) riguardante l'intensità di (testa di cometa) DNA intatto. Il momento di coda di parametro può essere calcolato come illustrato nella Figura 1.

Danno al DNA induce la fosforilazione dell'istone H2A. X (γH2A.X) a Ser139 da chinasi ATM, ATR e DNA-PK. La fosforilazione e l'assunzione di H2A. X alle rotture del filo del DNA si chiama risposta al danno al DNA (DDR) e avviene rapidamente dopo il DNA è danneggiato. A seguito di questo processo, arresto del ciclo cellulare di checkpoint-mediata e DNA vengono avviati processi di riparazione. Dopo il completamento della riparazione del DNA, γH2A.X è defosforilata e inattivato da fosfatasi. Prolungata e più rotture del filo del DNA portano all'accumulo di γH2A.X i fuochi nel DNA. Questo indica l'incapacità delle cellule di riparare il danno del DNA e la perdita di integrità del DNA. Questi focolai γH2A.X nel DNA possono essere identificati da e il numero dei fuochi DDR può essere contato utilizzando il protocollo nella sezione 2.

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Protocollo

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1. comet Assay

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Per punto di fusione basso dell'agarosi, porre in 100 mL di DNA - 500 mg di agarosio basso punto di fusione / RNA senza acqua. Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando si scioglie l'agarosio. Posizionare la bottiglia in un bagno di acqua di 37 ° C fino a quando necessario.
      Nota: Per approfondimenti, Vedi Azqueta et al., che ha studiato gli effetti della concentrazione di agarosio sul tempo di svolgimento del DNA e diversi fattori di elettroforesi23.
    2. Diluire il colorante SYBR green DNA in tampone Tris-EDTA (TE) ad un rapporto di 1: 10.000 per ottenere un 1 x soluzione colorante stock di funzionamento. Questa tintura è sensibile alla luce, quindi conservarlo in un luogo buio.
    3. Per il buffer di lisi delle cellule, sciogliere 100 mL di tampone di lisi (2,5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) in acqua deionizzata (DI H2O). Quindi, aggiungere 10 M NaOH per regolare il pH a 10.0. Raffreddare il buffer a 4 ° C.
    4. Per il tampone alcalino-svolgimento/elettroforesi del DNA in esecuzione, sciogliere 1 L di soluzione alcalina (NaOH 0,3 M, 1 mM EDTA) DI H2O. Cool il buffer a 4 ° C. Assicurarsi che il pH > 13.
    5. Per le diapositive di cometa preverniciati, versare qualche goccia di 0,5% di agarosio su un vetrino. Immediatamente, utilizzando la superficie piana di un'altra diapositiva, diffondere l'agarosio per formare un sottile strato di rivestimento dell'agarosi.
      Nota: Asciugare i vetrini prima dell'uso.
    6. Per la coltura delle cellule iPS, brevemente le cellule iPS di cultura nel seminterrato-membrana-matrix-coated (Vedi Tabella materiali) cultura piastre in terreno di coltura di mTESR1 sino al confluency.
      Nota: Le cellule iPS umani-cardiaco-fibroblasto-derivati sono state utilizzate in questo protocollo. La riprogrammazione di derivazione delle cellule iPS e condizioni di coltura è descritto in articoli recenti dal nostro ricerca gruppo12,13,21.
  2. Preparazione del campione
    1. Scartare il terreno di coltura e lavare le cellule. Dissociare le cellule utilizzando soluzione di distacco (Vedi Tabella materiali). Lavare il pellet cellulare con tampone fosfato salino (PBS) e risospendere le cellule in PBS a 1 x 105 cellule/mL.
  3. Preparazione del vetrino del campione
    Nota: Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di scarsa illuminazione per evitare il danno cellulare indotto da luce ultravioletta.
    1. Miscelare 10 µ l di sospensione cellulare e 90 μL di soluzione di agarosio (01:10 ratio) in un tubo. Collocare la provetta nel bagno d'acqua di 37 ° C per impedire la solidificazione di agarosio.
    2. Mescolare le soluzioni senza introdurre bolle d'aria e pipettare 70 μL/spot sulla diapositiva cometa preverniciati. Utilizzando un puntale, stendere l'impasto di agarosio cella per formare uno strato sottile. Porre il vetrino a 4 ° C per 15 min.
    3. In un contenitore, completamente immergere il vetrino in tampone di lisi freddo. Mettere il recipiente al buio a 4 ° C per 1 h.
    4. Sostituire il tampone di lisi freddo con soluzioni alcaline. Assicurarsi che le diapositive sono completamente sommerse. Mettere il recipiente al buio a 4 ° C per 30 min.
  4. Elettroforesi
    1. Porre il vetrino in un serbatoio di elettroforesi orizzontale. Riempire il serbatoio con il tampone di elettroforesi alcalina fredda fino a quando le diapositive sono completamente sommerse. Applicare tensione a 1 V/cm per 15-30 min.
      Nota: Totale tensione = distanza tra gli elettrodi x 1 V
    2. In un contenitore, completamente immergere il vetrino in freddo DI H2O. Dopo 2 minuti, togliere il DI H2O e aggiungere fresco DI H2O. Ripetere questo passaggio.
    3. Sostituire il DI H2O con etanolo 70% freddo. Attendere 5 min. delicatamente togliere il vetrino, non inclinare l'apparecchio e lasciarlo asciugare all'aria.
    4. Una volta asciugato, aggiungere 100 μL di colorante DNA diluito per ogni spot. Aspettare 15 min a temperatura ambiente. Utilizzando un filtro FITC in un microscopio a epifluorescenza, prendere le immagini di comete da 50 a 100 in totale per campione.
  5. Analisi dell'immagine e calcolo dei risultati
    1. Per segnare le comete, utilizzare il National Institutes of Health (NIH) ImageJ con comet assay plugin (Scarica ImageJ qui: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; Scarica il plugin qui: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      Nota: Il plugin viene fornito con un PDF istruzioni che contiene tutti i dettagli per eseguire l'analisi. Inoltre, screenshot per l'analisi della cometa sono mostrati nella Figura 2A-C. Immagini della cometa rappresentante di controllo e doxorubicina (Doxo)-cellule trattate iPS e la quantificazione delle comete sono mostrati in Figura 3A-C.

2. DNA Damage Response

  1. Preparazione di campioni e reagenti
    1. Per una cultura di cellule iPS-CM, cultura iPS-CM le celle in scantinato-membrana-matrix-coated (Vedi Tabella materiali) piastre di coltura in RPMI supplementato con B-27 (CMM) sino al confluency.
      Nota: Cardiomiociti umani-iPS-cellula-derivati sono stati utilizzati in questo protocollo. Il protocollo per la differenziazione delle cellule iPS in cardiomiociti può essere trovato in articoli recenti dal nostro ricerca gruppo12,13,21.
    2. IPS-CMs in diapositive di alloggiamento del seme.
      1. Scartare il terreno di coltura dai pozzetti iPS-CM. Lavare le cellule tre volte con PBS.
      2. Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 min. Check la piastra sotto un microscopio per distacco cellulare. Aggiungere 1 mL di CMM per interrompere la tripsina.
      3. Posizionare la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 4 ° C e 200 x g. Eliminare il terreno, aggiungere 1 mL di CMM e risospendere le cellule. Contare le celle e regolare il numero di celle per ottenere 20 x 105 celle in 1,6 mL di CMM.
      4. Seme 200 µ l della sospensione di cellule per pozzetto della camera 8 pozzetti di slide (Vedi Tabella materiali). Tocca la diapositiva delicatamente per diffondere le celle intorno al pozzo e incubare a 37 ° C.
    3. Per il trattamento di doxorubicina iPS-CM, scartare il terreno di coltura dai pozzetti iPS-CM. Lavare le cellule con PBS. Trattare le cellule con doxorubicina di 1 μM e CMM per 4 h. aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS.
    4. Per il tampone bloccante, preparare 10 mL di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) contenente 3% BSA e 0.05% Triton X-100. Per preparare 10 mL di tampone bloccante, aggiungere 1 mL di siero normale asino a 9 mL di soluzione di BSA preparata.
    5. Per la soluzione di anticorpo primario, aggiungere 1 μL di anti-coniglio fosfo-istone H2A. X (Ser139) anticorpo a 200 μL di tampone bloccante.
    6. Per il mix di anticorpo secondario, aggiungere 1 µ l di anticorpo secondario anti-coniglio fluorocromo-coniugate, DAPI e falloidina fluorocromo-coniugate a 200 μL di tampone bloccante.
  2. Immunolabeling
    1. Lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere 200 μL di preparati paraformaldeide al 4% (PFA) ad ogni pozzetto. Fissare le cellule per 20 min al buio a temperatura ambiente. Lavare le cellule con PBS.
    2. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante per bene e blocco per 30 min in una camera umidificata a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 200 μL di soluzione di anticorpo primario. Incubare per 45 min in una camera buia, umidificata a temperatura ambiente. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con PBS.
    3. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL di miscela di anticorpo secondario. Incubare per 45 min in una camera buia, umidificata a temperatura ambiente. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con PBS. Lavare con DI H2O prima di montarli con antifade. Posizionare un coprioggetto e conservare i vetrini al buio a 4 ° C.
    4. Utilizzando un microscopio a epifluorescenza, prendere tre a cinque immagini di campi aleatori per campione, come illustrato nella Figura 4Ae procedere all'analisi dell'immagine.
  3. Conteggio dei fuochi DDR
    1. Scaricare e installare CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. Nota: Immagine di elaborazione in questo studio è stato effettuato usando CellProfiler versione 2.1.1. Tutorial per CellProfiler che sono stati utilizzati possono essere trovate altrove (lista & https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk = PL7CC87670239B4D10). Se viene utilizzata una versione più recente di CellProfiler, la pipeline è in potrebbe di richiedere adeguamenti minori.
    3. Scarica il gasdotto punctae_gH2AX.cpipe. Selezionare File > Import > Pipeline dal file e scegliere punctae_gH2AX.cpipe.
    4. Drag-and-drop nella cartella contenente le immagini acquisite dei fuochi γH2A.X nella finestra di elenco di File nella sezione Moduli Input/immagini per analisi (Figura 5A). Quindi, seguire le istruzioni come mostrato in Figura 5A-L.
    5. Impostare i seguenti parametri per le immagini:
      1. L' elenco dei File, trascinare l'immagine desiderata per l'analisi. In moduli di Input, selezionare Immagini (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5A ). Nei moduli di Input, selezionare i metadati (per le impostazioni del modulo, vedere figura 5B ). Nei moduli di Input, selezionare NamesAndTypes (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5 ).
      2. Per i gruppi, selezionare no. Nei moduli di analisi, selezionare ColorToGray (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5 ).
    6. Nei moduli di analisi, selezionare liscia (vedere Figura 5E per le impostazioni del modulo).
      Nota: Questo valore potrebbe essere necessario essere ottimizzata, a seconda della risoluzione di immagine.
    7. Nei moduli di analisi, selezionare IdentifyPrimaryObjects (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5F ).
      Nota: Ottimizzare questi valori per assicurarsi che sia selezionato l'intero nucleo. Dopo questo passaggio, il computer può lag.
    8. Nei moduli di analisi, selezionare liscio (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5 ).
      Nota: Questo valore potrebbe essere necessario essere ottimizzata, a seconda della risoluzione di immagine.
    9. Nei moduli di analisi, selezionare EnhanceOrSuppressFeatures (vedere la Figura 5 H per le impostazioni del modulo).
    10. Nei moduli di analisi, selezionare IdentifyPrimaryObjects (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5I ).
      Nota: Ottimizzare questi valori per assicurarsi che siano selezionati il punctae. Dopo questo passaggio, il computer potrebbe rimanere ancora una volta.
      1. Nei moduli di analisi, selezionare RelateObjects (Vedi Figura 5J per le impostazioni del modulo). Nei moduli di analisi, selezionare ClassifyObjects (vedere la Figura 5 K per le impostazioni del modulo). Nei moduli di analisi, selezionare ExportToSpreadsheet (vedere la Figura 5 L per le impostazioni del modulo).
      2. Fare clic su Analizzare immagini al pannello sinistro inferiore per eseguire l'analisi di immagine. Con il completamento dell'analisi, vengono generati diversi immagini (Figura 6A-F).
        Nota: Gli utenti devono salvare queste immagini per riferimento futuro.
      3. Nota il file CSV contenente i dati quantitativi per ulteriori analisi che viene generato e salvato nella posizione appropriata sul computer. Nel foglio di calcolo chiamato MyExpt_Image, le colonne B e D avrà il numero dei nuclei che hanno fino a cinque e più punctae, rispettivamente. Aggiungere colonne B e D per ottenere il numero totale dei nuclei.
    11. Ripetere il punto 2.3.3 - 2.3.8 per tutte le immagini (cambiare il nome del file MyExpt_ prima di ogni analisi). Trame possono essere fatto per valutare l'integrità del DNA, come mostrato in Figura 4.

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Risultati

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Cellule staminali pluripotenti indotte umane sono state coltivate e il danno del DNA e al momento di coda, che sono stati utilizzati come misura dell'integrità del DNA, sono stati analizzati dall'analisi della cometa. le cellule iPS sono state incorporate nell'agarosi di basso-punto di fusione e posti su un vetrino. Le cellule sono state, quindi, trattate con buffer di Lisi, seguita da una soluzione alcalina, per ottenere il DNA supercoiled. Nucleoids erano electrophoresed e comete sono s...

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Discussione

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Integrità del DNA ritrae l'integrità delle cellule. Cellule con DNA danneggiato sono frequentemente nello sforzo e alla fine perdono la loro integrità. L'integrità delle cellule staminali e derivati da cellule staminali che sono essere propagate ai fini del trapianto è principale per le cellule di svolgere la loro funzione desiderata. Trapianto di cellule con DNA danneggiato avrebbe provocato un tasso di attecchimento poveri e prestazioni della cella8,20. Di cons...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Heart, Lung e sangue Istituto sovvenzioni RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (a Zhang J.) e dall'American Heart Association scientifico Development Grant 17SDG33670677 (di R. Michel).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% TripsinaCorning25200056
vetrino da camera a 8 pozzettiMillicellPEZGS0816
AccutaseStemcell Technologies7920Soluzione per il distacco delle cellule
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		Jackson Immuno
Research Laboratories		711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson Immuno
Research Laboratories		711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPISigma-AldrichD9564
Gibco B-27 Supplemento, senza siero,Gibco17504-044
Fattore di crescita Matrigel ridottoCorning354230
mTeSR1Tecnologie delle cellule staminali85850
FalloidinaA488Tecnologia della vitaA12379
Fosfo-istone H2A. Tecnologia di segnalazione cellulare anticorpale X (Ser139)2577 (RRID: AB_2118010)
RPMIGibco11875-093
SYBR  Colorazione gel per acido nucleico Green ISigma-AldrichS9430
Triton X-100Fisher scientificBP151-100
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
VectashieldVector LaboratoriesH-1000Antifade

Riferimenti

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