Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un apparato sperimentale per un'analisi della valutazione dell'integrità del DNA nelle cellule staminali prima del trapianto di cellule.
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Articolo metodologico
Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali e derivati da cellule staminali hanno un potenziale immenso come terapia rigenerativa per varie malattie degenerative. Il DNA è il magazzino dei dati genetici in tutte le cellule, comprese le cellule staminali, e la sua integrità è fondamentale per la sua capacità rigenerativa. Cellule staminali subiscono rapida propagazione nei laboratori per ottenere i numeri necessari per il trapianto. Crescita accelerata delle cellule porta alla perdita di integrità del DNA dai metaboliti accumulati, come reattive dell'ossigeno, del carbonilico e agenti alchilanti. Trapianto di queste cellule porterebbe a scarso attecchimento e rigenerazione dell'organo deterioramento. Inoltre, trapiantando cellule con DNA danneggiato porta a mutazioni, instabilità del DNA, senescenza cellulare e possibilmente, life-threatening malattie come il cancro. Di conseguenza, c'è un'esigenza immediata di un metodo di controllo di qualità valutare l'idoneità della cella per il trapianto. Qui, forniamo dettagliate protocolli per la valutazione dell'integrità del DNA delle cellule staminali prima del trapianto di cellule.
Introduzione
La prova sperimentale e clinica dimostra che il trapianto di cellule moderatamente può migliorare le prestazioni contrattile del ventricolo sinistro della mancata cuori1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Recenti progressi hanno aperto ulteriormente accattivante opportunità per rigenerazione cardiovascolare; Questi includono l'espressione forzata di fattori di riprogrammazione di cellu....
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Protocollo
1. comet Assay
-
Preparazione dei reagenti
- Per punto di fusione basso dell'agarosi, porre in 100 mL di DNA - 500 mg di agarosio basso punto di fusione / RNA senza acqua. Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando si scioglie l'agarosio. Posizionare la bottiglia in un bagno di acqua di 37 ° C fino a quando necessario.
Nota: Per approfondimenti, Vedi Azqueta et al., che ha studiato gli effetti della concentrazione di agarosio sul tempo di svolgimento del DNA e diversi fattori di elettroforesi23. - Diluire il colorante SYBR green DNA in tampone Tris-EDTA (TE) ad un....
- Per punto di fusione basso dell'agarosi, porre in 100 mL di DNA - 500 mg di agarosio basso punto di fusione / RNA senza acqua. Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando si scioglie l'agarosio. Posizionare la bottiglia in un bagno di acqua di 37 ° C fino a quando necessario.
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Risultati
Cellule staminali pluripotenti indotte umane sono state coltivate e il danno del DNA e al momento di coda, che sono stati utilizzati come misura dell'integrità del DNA, sono stati analizzati dall'analisi della cometa. le cellule iPS sono state incorporate nell'agarosi di basso-punto di fusione e posti su un vetrino. Le cellule sono state, quindi, trattate con buffer di Lisi, seguita da una soluzione alcalina, per ottenere il DNA supercoiled. Nucleoids erano electrophoresed e comete sono s.......
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Discussione
Integrità del DNA ritrae l'integrità delle cellule. Cellule con DNA danneggiato sono frequentemente nello sforzo e alla fine perdono la loro integrità. L'integrità delle cellule staminali e derivati da cellule staminali che sono essere propagate ai fini del trapianto è principale per le cellule di svolgere la loro funzione desiderata. Trapianto di cellule con DNA danneggiato avrebbe provocato un tasso di attecchimento poveri e prestazioni della cella8,20. Di cons.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Heart, Lung e sangue Istituto sovvenzioni RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (a Zhang J.) e dall'American Heart Association scientifico Development Grant 17SDG33670677 (di R. Michel).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina | Corning | 25200056 | |
| vetrino da camera a 8 pozzetti | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Soluzione per il distacco delle cellule |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories | 711-545-152 (RRID: AB_2313584) | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories | 711-165-152 (RRID:AB_2307443) | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplemento, senza siero, | Gibco | 17504-044 | |
| Fattore di crescita Matrigel ridotto | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Tecnologie delle cellule staminali | 85850 | |
| FalloidinaA488 | Tecnologia della vita | A12379 | |
| Fosfo-istone H2A. Tecnologia di segnalazione cellulare anticorpale X (Ser139) | 2577 (RRID: AB_2118010) | ||
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Colorazione gel per acido nucleico Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
Riferimenti
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al.
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Ristampe e permessi
