Un'analisi di ATP-misurazione semplice e live/dead metodo di colorazione sono stati usati per quantificare e visualizzare le gonorree di Neisseria sopravvivenza dopo il trattamento con ceftriaxone. Questo protocollo può essere esteso per esaminare gli effetti antimicrobici di qualsiasi antibiotico e può essere utilizzato per definire la concentrazione inibitoria minima di antibiotici in biofilm batterici.
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Articolo metodologico
L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'emergere di resistenti agli antibiotici Neisseria gonorrhoeae (GC) è una minaccia per la salute in tutto il mondo e mette in evidenza la necessità di identificare gli individui che non riescono di trattamento. Questo batterio gram-negativo causa gonorrea esclusivamente in esseri umani. Durante l'infezione, è in grado di formare aggregati e/o biofilm. Il test di concentrazione inibitoria minima (MIC) è utilizzato per determinare la suscettibilità agli antibiotici e di definire il trattamento adatto. Tuttavia, il meccanismo di eradicazione in vivo e la sua relazione ai risultati di laboratorio non sono noti. È stato sviluppato un metodo che esamina come aggregazione di GC influisce sulla sensibilità agli antibiotici e illustrata la relazione tra dimensioni di aggregazione e di sensibilità agli antibiotici. Quando aggregato GC, sono più resistenti agli antibiotici uccisione, con batteri nel centro della sopravvivenza ceftriaxone trattamento meglio di quelli in periferia. I dati indicano che l'aggregazione di N. gonorrhoeae può ridurre la sua suscettibilità a ceftriaxone, che non trova riscontro utilizzando i metodi MIC basati su piastra di agar standard. Il metodo utilizzato in questo studio permetterà ai ricercatori di testare la suscettibilità batterica in condizioni clinicamente rilevanti.
Introduzione
La gonorrea è che una comune infezione (STI)1trasmesse per via sessuale. Neisseria gonorrhoeae (GC), un batterio gram-negativo diplococcal, è l'agente eziologico di questa malattia. I sintomi dell'infezione genitale possono provocare dolore durante la minzione, dolore genitale generalizzato e scarico uretrale. L'infezione è spesso asintomatica2,3,4,5, e in questo modo estesa colonizzazione. Queste infezioni non trattate sono un problema sanitario importante, come hanno il potenziale per facilitare la trasmiss....
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Protocollo
1. generale manutenzione dei ceppi di GC
- Striscia N. gonorrhoeae ceppi su agar GCK con 1% Kellogg integratori18 (tabella 1, tabella 2) dalle scorte di congelatore e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h. uso MS11 esprimendo la variabile phase Opa (MS11Opa +), nessuna Opa (MS11ΔOpa), o un LOS troncato (MS11ΔLgtE).
- Scegliere attentamente pili negativi (Colonia, senza bordo scuro) o colonie positive (Colonia con bordo scuro) da ogni ceppo basato su Colonia morfologia19 utilizzando un microscopio per dissezione e striscia su un piatto GCK nuovo.
- Incubare a....
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Risultati
Due metodi sono stati impiegati: un'analisi di utilizzo di ATP e un saggio di colorazione live/dead. I risultati possono essere combinati o usati individualmente per l'esame di sopravvivenza batterica all'interno di aggregazioni dopo il trattamento antibiotico. Il dosaggio di utilizzazione di ATP è stato indicato per misurare con precisione praticabile batteri Staphylococcus aureus biofilm20,21. Qui, MS11Opa + Pil + ceppo.......
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Discussione
I batteri possono formare biofilm durante l'infezione del corpo umano. Test di MIC tradizionale potrebbe non riflettere la concentrazione necessaria per sradicare i batteri nel biofilm. Per verificare gli effetti antimicrobici su un biofilm, metodi basati sulla biomassa di biofilm, nonché CFUs di placcatura possono essere errati a causa dell'impatto della struttura del biofilm. Ad esempio, il metodo di placcatura funziona solo se il biofilm può essere interrotta. Quindi, il CFU ottenuto può essere inferiore rispetto al n.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Institute of Health D.C.S e W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., ed E.N. sono stati sostenuti in parte/partecipare al programma "Il primo anno l'innovazione & ricerca Experience" finanziato dall'Università del Maryland. I finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Riconosciamo l'UMD CBMG Imaging Core per tutti gli esperimenti di microscopia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100x integratore | |||
| Agar | Stati Uniti Biologico | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC base media | BD | 228950 | |
| Nitrato ferrico, nonaidrato | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucosio | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutammina Polvere cristallina | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight colorazione viva/morta | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae ceppo | gentilmente fornito dal Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute per Ricerca | ||
| Potassio fosfato bibasico (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassio fosfato monobasico (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteoso Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Amido solubile | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Tiamina pirofosfato | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Attrezzatura | |||
| Piastre di Petri | VWR | 25384-302 | |
| a 8 pozzetti camera inferiore del vetrino coprioggetti | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Piastre per colture tissutali a 96 pozzetti | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Classe II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubatore | Fisher Scientific | Modello 3530 | |
| Microscopio confocale dotato di camera di imaging dal vivo | Leica | SP5X | |
| Corning 96 pozzetti Micropiastra in polistirene nero | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminatore | Promega | E6521 | |
| Puntali per pipette (0,1-10 &; micro; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Puntali per pipette (1000 &; micro; L) | VWR | 83007-382 | |
| Puntali per pipette (200 µ L) | VWR | 53509-007 | |
| Spettrofotometro Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Provette coniche sterili da 15 ml | VWR | 21008-216 | |
| Provette sterili per microcentrifuga (1,7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Applicatori sterili con punta in poliestere | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivalente a 9110001 |
Riferimenti
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
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Ristampe e permessi
