L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

La gonorrea è che una comune infezione (STI)¹trasmesse per via sessuale. Neisseria gonorrhoeae (GC), un batterio gram-negativo diplococcal, è l'agente eziologico di questa malattia. I sintomi dell'infezione genitale possono provocare dolore durante la minzione, dolore genitale generalizzato e scarico uretrale. L'infezione è spesso asintomatica^2,3,4,5, e in questo modo estesa colonizzazione. Queste infezioni non trattate sono un problema sanitario importante, come hanno il potenziale per facilitare la trasmissione dell'organismo e questo può portare a complicazioni come la malattia infiammatoria pelvica (PID) e diffuso l'infezione gonococcica (DGI)⁶. Gonorrea resistente agli antibiotici è una crisi di salute pubblica e un crescente onere socio-economico⁷. Ridotta sensibilità alle cefalosporine ha provocato il cambiamento di regime di trattamento da un singolo antibiotico a duplice terapia, che combina azitromicina o doxiciclina con ceftriaxone⁸. Il guasto aumentato di ceftriaxone e azithromycin^9,10, in combinazione con le infezioni asintomatiche, evidenzia l'esigenza di comprendere gli insuccessi del trattamento di gonorrea.

La prova di concentrazione inibitoria minima (MIC), tra cui agar diluizione e disco test di diffusione, è stata usata come la prova medica standard per l'identificazione di resistenza ad un antibiotico. Tuttavia, non è chiaro se il MIC test riflette la resistenza antibiotica batterica in vivo. La formazione di biofilm batterici contribuisce alla sopravvivenza di batteri in presenza di concentrazioni battericide di antibiotico: il MIC Test è in grado di rilevare questo effetto¹¹. Perché GC può formare biofilm su superfici mucose¹², possiamo ipotizzare che tale antibiotico suscettibilità all'interno di aggregati sarebbe diverso da quello visto in GC individuali. Inoltre, gli studi hanno indicato che la proteina molecole di superficie variabile, Pili, opacità (Opa) a tre fasi, e lipooligosaccharides (LOS), che regolano le interazioni inter-batterio, portare a diversi aggregati di dimensioni^{13, 14 , 15}. il contributo di questi componenti di resistenza agli antibiotico non è stato esaminato a causa della mancanza di metodi adeguati.

Attualmente, ci sono diversi metodi per misurare l'eradicazione biofilm. Il metodo quantitativo più ampiamente usato è misurando i cambiamenti nella biomassa usando cristalvioletto macchiatura¹⁶. Tuttavia, il metodo richiede significativi manipolazione sperimentale, che potenzialmente possa generare errori in esperimento ripetizioni¹⁷. Il metodo di macchiatura live/dead qui utilizzato permette la visualizzazione di batteri vivi e morti e loro distribuzione all'interno del biofilm. Tuttavia, la struttura di biofilm può rappresentare come una barriera fisica che riduce la penetrazione della tintura. Pertanto, per quantificare i batteri vive/morte all'interno di un gruppo, la colorazione è limitata a piccole biofilm oppure il suo precursore-microcolonies o aggregazioni. Altri metodi, compreso le prove di diffusione agar diluizione e disco, non sono in grado di misurare gli effetti dell'aggregazione. Per esaminare la suscettibilità di GC all'interno di aggregazione dopo esposizione agli antibiotici, un metodo ideale avrebbe bisogno di avere entrambi un dosaggio quantitativo che può misurare batteri vivi e visualizzare la loro distribuzione.

La procedura qui descritta combina una misurazione di ATP-utilizzazione e un live/dead colorazione dosaggio a quantitativamente ed esaminare visivamente la suscettibilità di GC all'interno di aggregati in presenza di antibiotici.

1. generale manutenzione dei ceppi di GC

1. Striscia N. gonorrhoeae ceppi su agar GCK con 1% Kellogg integratori¹⁸ (tabella 1, tabella 2) dalle scorte di congelatore e incubare a 37 ° C con 5% CO₂ per 16-18 h. uso MS11 esprimendo la variabile phase Opa (MS11Opa +), nessuna Opa (MS11ΔOpa), o un LOS troncato (MS11ΔLgtE).
2. Scegliere attentamente pili negativi (Colonia, senza bordo scuro) o colonie positive (Colonia con bordo scuro) da ogni ceppo basato su Colonia morfologia¹⁹ utilizzando un microscopio per dissezione e striscia su un piatto GCK nuovo.
3. Incubare a 37 ° C con 5% CO₂ per 16-18 h prima dell'uso.

2. quantificazione di attuabilità delle aggregazioni di GC

1. Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. Tampone di GC dalla piastra e risospendere GC in brodo pre-riscaldato (GCP, tabella 3) completati con 4,2% NaHCO₃ e 1% Kellogg soluzioni¹⁸. Utilizzare spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm (un OD₆₅₀ di 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) per determinare la concentrazione di batteri sospesi.
2. Regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 10⁸ UFC/mL.
3. Aggiungere 99 µ l della sospensione di GC regolata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
4. Incubare la piastra per 6 h a 37 ° C con 5% CO₂ per consentire i batteri da aggregare.
5. Aggiungere 1 µ l di ceftriaxone diluito seriale (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µ g/mL) in ciascun pozzetto. Lasciare alcuni pozzi non trattate per servire come controlli.
6. Incubare la piastra per 24 h a 37 ° C con 5% CO₂.
7. Sonicare la sospensione 3 volte in ogni pozzetto per 5 s a 144 W e 20 kHz.
8. Aggiungere 100 µ l di reagente di bagliore utilizzazione ATP disponibile in commercio in tutti i pozzetti, Pipettare fino- e giù per 3 volte e incubare per 15 min a 37 ° C con 5% CO₂.
9. Attentamente trasferire 150 µ l di miscela da ogni pozzetto in un nuovo pozzo in una micropiastra 96 pozzetti nero ed evitare di introdurre bolle.
10. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 560 nm utilizzando il lettore di piastra.
11. Calcolare il tasso di sopravvivenza dal rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento di ceftriaxone seriale alla lettura da pozzi non trattati.

3. analisi microscopiche fluorescenza di Live/Dead degli aggregati di GC

1. Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. GC di tampone dalla piastra e risospendere GC in media GCP plus 1% pre-riscaldato Kellogg integratori.
2. Determinare il numero di batteri mediante spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm e regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 10⁷ CFU/mL.
3. Aggiungere 198 µ l della sospensione di GC nelle camere a 8 pozzetti vetrino coprioggetti-fondo.
4. Incubare la camera per 6 h a 37 ° C con 5% CO₂ per permettere la formazione di aggregazione.
5. Aggiungere 2 µ l di ceftriaxone (100 µ g/mL o varie diluizioni) in ogni pozzetto all'interno di ogni condizione di aggregazione. Incubare per il tempo desiderato a 37 ° C con 5% CO₂.
6. Aggiungere 0,6 µ l di miscela di soluzione colorante live/dead in ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C con 5% CO₂.
7. Acquisire immagini di Z-serie utilizzando un microscopio confocale (può essere utilizzato un microscopio equivalente).
8. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ per la misura delle dimensioni degli aggregati di GC e il rapporto di intensità di fluorescenza (FIR) di vivere-a-morti macchiatura in ogni funzione di aggregazione.

4. analisi di immagine

1. Stima delle dimensioni degli aggregati batterici.
   1. Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.
   2. Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione nell'immagine del cerchio.
   3. Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.
   4. Ottenere il numero in una nuova finestra sotto la colonna di zona .
2. Quantificazione del rapporto vive-di-morte di aggregazioni
   1. Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.
   2. Fare clic su analisi | Impostare misure nella barra dei menu di ImageJ.
   3. Controllare la densità integrata nella finestra a comparsa e fare clic su OK.
   4. Fare clic su immagine di | Colore | Canali strumento nella barra dei menu e selezionare il colore.
   5. Controllo canale 1 come la fluorescenza per batteri vivi che macchia.
   6. Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione del cerchio.
   7. Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.
   8. Ottenere il numero nella colonna IntDen .
   9. Verifica canale 2 come la fluorescenza per la macchiatura morto batterica. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.2.8.
   10. Ottenere il rapporto di vive-di-morte dividendo il numero di passaggio 4.2.8 di numero dal passaggio 4.2.9.
3. Analisi statistica
   1. Aprire GraphPad Prism e immettere i numeri ottenuti da ImageJ per la colonna desiderata.
   2. Fare clic su analizza e seleziona t test sotto analisi colonna.
   3. Controllare la colonna desiderata per il confronto e fare clic su OK.
   4. Ottenere il P-valore sotto la finestra di analisi .
   5. Selezionare la Regressione lineare sotto analisi XY dal passaggio 4.3.3
   6. Ottenere la R-quadrato e il P-valore sotto la finestra di analisi.

Due metodi sono stati impiegati: un'analisi di utilizzo di ATP e un saggio di colorazione live/dead. I risultati possono essere combinati o usati individualmente per l'esame di sopravvivenza batterica all'interno di aggregazioni dopo il trattamento antibiotico. Il dosaggio di utilizzazione di ATP è stato indicato per misurare con precisione praticabile batteri Staphylococcus aureus biofilm20,21. Qui, MS11Opa + Pil + ceppo è stato utilizzato per esaminare il ruolo di aggregazione di GC nella suscettibilità agli antibiotici. Dati aggregati non MS11Opa + Pil +, MS11Opa + Pil aggregato +, o aggregati e poi interrotto da sonicazione MS11Opa + Pil + sono stati trattati con diluizioni seriali del ceftriaxone e l'ATP livello misurato (Figura 1A). Nel confrontare la sopravvivenza per cento con e senza trattamento antibiotico, GC pre-aggregati hanno avuti sopravvivenza significativamente più alta che GC non aggregati o aggregazione-perturbato con uguale a o superiore a 0,015 µ g/mL di ceftriaxone (MIC da test di diluizione agar ( Tabella 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa o MS11ΔLgtE, che hanno la stessa diluizione agar MIC (tabella 4), ma formare aggregati più piccoli, è stato esaminato e rispetto a MS11Opa + Pil + (Figura 1B). MS11Opa + Pil +, formando aggregati più grandi, avevano il livello di ATP superiore con ceftriaxone trattamento di ceppi mutanti.

Live/dead macchiatura è stata utilizzata in diversi studi relativi a biofilm/aggregazione22,23. Per determinare l'effetto dell'aggregazione, pre-aggregati MS11Opa + Pil + è stata trattata con o senza ceftriaxone e ripreso. Questo consente sia di visualizzazione (che può essere quantificata) e la distribuzione di GC dal vivo e morto dopo il trattamento antibiotico (Figura 2A- due pannelli a sinistra). I batteri morti (rosso) erano in gran parte situati presso gli strati più esterni, mentre live GC (verde) sono stati situati principalmente nel nucleo di ceftriaxone trattati aggregati. Questa procedura è stata eseguita con MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa o MS11ΔLgtE, per esaminare il tasso di sopravvivenza e dimensioni di aggregazione (Figura 2A). MS11Opa + Pil + è stato indicato per formare il più grande e MS11Opa + Pil-gli aggregati più piccoli (Figura 2A, B). MS11Opa + Pil + aggregati erano ancora vivi nel livello principale mentre GC nella piccole inerti sfusi di MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, e MS11ΔLgtEPil + erano morti (Figura 2A, C). In base alle dimensioni e alla sopravvivenza, un grafico di correlazione possa essere tracciato per esaminare la relazione tra dimensioni di aggregazione e sopravvivenza antibiotico (Figura 2D).

Tabella 1: Ricetta per 1 L di GCK piastra di Agar.

Tabella 2: Ricetta per 1 L di 100 x supplemento di Kellogg.

Tabella 3: Ricetta per 1 L di GCP crescita batterica Media.

Tabella 4: concentrazione inibitoria minima di ceppi di GC trattati con ceftriaxone. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE e MS11Opa + Pil - erano cresciuti e sospeso in GCP. Test di diluizione agar è stata quindi effettuata con seriale concentrazione di ceftriaxone da 0.0016 - 0,25 µ g/mL.

Figura 1 : Dati rappresentativi del tasso di sopravvivenza di GC aggregato nell'ambito del trattamento di ceftriaxone dall'analisi di ATP-utilizzo. Tasso di sopravvivenza di (A) confronto di MS11Opa + Pil + sospensione senza pre-aggregare, pre-aggregare per 6 h o interrompere dopo pre-aggregare per confronto tra tassi di sopravvivenza h. 6 (B) di 6 h aggregati MS11Opa + Pil + con MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + PIL-, o MS11ΔLgtEPil +. Indicati sono valori medi (± DS) ottenuti da tre esperimenti indipendenti. p < 0,001; p < 0.01; p < 0.05. Questa cifra era precedentemente pubblicati 24 ed è usata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Dati rappresentativi della distribuzione live/dead batteri all'interno di aggregati nell'ambito del trattamento di ceftriaxone. (A) pre-aggregate MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, o MS11ΔLgtEPil + era sia incubate in presenza o assenza di 1 µ g/mL ceftriaxone per 2 h. aggregati erano quindi macchiati per visualizzare praticabile (verde) e morti (rosso) GC e visualizzati con microscopio a fluorescenza confocale. Barra della scala: 50 µm. immagini quindi sono state analizzate per dimensioni di aggregazione (B) e (C) rapporto di GC (D), un grafico di correlazione e vive-di-morte quindi è stato creato. Indicati sono valori medi (SD) ottenuti da > 40 immagini di tre esperimenti indipendenti. p < 0,001; p < 0.01; p < 0.05. Questa cifra era precedentemente pubblicati 24ed è usata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.