Un'analisi di ATP-misurazione semplice e live/dead metodo di colorazione sono stati usati per quantificare e visualizzare le gonorree di Neisseria sopravvivenza dopo il trattamento con ceftriaxone. Questo protocollo può essere esteso per esaminare gli effetti antimicrobici di qualsiasi antibiotico e può essere utilizzato per definire la concentrazione inibitoria minima di antibiotici in biofilm batterici.
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Articolo metodologico
L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'emergere di resistenti agli antibiotici Neisseria gonorrhoeae (GC) è una minaccia per la salute in tutto il mondo e mette in evidenza la necessità di identificare gli individui che non riescono di trattamento. Questo batterio gram-negativo causa gonorrea esclusivamente in esseri umani. Durante l'infezione, è in grado di formare aggregati e/o biofilm. Il test di concentrazione inibitoria minima (MIC) è utilizzato per determinare la suscettibilità agli antibiotici e di definire il trattamento adatto. Tuttavia, il meccanismo di eradicazione in vivo e la sua relazione ai risultati di laboratorio non sono noti. È stato sviluppato un metodo che esamina come aggregazione di GC influisce sulla sensibilità agli antibiotici e illustrata la relazione tra dimensioni di aggregazione e di sensibilità agli antibiotici. Quando aggregato GC, sono più resistenti agli antibiotici uccisione, con batteri nel centro della sopravvivenza ceftriaxone trattamento meglio di quelli in periferia. I dati indicano che l'aggregazione di N. gonorrhoeae può ridurre la sua suscettibilità a ceftriaxone, che non trova riscontro utilizzando i metodi MIC basati su piastra di agar standard. Il metodo utilizzato in questo studio permetterà ai ricercatori di testare la suscettibilità batterica in condizioni clinicamente rilevanti.
Introduzione
La gonorrea è che una comune infezione (STI)1trasmesse per via sessuale. Neisseria gonorrhoeae (GC), un batterio gram-negativo diplococcal, è l'agente eziologico di questa malattia. I sintomi dell'infezione genitale possono provocare dolore durante la minzione, dolore genitale generalizzato e scarico uretrale. L'infezione è spesso asintomatica2,3,4,5, e in questo modo estesa colonizzazione. Queste infezioni non trattate sono un problema sanitario importante, come hanno il potenziale per facilitare la trasmissione dell'organismo e questo può portare a complicazioni come la malattia infiammatoria pelvica (PID) e diffuso l'infezione gonococcica (DGI)6. Gonorrea resistente agli antibiotici è una crisi di salute pubblica e un crescente onere socio-economico7. Ridotta sensibilità alle cefalosporine ha provocato il cambiamento di regime di trattamento da un singolo antibiotico a duplice terapia, che combina azitromicina o doxiciclina con ceftriaxone8. Il guasto aumentato di ceftriaxone e azithromycin9,10, in combinazione con le infezioni asintomatiche, evidenzia l'esigenza di comprendere gli insuccessi del trattamento di gonorrea.
La prova di concentrazione inibitoria minima (MIC), tra cui agar diluizione e disco test di diffusione, è stata usata come la prova medica standard per l'identificazione di resistenza ad un antibiotico. Tuttavia, non è chiaro se il MIC test riflette la resistenza antibiotica batterica in vivo. La formazione di biofilm batterici contribuisce alla sopravvivenza di batteri in presenza di concentrazioni battericide di antibiotico: il MIC Test è in grado di rilevare questo effetto11. Perché GC può formare biofilm su superfici mucose12, possiamo ipotizzare che tale antibiotico suscettibilità all'interno di aggregati sarebbe diverso da quello visto in GC individuali. Inoltre, gli studi hanno indicato che la proteina molecole di superficie variabile, Pili, opacità (Opa) a tre fasi, e lipooligosaccharides (LOS), che regolano le interazioni inter-batterio, portare a diversi aggregati di dimensioni13, 14 , 15. il contributo di questi componenti di resistenza agli antibiotico non è stato esaminato a causa della mancanza di metodi adeguati.
Attualmente, ci sono diversi metodi per misurare l'eradicazione biofilm. Il metodo quantitativo più ampiamente usato è misurando i cambiamenti nella biomassa usando cristalvioletto macchiatura16. Tuttavia, il metodo richiede significativi manipolazione sperimentale, che potenzialmente possa generare errori in esperimento ripetizioni17. Il metodo di macchiatura live/dead qui utilizzato permette la visualizzazione di batteri vivi e morti e loro distribuzione all'interno del biofilm. Tuttavia, la struttura di biofilm può rappresentare come una barriera fisica che riduce la penetrazione della tintura. Pertanto, per quantificare i batteri vive/morte all'interno di un gruppo, la colorazione è limitata a piccole biofilm oppure il suo precursore-microcolonies o aggregazioni. Altri metodi, compreso le prove di diffusione agar diluizione e disco, non sono in grado di misurare gli effetti dell'aggregazione. Per esaminare la suscettibilità di GC all'interno di aggregazione dopo esposizione agli antibiotici, un metodo ideale avrebbe bisogno di avere entrambi un dosaggio quantitativo che può misurare batteri vivi e visualizzare la loro distribuzione.
La procedura qui descritta combina una misurazione di ATP-utilizzazione e un live/dead colorazione dosaggio a quantitativamente ed esaminare visivamente la suscettibilità di GC all'interno di aggregati in presenza di antibiotici.
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Protocollo
1. generale manutenzione dei ceppi di GC
- Striscia N. gonorrhoeae ceppi su agar GCK con 1% Kellogg integratori18 (tabella 1, tabella 2) dalle scorte di congelatore e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h. uso MS11 esprimendo la variabile phase Opa (MS11Opa +), nessuna Opa (MS11ΔOpa), o un LOS troncato (MS11ΔLgtE).
- Scegliere attentamente pili negativi (Colonia, senza bordo scuro) o colonie positive (Colonia con bordo scuro) da ogni ceppo basato su Colonia morfologia19 utilizzando un microscopio per dissezione e striscia su un piatto GCK nuovo.
- Incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h prima dell'uso.
2. quantificazione di attuabilità delle aggregazioni di GC
- Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. Tampone di GC dalla piastra e risospendere GC in brodo pre-riscaldato (GCP, tabella 3) completati con 4,2% NaHCO3 e 1% Kellogg soluzioni18. Utilizzare spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm (un OD650 di 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) per determinare la concentrazione di batteri sospesi.
- Regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 108 UFC/mL.
- Aggiungere 99 µ l della sospensione di GC regolata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
- Incubare la piastra per 6 h a 37 ° C con 5% CO2 per consentire i batteri da aggregare.
- Aggiungere 1 µ l di ceftriaxone diluito seriale (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µ g/mL) in ciascun pozzetto. Lasciare alcuni pozzi non trattate per servire come controlli.
- Incubare la piastra per 24 h a 37 ° C con 5% CO2.
- Sonicare la sospensione 3 volte in ogni pozzetto per 5 s a 144 W e 20 kHz.
- Aggiungere 100 µ l di reagente di bagliore utilizzazione ATP disponibile in commercio in tutti i pozzetti, Pipettare fino- e giù per 3 volte e incubare per 15 min a 37 ° C con 5% CO2.
- Attentamente trasferire 150 µ l di miscela da ogni pozzetto in un nuovo pozzo in una micropiastra 96 pozzetti nero ed evitare di introdurre bolle.
- Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 560 nm utilizzando il lettore di piastra.
- Calcolare il tasso di sopravvivenza dal rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento di ceftriaxone seriale alla lettura da pozzi non trattati.
3. analisi microscopiche fluorescenza di Live/Dead degli aggregati di GC
- Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. GC di tampone dalla piastra e risospendere GC in media GCP plus 1% pre-riscaldato Kellogg integratori.
- Determinare il numero di batteri mediante spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm e regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 107 CFU/mL.
- Aggiungere 198 µ l della sospensione di GC nelle camere a 8 pozzetti vetrino coprioggetti-fondo.
- Incubare la camera per 6 h a 37 ° C con 5% CO2 per permettere la formazione di aggregazione.
- Aggiungere 2 µ l di ceftriaxone (100 µ g/mL o varie diluizioni) in ogni pozzetto all'interno di ogni condizione di aggregazione. Incubare per il tempo desiderato a 37 ° C con 5% CO2.
- Aggiungere 0,6 µ l di miscela di soluzione colorante live/dead in ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C con 5% CO2.
- Acquisire immagini di Z-serie utilizzando un microscopio confocale (può essere utilizzato un microscopio equivalente).
- Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ per la misura delle dimensioni degli aggregati di GC e il rapporto di intensità di fluorescenza (FIR) di vivere-a-morti macchiatura in ogni funzione di aggregazione.
4. analisi di immagine
- Stima delle dimensioni degli aggregati batterici.
- Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.
- Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione nell'immagine del cerchio.
- Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.
- Ottenere il numero in una nuova finestra sotto la colonna di zona .
- Quantificazione del rapporto vive-di-morte di aggregazioni
- Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.
- Fare clic su analisi | Impostare misure nella barra dei menu di ImageJ.
- Controllare la densità integrata nella finestra a comparsa e fare clic su OK.
- Fare clic su immagine di | Colore | Canali strumento nella barra dei menu e selezionare il colore.
- Controllo canale 1 come la fluorescenza per batteri vivi che macchia.
- Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione del cerchio.
- Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.
- Ottenere il numero nella colonna IntDen .
- Verifica canale 2 come la fluorescenza per la macchiatura morto batterica. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.2.8.
- Ottenere il rapporto di vive-di-morte dividendo il numero di passaggio 4.2.8 di numero dal passaggio 4.2.9.
- Analisi statistica
- Aprire GraphPad Prism e immettere i numeri ottenuti da ImageJ per la colonna desiderata.
- Fare clic su analizza e seleziona t test sotto analisi colonna.
- Controllare la colonna desiderata per il confronto e fare clic su OK.
- Ottenere il P-valore sotto la finestra di analisi .
- Selezionare la Regressione lineare sotto analisi XY dal passaggio 4.3.3
- Ottenere la R-quadrato e il P-valore sotto la finestra di analisi.
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Risultati
Due metodi sono stati impiegati: un'analisi di utilizzo di ATP e un saggio di colorazione live/dead. I risultati possono essere combinati o usati individualmente per l'esame di sopravvivenza batterica all'interno di aggregazioni dopo il trattamento antibiotico. Il dosaggio di utilizzazione di ATP è stato indicato per misurare con precisione praticabile batteri Staphylococcus aureus biofilm20,21. Qui, MS11Opa + Pil + ceppo...
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Discussione
I batteri possono formare biofilm durante l'infezione del corpo umano. Test di MIC tradizionale potrebbe non riflettere la concentrazione necessaria per sradicare i batteri nel biofilm. Per verificare gli effetti antimicrobici su un biofilm, metodi basati sulla biomassa di biofilm, nonché CFUs di placcatura possono essere errati a causa dell'impatto della struttura del biofilm. Ad esempio, il metodo di placcatura funziona solo se il biofilm può essere interrotta. Quindi, il CFU ottenuto può essere inferiore rispetto al n...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Institute of Health D.C.S e W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., ed E.N. sono stati sostenuti in parte/partecipare al programma "Il primo anno l'innovazione & ricerca Experience" finanziato dall'Università del Maryland. I finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Riconosciamo l'UMD CBMG Imaging Core per tutti gli esperimenti di microscopia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100x integratore | |||
| Agar | Stati Uniti Biologico | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC base media | BD | 228950 | |
| Nitrato ferrico, nonaidrato | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucosio | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutammina Polvere cristallina | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight colorazione viva/morta | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae ceppo | gentilmente fornito dal Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute per Ricerca | ||
| Potassio fosfato bibasico (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassio fosfato monobasico (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteoso Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Amido solubile | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Tiamina pirofosfato | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Attrezzatura | |||
| Piastre di Petri | VWR | 25384-302 | |
| a 8 pozzetti camera inferiore del vetrino coprioggetti | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Piastre per colture tissutali a 96 pozzetti | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Classe II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubatore | Fisher Scientific | Modello 3530 | |
| Microscopio confocale dotato di camera di imaging dal vivo | Leica | SP5X | |
| Corning 96 pozzetti Micropiastra in polistirene nero | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminatore | Promega | E6521 | |
| Puntali per pipette (0,1-10 &; micro; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Puntali per pipette (1000 &; micro; L) | VWR | 83007-382 | |
| Puntali per pipette (200 µ L) | VWR | 53509-007 | |
| Spettrofotometro Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Provette coniche sterili da 15 ml | VWR | 21008-216 | |
| Provette sterili per microcentrifuga (1,7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Applicatori sterili con punta in poliestere | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivalente a 9110001 |
Riferimenti
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