Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Bernard T. Drumm; Grant W. Hennig; Salah A. Baker; Kenton M. Sanders

doi:10.3791/58989

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Articolo metodologico

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca^{2 +} In Situ

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DOI:

10.3791/58989

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7 gennaio 2019

Bernard T. Drumm¹ , Grant W. Hennig² , Salah A. Baker¹ , Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

In questo articolo

Sommario

Indicatori di codificato geneticamente Ca^{2 +} (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca^{2 +} imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca^{2 +} segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca^{2 +} segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

Abstract

CA^{2 +} imaging di cellule isolate o tipi specifici di cellule all'interno dei tessuti intatti spesso rivela modelli complessi di segnalazione di Ca^{2 +} . Questa attività richiede un'attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca^{2 +} segnali quali frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire qualche informazione biologiche necessarie per la segnalazione intracellulare. Alta risoluzione Ca^{2 +} imaging in genere comporta la successiva acquisizione di file di dati di grandi dimensioni che richiedono molto tempo al processo in termini di tradurre le informazioni di imaging in dati quantificabili e questo processo può essere suscettibile di pregiudizi e di errore umano. Analisi di Ca^{2 +} segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da arbitrariamente selezionate regioni di interesse (ROI) all'interno di un campo visivo (FOV). Questo approccio ignora gran parte le informazioni di segnalazione importante contenute nel FOV. Quindi, al fine di massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione ottenute con Ca^{2 +}coloranti o optogenetica Ca^{2 +}imaging, appropriata analisi spaziale e temporale dei segnali Ca^{2 +} è necessario. I protocolli illustrati in questo articolo descriverò come un volume elevato di dati possa essere ottenuto da Ca^{2 +} imaging registrazioni per facilitare la più completa analisi e quantificazione del Ca^{2 +} segnali registrati dalle celle usando una combinazione di Mappa spazio-temporale (STM)-basato su analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca^{2 +} segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l'illustrazione, esaminerà il metodo Ca^{2 +} segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC), utilizzando GECIs.

Introduzione

CA^{2 +} è un messaggero intracellulare onnipresente che controlla una vasta gamma di processi cellulari, come muscolo contrazione¹^,², metabolismo³, cella proliferazione³^,⁴^, ⁵, stimolazione del rilascio di neurotrasmettitore a nervo terminali⁶^,⁷e l'attivazione della trascrizione fattori nel nucleo. ⁷ intracellulare Ca^{2 +} segnali spesso assumere la forma di aumenti transitori in citosolico Ca