Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni in acido deossiribonucleico (DNA). Questo protocollo viene descritto come eseguire la mutagenesi sito-diretta con un passaggio 2 e 3-passo catena della polimerasi (PCR) base di approccio, che è applicabile a qualsiasi frammento di DNA di interesse.
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Articolo metodologico
Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni nel DNA per studiare l'interazione tra piccole molecole di acido ribonucleico (sRNA) di non-codificazione e destinazione RNA messaggeri (mRNA). Inoltre, mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per mappare i siti di legame della proteina specifica a RNA. Una 2-step e step 3 Introduzione PCR basata delle mutazioni è descritto. L'approccio è rilevante per tutte le proteine-RNA e studi di interazione di RNA-RNA. In breve, la tecnica si basa sulla progettazione degli iniettori con la mutazione desiderata e attraverso 2 o 3 passaggi di PCR sintetizzando un prodotto PCR con la mutazione. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato per la clonazione. Qui, descriviamo come eseguire mutagenesi sito-diretta con entrambi l'approccio 2 - e 3-step per introdurre mutazioni il sRNA, McaS e il mRNA, csgD, per studiare le interazioni RNA-proteine e RNA-RNA. Applichiamo questa tecnica per studiare le interazioni RNA; Tuttavia, la tecnica è applicabile a tutti gli studi di mutagenesi (ad es., interazioni della DNA-proteina, amminoacido sostituzione/eliminazione/aggiunta). È possibile introdurre qualsiasi tipo di mutazione tranne per basi non naturali, ma la tecnica è applicabile solo se un prodotto PCR può essere usato per applicazione a valle (ad es., clonazione e modello per ulteriore PCR).
Introduzione
DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o....
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Protocollo
1. selezione vettoriale
- Scegliere un vettore per eseguire esperimenti a valle con. Ogni vettore è applicabile per questo metodo PCR 2 - e 3-step.
- Sulla scelta del vettore di base, scegliere enzimi di restrizione appropriati per la clonazione.
2. primer design per sito diretto mutagenesi
- Decidere tra la strategia PCR 2-passaggio o 3 (2-step è solo per le mutazioni < 200 bp da entrambe le estremità del DNA di interesse). Per la PCR 2-step, andare al passaggio 2.2 e la PCR-step 3 Vai al punto 2.3.
- Disegnare primers per PCR 2-step.
- Disegno primer 1 e 3 per amplificare il DNA di interesse e c....
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Risultati
Per indagare le interazioni RNA per quanto riguarda la regolazione post-trascrizionale di CDLS, è stata scelta una configurazione doppia vettoriale: uno per esprimere la csgD mRNA e un altro per esprimere il piccolo RNA non codificante, McaS. CDLS è stato clonato in pBAD33, che è un plasmide di medio-copia inducibile di arabinosio con resistenza al cloramfenicolo e McaS è stato clonato in mini pNDM220 R1, che è un plasmide di viscoelastica copia basso isopropili.......
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Discussione
Mutagenesi sito-diretta ha una vasta gamma di applicazioni diverse, e qui, risultati rappresentativi da un esperimento in vitro ed una in vivo sono stati inclusi come esempi di come fare conclusioni biologici usando la tecnica. Mutagenesi sito-diretta ha per lungo tempo lo standard d'oro per gli studi di interazione di RNA. La forza della tecnica risiede nella combinazione di introdurre rilevanti mutazioni con dosaggi a valle ed esperimenti (ad es., macchia occidentale o EMSA) per trarre conclusioni sui siti specifici de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare borse di studio di Università della Danimarca meridionale accesso aperto politica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-GroEL prodotto nel coniglio | Merck | G6532 | Anticorpo primario |
| Azure c200 | Azure | NA | Stazione di imaging su gel Oligo |
| di DNA personalizzato | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spettrofotometro per misurazioni di acidi nucleici |
| Colorante di caricamento su gel di DNA (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Soluzione di bromuro di etidio 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| Kit di estrazione su gel GeneJET | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Provette per dialisi per elettroeluizione |
| MEGAscript T7 Kit di trascrizione | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Sistema di elettroforesi |
| orizzontale Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2 prodotto nel topo | Merck | F3165 | Anticorpo primario |
| Immunoglobuline di topo Citazione | Dako P0447 | HRP anticorpo secondario coniugato | |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | Purificazione dell'RNA |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Gel Bis-Tris per la separazione delle proteine |
| Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF | New England Biolabs | M0531S | DNA polimerasi |
| PowerPac HC Alimentatore ad alta corrente | Bio-Rad | 1645052 | |
| Immunoglobuline di coniglio | Dako Cytomation | P0448 | HRP coniugato anticorpo secondario |
| SeaKem LE Agarosio | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Strumento software per grafici e analisi dei dati |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR macchina |
| T4 DNA ligasi New | England Biolabs | M0202 | Ligasi |
| T4 Polinucleotide chinasi | New England Biolabs | M0201S | |
| tampone TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
Riferimenti
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lif....
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Ristampe e permessi
