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Articolo metodologico

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

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⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

5 febbraio 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

In questo articolo

Sommario

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni in acido deossiribonucleico (DNA). Questo protocollo viene descritto come eseguire la mutagenesi sito-diretta con un passaggio 2 e 3-passo catena della polimerasi (PCR) base di approccio, che è applicabile a qualsiasi frammento di DNA di interesse.

Abstract

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni nel DNA per studiare l'interazione tra piccole molecole di acido ribonucleico (sRNA) di non-codificazione e destinazione RNA messaggeri (mRNA). Inoltre, mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per mappare i siti di legame della proteina specifica a RNA. Una 2-step e step 3 Introduzione PCR basata delle mutazioni è descritto. L'approccio è rilevante per tutte le proteine-RNA e studi di interazione di RNA-RNA. In breve, la tecnica si basa sulla progettazione degli iniettori con la mutazione desiderata e attraverso 2 o 3 passaggi di PCR sintetizzando un prodotto PCR con la mutazione. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato per la clonazione. Qui, descriviamo come eseguire mutagenesi sito-diretta con entrambi l'approccio 2 - e 3-step per introdurre mutazioni il sRNA, McaS e il mRNA, csgD, per studiare le interazioni RNA-proteine e RNA-RNA. Applichiamo questa tecnica per studiare le interazioni RNA; Tuttavia, la tecnica è applicabile a tutti gli studi di mutagenesi (ad es., interazioni della DNA-proteina, amminoacido sostituzione/eliminazione/aggiunta). È possibile introdurre qualsiasi tipo di mutazione tranne per basi non naturali, ma la tecnica è applicabile solo se un prodotto PCR può essere usato per applicazione a valle (ad es., clonazione e modello per ulteriore PCR).

Introduzione

DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o telaio-turni). Mentre molte mutazioni non influiscano significativamente funzione del gene, alcune mutazioni nel DNA possono avere implicazioni enormi. Così, la mutagenesi sito-diretta è uno strumento prezioso per studiare l'importanza dei siti specifici di DNA a tutti i livelli.

Questo protocollo descrive un approccio di mutagenesi mirata utilizzato per introdurre mutazioni specifiche. Il protocollo si basa su due diverse strategie di PCR: un passaggio 2 o un 3-passo PCR. La PCR 2-step è applicabile se la mutazione desiderata è vicino l'estremità 5' o estremità 3' del DNA di interesse (< 200 paia di basi (bp) dalla fine) e la PCR-step 3 è applicabile in tutti i casi.

L'approccio di PCR 2-step, 3 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 3, avanti e indietro, rispettivamente) e un singolo primer è progettato per incorporare la mutazione. La mutazione introducendo primer (primer 2) dovrebbe avere un orientamento inverso se la mutazione è vicino l'estremità 5' e un orientamento anteriore se la mutazione è vicino all'estremità 3'. Nel primo passaggio PCR, primer 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un piccolo frammento vicino l'estremità 5' o 3' estremità, rispettivamente. Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer nel passaggio due con primer 1 o 3, con il risultato di un prodotto PCR con una mutazione nel DNA di interesse (Figura 1A).

Nella PCR 3 fasi, 4 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 4, avanti e indietro, rispettivamente) e un set di primer è progettato per incorporare specifiche mutazioni con sovrapposizione di complementarità (primer, 2 e 3, invertire e inoltrare, rispettivamente). Al passo uno e due, primer 1 + 2 e 3 + 4 amplificare l'estremità 5' e 3'. Nel passaggio 3, i prodotti PCR ottenuti da passo uno e due sono utilizzati come modelli e amplificati con i primer 1 + 4. Così, il prodotto PCR risultante è il DNA di interesse con la mutazione desiderata (Figura 1B).

Mentre il DNA mutato può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle, questo protocollo viene descritto come combinare nuovamente il DNA in un vettore di clonazione. L'uso di vettori di clonazione ha diversi vantaggi come la facilità di clonazione e applicazioni sperimentali specifiche a seconda delle caratteristiche del vettore. Questa caratteristica viene spesso utilizzata per studi di interazione di RNA. Un'altra tecnica per studi di interazione di RNA è strutturale di sondaggio del RNA in complesso con un altro RNA1,2 o proteina3,4. Tuttavia, sondando strutturale viene eseguita solo in vitro mentre mutagenesi sito-diretta e successiva clonazione permettono per studi di interazione in vivo.

Mutagenesi sito-diretta è stato ampiamente utilizzata per studi di interazione di RNA come presentato qui. Tuttavia, il metodo chiave per quanto riguarda 2 - o 3-step PCR è applicabile a qualsiasi pezzo di DNA e così non solo limitato agli studi di RNA-interazione.

Per esemplificare la tecnica e i suoi possibili usi, caratterizzazione delle regioni importanti per la regolazione post-trascrizionale del mRNA, csgD, di Escherichia coli (Escherichia coli) è usato. In e. coli, csgD è mirato di piccolo RNA non codificanti, McaS, in collaborazione con una proteina, Hfq, di reprimere l'espressione della proteina di CsgD2,4,5. La tecnica è utilizzata per introdurre le mutazioni nella regione di appaiamento tra csgD e McaS e per il sito di legame Hfq di CDLS. Il DNA ottenuto è quindi clonato in un vettore adatto per esperimenti successivi. Applicazioni a valle della tecnica includono gli esperimenti sia in vitro che in vivo. Per l'illustrazione, esempio 1 è caratterizzata in vivo usando un'analisi di western blot ed esempio 2 è caratterizzato in vitro utilizzando un'analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA). In entrambi i casi, è illustrata come mutagenesi sito-può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche per rendere biologici conclusioni circa un gene di interesse.

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Protocollo

1. selezione vettoriale

  1. Scegliere un vettore per eseguire esperimenti a valle con. Ogni vettore è applicabile per questo metodo PCR 2 - e 3-step.
  2. Sulla scelta del vettore di base, scegliere enzimi di restrizione appropriati per la clonazione.

2. primer design per sito diretto mutagenesi

  1. Decidere tra la strategia PCR 2-passaggio o 3 (2-step è solo per le mutazioni < 200 bp da entrambe le estremità del DNA di interesse). Per la PCR 2-step, andare al passaggio 2.2 e la PCR-step 3 Vai al punto 2.3.
  2. Disegnare primers per PCR 2-step.
    1. Disegno primer 1 e 3 per amplificare il DNA di interesse e con un 5' sporgenza che contiene 4 nucleotidi (ad es., ATAT o AGCT) seguite dal sito di riconoscimento restrizioni pertinenti necessario per clonare nel vettore scelto.
    2. Disegno primer 2 per introdurre mutazioni presso le sedi del desiderato e fiancheggiano la mutazione con 10-15 nucleotidi complementari su entrambi i lati. Rendere il primer inverso se la mutazione è stato introdotto all'estremità 5' o in avanti se la mutazione è stato introdotto all'estremità 3'.
  3. Disegnare primers per PCR-step 3.
    1. Disegno primer 1 e 4 per amplificare il DNA di interesse e con un 5' sporgenza che contiene 4 nucleotidi (ad es., ATAT o AGCT) seguite dal sito di riconoscimento restrizioni pertinenti necessario per clonare nel vettore scelto.
    2. Disegno primer 2 e 3 di introdurre mutazioni presso sedi desiderata e fiancheggiano la mutazione da 10-15 nucleotidi complementari su entrambi i lati. Primer, 2 e 3 sono invertire complementari.

3. l'amplificazione di PCR di tipo selvaggio del DNA per la clonazione

Nota: Per informazioni dettagliate sulla PCR, vedere6.

  1. Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 (2-step PCR) o 1 + 4 (3-step PCR) e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere I. prodotto di PCR uso il programma PCR nella tabella 1.
  2. Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.
    1. Fare un'agarosi gel soluzione (2%) aggiungendo 2 g di agarosio per 100 mL di Tris-acetato-Acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (TAE) tampone 1x. Sciogliere l'agarosio facendo bollire in un forno a microonde. Aggiungere il bromuro di etidio colorante macchiatura del DNA (a una concentrazione finale di ~ 0,5 µ g/mL) a agarose gel soluzione per la visualizzazione.
    2. Eseguire il cast del gel dell'agarosi, inserirlo in un'unità di elettroforesi e caricare campioni PCR (mescolati con tintura di caricamento del DNA) e una scala di DNA di dimensioni note. Eseguire campioni a 75 W per 45 minuti, o fino a quando le bande sono separate in modo adeguato e visualizzate le fasce a un tavolo di ultravioletti (UV) o con un gel sistema di imaging.
  3. Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
  4. Conservare il DNA purificato a-20 ° C (in tampone Tris-EDTA (TE) – stoccaggio a lungo termine) o a 4 ° C (in dH2O – deposito a breve termine) fino al momento utilizzato nel passaggio 5.

4. PCR per introdurre sito-diretta di mutazioni nel DNA

  1. PCR per 2-step PCR (Vedi punto 4.2 per PCR-step 3)
    1. Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 se le mutazioni sono all'estremità 5' o 2 + 3 se le mutazioni sono in 3' fine e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere il prodotto di PCR II (Vedi tabella 1 per programma PCR).
    2. Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
    3. Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
    4. Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino a quando usato nel passaggio 5.
    5. Eseguire PCR6 utilizzando il prodotto di PCR II come l'iniettore con primer 3 se le mutazioni sono nell'estremità 5' o primer 1 se le mutazioni sono in estremità 3' e utilizzano come modello per ottenere il prodotto di PCR III il DNA wild-type (Vedi tabella 1 per programma PCR).
    6. Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
    7. Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
    8. Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino al passo 5.
  2. PCR per PCR-step 3
    1. Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 e 3 + 4 in reazioni separate e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere il prodotto di PCR II e III (vedere tabella 1 per programma PCR).
    2. Convalidare PCRs mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
    3. Purificare i prodotti di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
    4. Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O).
    5. Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 4 e utilizzare 2-5 ng di entrambi i prodotti PCR II e III come i modelli (nella stessa reazione) per ottenere IV del prodotto PCR (Vedi tabella 1 per programma PCR).
    6. Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
      Nota: Non è insolito ottenere diverse bande non corretti (a volte può essere ridotto utilizzando meno modello). Tuttavia, i prodotti di PCR non corretti possono essere ignorati se la band correttamente dimensionata è asportata e gel-estratta.
    7. Se è corretta, purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
    8. Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino al passo 5.

5. ricombinazione di wild type e mutanti versioni del DNA nel vettore selezionato

Nota: Per informazioni dettagliate sulla procedura, vedere7.

  1. Digest purificato i prodotti di PCR I e III (da 2-step PCR) e/o IV (da 3-step PCR) usando gli enzimi di restrizione pertinenti.
    1. In 20 µ l di tampone di digestione 1x con 1 µ l di ciascun enzima di restrizione, digest 200 ng del prodotto PCR a 37 ° C per 30-60 min.
  2. Purificare il prodotto di PCR digerito di estrazione del gel-utilizzando un kit di estrazione del gel (Tabella materiali), misurare la concentrazione di DNA di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali) e conservare a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2 O) fino a quando non utilizzato per passo 5.6.
  3. Digerire purificata vettoriale con enzimi di restrizione pertinenti e trattare con fosfatasi alcalina per diminuire vettoriale ri-legatura eventi. Non trattare i prodotti di PCR con fosfatasi alcalina.
    1. In 30 µ l di tampone di digestione con 1 µ l di ciascun enzima di restrizione e 1 µ l della fosfatasi alcalina, digest 1.000 ng del vettore a 37 ° C per 30-60 min 1x.
  4. Vettore digerito separato dal DNA dei rifiuti (ad es., uncut vettoriale e cut-out DNA) mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
  5. Purificare il vettore digerito con estrazione del gel-utilizzando un kit di estrazione del gel (Tabella materiali), misurare la concentrazione di DNA di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali) e conservare a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino a quando non utilizzato per passo 5.6.
  6. Lega i prodotti di PCR digeriti nel vettore digerito con le reazioni specificate nella tabella 2.
  7. Incubare a temperatura ambiente per 2 h o una notte a 16 ° C.
  8. Trasformare ceppo destinatario (ad es., Escherichia coli K12) con reazioni di legatura.
    1. Crescere il ceppo a OD600= 0.3-0.5 e trasferimento un 1 mL della coltura come molti nelle provette da 1,5 mL come reazioni ligasi.
    2. Spin a 3.500 x g per 5 min e gettare il surnatante.
    3. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di trasformazione (10 mL di brodo di Lisogenesi (LB) con 0,1 g/mL in polietilene glicole 3350, 5% dimetil solfato e 20 mM MgCl2).
    4. Aggiungere la reazione di legatura e posizionare le provette in ghiaccio per 30 min.
    5. Shock termico per 2 min a 42 ° C.
    6. Aggiungere 1 mL di LB le provette da 1,5 mL e permettere l'espressione fenotipica della resistenza agli antibiotico per almeno 45 min a 37 ° C.
    7. Girare le cellule a 3.500 x g per 5 min, scartare 1 mL di surnatante e risospendere le cellule nel surnatante rimanente.
    8. Le cellule sulle piastre del piatto con gli antibiotici adatti e incubare per una notte a 37 ° C.
  9. Identificare trasformanti che harboring vettori con successo integrazione dell'inserto di DNA (ad esempio, mediante PCR utilizzando primers specifici del vettore e inserto).
  10. Convalidare la sequenza del DNA di sanger sequenziamento.
    Attenzione: Non utilizzare il primer stesso per la sequenza come usato per passo 5.9.

6. utilizzando vettori costruiti per gli esperimenti in vitro o in vivo

  1. Esperimento in vivo
    Nota: Questo è un esempio di utilizzo di un vettore per esprimere il tipo selvaggio/mutato RNA per caratterizzare la regolazione post-trascrizionale. Per ulteriori dettagli su macchiarsi occidentale, Vedi8.
    1. Crescere di ceppi di Escherichia coli K12 con vettori costruiti su mezzo adeguato e indurre l'espressione se necessario. Raccolta campioni mediante centrifugazione.
    2. Preparare i campioni per elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) sciogliendo il pellet cellulare in 1x tampone campione SDS (62,5 mM Tris-HCl a pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% di blu di bromofenolo, β-mercaptoetanolo 5%, 10% glicerolo) e far bollire a 95 ° C per 5 min.
      Nota: È possibile eseguire il cast un gel o utilizzare un gel prefabbricato disponibile in commercio. Quest'ultimo è stato utilizzato i risultati presentati in Figura 3 (Tabella materiali).
    3. Caricare 107 cellule di ogni campione in pozzetti separati (includere una scala di proteine) ed eseguire gel a 200 V, fino a quando le proteine sono separate (circa 45 min).
    4. Macchia le proteine su una membrana di cellulosa di trasferimento semi-secco a 80 mA per 1 h.
    5. Bloccare la membrana con una miscela di proteine (per esempio, 5% latte in polvere sciolto in 1 x Tween 20-Tris-buffered saline tampone (Immunotyping)).
    6. Aggiungere anticorpo primario (disciolto in 1 x TTBS buffer) che la proteina di interesse (ad es., GFP, bandiera o proteina HIS-Tag) di destinazione e incubare per 1 h con agitazione delicata.
    7. Lavare la membrana in 1 x TTBS per 10 min per rimuovere gli anticorpi non legati. Ripetere due volte più.
    8. Aggiungere anticorpo secondario (disciolto in 1 x TTBS buffer) che gli obiettivi gli anticorpi primari e consentire il rilevamento (ad es., perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpi secondari. Incubare per 1 h con agitazione delicata.
    9. Lavare la membrana in 1 x TTBS per 10 min per rimuovere gli anticorpi non legati. Ripetere due volte più.
    10. Visualizzare la membrana con una tecnica compatibile con gli anticorpi secondari (per esempio, da imaging dopo incubazione con una chemiluminescenza luminol-derivato, se è stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato HRP).
  2. Esperimento in vitro
    Nota: Questo è un esempio di utilizzo il vettore come un modello per trascrizione in vitro di RNA per caratterizzare le interazioni RNA-proteina. Per ulteriori dettagli su EMSA, vedere9.
    1. Rendere le trascrizioni in vitro utilizzando un T7 in vitro trascrizione kit (Tabella materiali) e vettori dal passaggio 5 come modelli.
    2. Separare i trascritti di RNA di pagina su un 4,5% 7m urea denaturante gel ed estrarre RNA direttamente dal gel di electro eluizione con tubi di dialisi (Tabella materiali).
    3. Etichetta di RNA (ad es., radiolabeling con γ -32P-ATP utilizzando chinasi di polinucleotide T4 (Tabella materiali) e purificare nuovamente con colonne (Tabella materiali).
      Attenzione: Prima di lavorare con materiale radioattivo, consultare il responsabile della sicurezza di radiazione locale.
    4. Mescolare etichettati-RNA con aumento delle concentrazioni di proteina in reazioni separate in un 1x buffer obbligatorio (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)).
      Nota: nei risultati presentati (Figura 4), 2 nM di radiomarcato csgD mRNA è stato mescolato con una sfumatura di proteina Hfq di 0 a 2 µM (concentrazione di monomero).
    5. Consentire di proteine e RNA per ibridare prima di caricare la miscela di ibridazione su un gel di poliacrilammide non-denaturante ed eseguire il gel per 1,5 h a 200 V.
    6. Visualizzare il gel con una tecnica compatibile con l'etichettatura dal punto 6.1.3. (ad es., da phosphoimaging se radiomarcatura è stato applicato).
    7. Quantificare l'intensità relativa delle bande spostate con una programma di elaborazione delle immagini e forma una curva (sigmoidale) ai dati utilizzando un grafico e il software di analisi dati (Tabella materiali). Basato sulla curva componibile, valori (Kd) costanti di dissociazione possono essere determinati automaticamente con il software.

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Risultati

Per indagare le interazioni RNA per quanto riguarda la regolazione post-trascrizionale di CDLS, è stata scelta una configurazione doppia vettoriale: uno per esprimere la csgD mRNA e un altro per esprimere il piccolo RNA non codificante, McaS. CDLS è stato clonato in pBAD33, che è un plasmide di medio-copia inducibile di arabinosio con resistenza al cloramfenicolo e McaS è stato clonato in mini pNDM220 R1, che è un plasmide di viscoelastica copia basso isopropili...

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Discussione

Mutagenesi sito-diretta ha una vasta gamma di applicazioni diverse, e qui, risultati rappresentativi da un esperimento in vitro ed una in vivo sono stati inclusi come esempi di come fare conclusioni biologici usando la tecnica. Mutagenesi sito-diretta ha per lungo tempo lo standard d'oro per gli studi di interazione di RNA. La forza della tecnica risiede nella combinazione di introdurre rilevanti mutazioni con dosaggi a valle ed esperimenti (ad es., macchia occidentale o EMSA) per trarre conclusioni sui siti specifici de...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare borse di studio di Università della Danimarca meridionale accesso aperto politica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo anti-GroEL prodotto nel coniglioMerckG6532Anticorpo primario
Azure c200AzureNAStazione di imaging su gel Oligo
di DNA personalizzatoMerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNASpettrofotometro per misurazioni di acidi nucleici
Colorante di caricamento su gel di DNA (6X)Thermo ScientificR0611
Soluzione di bromuro di etidio 1 %Carl Roth2218.1
Kit di estrazione su gel GeneJETThermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12Provette per dialisi per elettroeluizione
MEGAscript T7 Kit di trascrizioneInvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406Sistema di elettroforesi
orizzontale Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2 prodotto nel topoMerckF3165Anticorpo primario
Immunoglobuline di topo CitazioneDako P0447HRP anticorpo secondario coniugato
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971Purificazione dell'RNA
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermo ScientificNP0323BOXGel Bis-Tris per la separazione delle proteine
Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HFNew England BiolabsM0531SDNA polimerasi
PowerPac HC Alimentatore ad alta correnteBio-Rad1645052
Immunoglobuline di coniglioDako CytomationP0448HRP coniugato anticorpo secondario
SeaKem LE AgarosioLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNAStrumento software per grafici e analisi dei dati
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096PCR macchina
T4 DNA ligasi NewEngland BiolabsM0202Ligasi
T4 Polinucleotide chinasiNew England BiolabsM0201S
tampone TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49

Riferimenti

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
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  8. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
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  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
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