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Articolo metodologico

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

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DOI:

10.3791/59008

⸱

19 marzo 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

In questo articolo

Sommario

Una serie di metodi di immobilizzazione è stata stabilita per consentire l'irradiazione mirata di live Caenorhabditis elegans individui che utilizzano un microfluidici recentemente sviluppati polidimetilsilossano ultra-sottile chip con ritenzione idrica. Questa romanzo immobilizzazione su chip è anche sufficiente per osservazioni di imaging. Il trattamento dettagliata ed esempi di applicazione del chip sono spiegati.

Abstract

Radiazione è ampiamente usato per applicazioni biologiche e per l'allevamento del fascio di ioni, e tra questi metodi, microbeam irradiazione rappresenta un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti negli organismi viventi. Questo articolo descrive una serie di metodi di immobilizzazione su chip sviluppato per l'irradiazione di microbeam mirata degli individui dal vivo di Caenorhabditis elegans. In particolare, il trattamento dei chip microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) che abbiamo precedentemente sviluppato per immobilizzare gli individui di c. elegans senza la necessità per l'anestesia è spiegato in dettaglio. Questo chip, indicato come un foglio di vite senza fine, è resiliente per consentire i canali microfluidici essere ampliato e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali. Inoltre, il foglio di vite senza fine Mostra la ritenzione idrica e permette agli individui di c. elegans di essere sottoposti ad osservazione microscopica per lunghi periodi in condizioni live. Inoltre, il foglio è solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti ad esempio ioni carbonio di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali, consentendo in tal modo le particelle di ioni essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Perché la selezione dei film di copertura utilizzato per racchiudere gli animali è molto importante per il successo a lungo termine immobilizzazione, abbiamo condotto la selezione dei film copertura adeguata e ha mostrato un consigliato uno tra alcuni film. Come un esempio di applicazione del chip, abbiamo introdotto imaging osservazione delle attività muscolare degli animali che racchiude il canale di microfluidica del foglio di vite senza fine, come pure l'irradiazione microbeam. Questi esempi indicano che i fogli di vite senza fine hanno notevolmente ampliato le possibilità per gli esperimenti biologici.

Introduzione

Radiazioni, tra cui i raggi x, raggi gamma e fascio di ioni pesanti, sono ampiamente usato per applicazioni biologiche come nella diagnosi del cancro e nel trattamento e per l'allevamento del fascio di ioni. Numerosi studi e sviluppi tecnici si stanno attualmente concentrando sugli effetti della radiazione1,2,3. Microbeam irradiazione è un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti nel vivere organismi4. Il Takasaki Advanced radiazione ricerca Istituto di istituti nazionali per Quantum e radiologici Science and Technology (QST-Takasaki) ha sviluppato una tecnologia per irradiare le cellule individuali sotto osservazione microscopica utilizzando ioni pesanti microfasci5e ha stabilito i metodi per consentire l'irradiazione di microbeam mirato di diversi modelli animali, quali il nematode Caenorhabditis elegans4,6, bachi da seta7e Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Microbeam mirati irradiazione della del nematode c. elegans permette l'efficace atterramento di specifiche regioni, come l'anello del nervo nella regione cefalica, contribuendo così a identificare i ruoli di questi sistemi in processi quali la locomozione.

Un metodo per l'immobilizzazione su chip di c. elegans individui senza la necessità di anestesia è stato sviluppato per consentire microbeam irradiazione4. Inoltre, per migliorare il chip microfluidici utilizzato nel precedente studio4, abbiamo recentemente sviluppato chip microfluidici bagnabile, ione-penetrabile, polidimetilsilossano (PDMS), indicato come fogli di vite senza fine (Vedi Tabella materiali), per immobilizzazione di c. elegans individui9. Questi comprendono lenzuola morbide ultra-sottile (spessore = 300 µm; larghezza = 15 mm; lunghezza = 15 mm) con più canali microfluidici dritto (20 o 25) (profondità = 70 µm; larghezza = 60 µm o 50 µm; lunghezza = 8 mm) sulla superficie (Figura 1A-D). I canali microfluidici sono aperti e permettere agli animali di più di essere racchiuso tra loro simultaneamente (Figura 1E). I fogli sono resistenti per permettere i canali microfluidici essere ampliato (da ~ 10%, Figura 1,F), e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali.

I canali non fanno male i vermi quando sono essere racchiusi o quando sono stati raccolti. Inoltre, i fogli sono realizzati da PDMS, che è essenzialmente idrofobico, ma ritenzione idrica può essere raggiunto da impartire idrofilia del materiale. La ritenzione idrica e lo spessore sono caratteristiche favorevoli dei fogli vite senza fine. La capacità di ritenzione idrica previene la disidratazione degli animali dopo immobilizzazione prolungata e consente osservazioni a lungo termine da effettuarsi.

Inoltre, come descritto in precedenza9, i fogli sono solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti come gli ioni di carbonio (con un intervallo di circa 1 mm di acqua) di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali. In questo modo le particelle di ioni per essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Inoltre, i fogli della vite senza fine possono essere riutilizzati e sono così economici. Con il metodo di iniezione convenzionali, gli animali racchiusi a volte sono morti e non possono essere prese fuori del canale; le uova possono anche ostruire i canali. Questo rende inutilizzabile il chip. Chip sono, pertanto, fondamentalmente USA e getta e il rapporto costi-benefici rapporto è scarsa.

Nella carta attuale, descriviamo dettagliatamente una serie di metodi per l'immobilizzazione su chip di streaming in c. elegans individui che utilizzano fogli di vite senza fine. Mediante saggi di locomozione degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip, abbiamo valutato il film di copertura adeguata. Inoltre, abbiamo mostrato gli esempi di immobilizzazione su chip per imaging osservazioni sia microbeam irradiazione.

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Protocollo

1. ceppi e manutenzione

  1. Selezionare un ceppo adatto di c. elegans ed Escherichia coli (cibo) a seconda dello scopo dell'esperimento.
    Nota: Nel presente documento, è generalmente utilizzato selvaggio-tipo N210c. elegans (Figura 2A) e HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 è impiegato esclusivamente per analisi di imaging. E. coli OP50 è stato utilizzato come alimento per c. elegans. Alcuni mutanti con forma anomala del corpo, ad esempio il mutante di unc-119(e2498) III con una forma a spirale (Figura 2B), possono essere racchiuso nei canali microfluidici dritto (Figura 2C).
  2. Mantenere la c. elegans a 20 ° C su cm 6 capsule di Petri contenente 10 mL di mezzo di sviluppo del nematode (NGM) sparsa con pernottamento-incubate (37 ° C) e. coli come descritto in precedenza10. Se possibile, sincronizza le fasi di sviluppo di c. elegans allo stadio embrionale.
  3. Utilizzare ben nutriti animali adulti, circa il 3-4 giorni dopo la schiusa con una larghezza di circa 50-60 µm, che sono perfettamente adattati alle dimensioni dei canali microfluidici nei fogli di vite senza fine.

2. selezione di soluzione tampone per immobilizzazione su chip

  1. Per i fogli di verme bagnabile, utilizzare qualsiasi soluzione tampone a seconda dello scopo degli esperimenti.
    Nota: Soluzioni tampone adatto per immobilizzazione su chip su PDMS microfluidic chip sono stati definiti in precedenza9 e le seguenti soluzioni tampone sono state indicate per non avere alcun effetto sulla motilità degli animali dopo immobilizzazione: buffer basale di S soluzione (5,85 g di NaCl, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 50 mL di fosfato di potassio a pH 6.0 di 1 M, H2O a 1 L; sterilizzati in autoclave)10 contenente una grande quantità di NaCl, soluzione tampone fosfato a M9 (5 g di NaCl , 3 g di KH2PO4, 6 g di Na2HPO4, 1 mL di 1 M MgSO4, H2O a 1 L; sterilizzati in autoclave)10, soluzione tampone di lavaggio (5 mL di fosfato di potassio a pH 6.0 di 1 M, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgSO4, 0,5 g di gelatina di pf, H2O a 1 L; sterilizzati in autoclave)12 contenente gelatina e acqua ultrapura9. Nel presente documento, soluzione tampone di lavaggio viene in genere utilizzato e soluzione tampone basale S solo è impiegato per la valutazione di immobilizzazione su chip utilizzando film copertina diversa nella sezione 3.
  2. Per il chip microfluidici convenzionali senza bagnabilità, utilizzare una soluzione di tampone di lavaggio, che fornisce il mezzo più efficace di mantenere l'umidità nei canali microfluidici del chip e quindi impedisce la secchezza di c. elegans individui ( indipendentemente dal fatto la bagnabilità dei chip microfluidici).

3. selezione di film di copertura adatto per immobilizzazione su chip

  1. Preparare il film copertina diversa come segue. Basato sulla facilità di movimentazione, tagliare il seguente trasparente, film di copertura biocompatibile adatto ad una dimensione (cioè, larghezza di 10-15 mm e lunghezza di 30-50 mm): 130-170 µm spessore copertura in vetro e poliestere (PET) 125 µm spessore film ~ 130 µm spessore polistirene (PS) pellicola.
  2. Eseguire immobilizzazione su chip 3h con diversa copertina film come segue. Basato su passaggi 4.1-4.6, racchiudere ≥ 10 lavato animali adulti (3,5 giorni dopo la schiusa) nel foglio worm utilizzando ogni film di copertura, rispettivamente e lasciare per 3 h.
  3. A fini comparativi, consentire 3h di libera circolazione come segue. ≥ 10 posto lavato animali adulti su una zolla di 3,5 cm contenente 3 mL fresco NGM, coprire con un coperchio e lasciare per 3 h.
  4. Raccogliere gli animali immediatamente dopo 3 ore di immobilizzazione su chip secondo passi 5.1-5.3. Rimuovere la pellicola di copertura dal foglio di vite senza fine e aggiungere una goccia di soluzione tampone per ogni animale. Pick up animali nuoto a goccia utilizzando un selettore di platina e trasferirli su un piatto di 3,5 cm contenente 3 mL fresco NGM senza cibo (piastra di dosaggio).
  5. Raccogliere gli animali dopo 3 ore di libera circolazione. Aggiungere una goccia di soluzione tampone per ogni animale. Pick up animali nuoto nella goccia sulla piastra NGM e trasferirli su un piatto di analisi utilizzando un selettore di platina.
  6. Valutare gli effetti del film di copertura sulla motilità (analisi della locomozione).
    1. Almeno 5 min dopo il trasferimento alla piastra di dosaggio, conteggio ' curve (definito come il numero di piegature nella regione anteriore del corpo a intervalli di 20-s) manualmente sotto un microscopio13del corpo.
    2. Svolgere analisi di locomozione cinque volte in modo indipendente per ogni film di copertura.
      Nota: Negli esperimenti mostrati nei risultati rappresentativi, 10 animali sono stati valutati per ogni esperimento in cui più animali venivano chiusi contemporaneamente, rispetto agli animali solo cinque contati nel precedente studio13.
    3. Calcolare il numero medio di curve del corpo per i 10 animali in ogni gruppo per ogni esperimento. Quindi media dei valori da cinque esperimenti indipendenti per valutare gli effetti di immobilizzazione su chip. Analizzare i dati statisticamente utilizzando un test di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) in un software di foglio di calcolo a livelli di significato di 0,01 e 0,05.
      Nota: Basato su questi esperimenti, un film di copertura di PS con permeabilità all'ossigeno alta è stato ritenuto idoneo (Vedi i risultati rappresentativi). Questi film di PS sono inclusi con i fogli della vite senza fine. Film PET, che ha permeabilità all'ossigeno basso, non è stato ritenuto adatto, perché gli animali tendevano a soffocare se coperto con esso durante immobilizzazione a lungo termine sui fogli della vite senza fine. È anche importante che il film di copertura non si rompono durante una serie di procedure; vetro copre anche erano pertanto non idonei (Vedi i risultati rappresentativi).

4. on-chip di immobilizzazione

Nota: Indossare guanti monouso, sterile per evitare di contaminare i fogli della vite senza fine.

  1. Collocare un foglio trasparente sottile come un film di copertura di PS o vetro che non ha nessun autofluorescence, per uso come una pellicola di copertura inferiore, sulla scrivania sperimentale o la fase microscopica. Mettere un foglio di vite senza fine delicatamente sul film di copertura inferiore usando la pinzetta piatta.
    Nota: Oltre i fogli di vite senza fine con 60 canali microfluidici µm-wide (adatti per gli adulti 3-4 giorni dopo la schiusa), fogli con 50 µm-wide canali (adatti per giovani adulti 3 giorni dopo la schiusa e mutanti con piccolo corpo in fase adulta) possono anche essere impiegati. Selezionare un foglio adatto basato sulla dimensione degli animali per essere utilizzato.
  2. Per raccogliere gli animali, raccogliere un singolo adulto c. elegans dalla piastra di coltura sotto un microscopio stereoscopico utilizzando un selettore di platina. Ripetere il processo se sono necessari più animali.
  3. Lavare gli animali per rimuovere cibo (batteri).
    1. Posizionare almeno tre gocce (5 µ l gocce) di soluzione tampone sulla superficie di un piatto di Petri di non trattata 6 cm (idrorepellente).
    2. Trasferire gli animali a una gocciolina di utilizzo di un selettore di platina e consentire loro di rimuovere qualsiasi cibo a nuoto. Li lavi due volte in due goccioline separate e quindi risciacquare gli animali in un'altra goccia.
      Nota: È necessario praticare questa procedura per essere in grado di eseguire rapidamente prima di effettuare qualsiasi esperimenti.
  4. Goccia 2-3 µ l di soluzione tampone sulla superficie di un foglio di vite senza fine. Raccogliere gli animali lavati dalla goccia su di Petri e trasferirli alla goccia sul foglio di vite senza fine.
  5. Racchiudere gli animali canali microfluidici come segue. Posizionare un film di copertura di PS sopra il foglio di verme con una pinzetta piatta e premere delicatamente sopra i canali da un'estremità del foglio a altro per mantenere l'umidità (come descritto in precedenza4,9).
    Nota: Gli animali sono racchiusi in modo casuale nei canali. Goccioline contenenti animali sono distribuite attraverso il foglio di vite senza fine coprendo il foglio, conseguente goccioline ampiamente estese su diversi canali. Ogni animale può essere racchiusa in uno di questi canali. Il punto importante per quanto riguarda l'uso del foglio di vite senza fine per immobilizzazione su chip è che più canali sono disponibili in una vasta area.
  6. Immediatamente dopo che racchiude gli animali nei canali microfluidici, confermare che sono vivi controllando per il movimento della testa sotto un microscopio (ad es., 1 x o 2 ingrandimenti).
  7. Registrare la posizione dell'animale, allo stesso tempo come eseguito il punto 4.6 e notare quanto segue su un foglio dedicato (complementare File 1): numero del canale in cui è racchiuso l'animale; posizione di ogni animale nel canale (sinistra/centro/destra); e la direzione della testa.
  8. Disegnare una freccia per contrassegnare la posizione di ogni animale nel canale, con la direzione della freccia corrispondente per la testa dell'animale.
    Nota: I numeri di canale (ad es., 1, 5, 10, 15, 20, 25) sono incisi sulla superficie del foglio verme vicino ai bordi sinistro e destro dei canali microfluidici (Figura 1B). Queste informazioni sul foglio dedicato permette animali di essere collocato in fretta, rendendo il processo più efficiente e aiuta anche a prevenire la fuoriuscita di radiazioni durante i passaggi successivi.

5. raccolta di animali provenienti da un foglio di vite senza fine

  1. Immediatamente dopo immobilizzazione, rimuovere la pellicola di copertura dal foglio verme con una pinzetta piatta.
  2. Goccia di 10-15 µ l di soluzione tampone sui canali microfluidici che racchiude gli animali e osservare gli animali iniziando a nuotare nelle gocce sotto un microscopio stereoscopico.
    Nota: Gli animali iniziano nuoto nella gocciolina di nuova il proprio senza alcun ulteriore pressione, aiuto o push. Basta cadere alcuni buffer in cima loro è sufficiente per farli nuotare fuori del canale. Un animale può essere incapace di nuotare in una goccia se è stato danneggiato vitale da irradiazione nel passaggio 7,9 o dal processo di immobilizzazione in passaggi 4.2-4.5, anche se questo è raro. Inoltre, se l'animale rimane attaccata alla pellicola di copertura quando viene rimosso, è possibile aggiungere le goccioline sulla pellicola di copertura anziché nei canali.
  3. Raccogliere gli animali nuoto a goccia utilizzando un selettore di platina e adagiateli su un piatto di dosaggio.

6. applicazione di fogli di vite senza fine per l'imaging di osservazioni

Nota: Fogli di vite senza fine possono essere ampiamente usati in osservazioni al microscopio. Il chip può trattenere l'acqua e non influisce la motilità di c. elegans individui dopo 3 h di immobilizzazione su chip9. Inoltre, il chip stesso non ha nessun autofluorescence, che lo rende adatto per l'uso in analisi di imaging di fluorescenza. Un'applicazione di esempio per l'analisi di formazione immagine di fluorescenza è riportata qui sotto.

  1. Selezionare un microscopio a fluorescenza e montare una fotocamera digitale o videocamera digitale sul microscopio per catturare immagini o video, rispettivamente (Figura 3A).
    Nota: La distanza di lavoro (WD) del microscopio è superiore a 0,2 mm a seconda delle specifiche dell'obiettivo (Vedi Figura 3B, C). Le specifiche dell'apparato del microscopio di fluorescenza utilizzato in questa carta sono riportate nella Tabella materiali. Tuttavia, la specifica non è limitata al nostro esempio, perché si basa sullo scopo di osservazione o / e gli utenti.
  2. Selezionare qualsiasi ceppo fluorescente di c. elegans e mantenere come descritto nella sezione 1.
    Nota: Se è necessario osservare la contrazione muscolare del corpo-parete (Vedi risultati rappresentativi), utilizzo di giovane adulto HBR411c. elegans, in cui un gene reporter viene utilizzato per esprimere l'indicatore di calcio GCaMP3.35 in tutte le cellule di muscolo del corpo-parete. È importante utilizzare giovani adulti (≤ 3 giorni dopo la schiusa) che sono più sottili rispetto alla larghezza dei canali microfluidici (50 o 60 µm) del foglio di vite senza fine. Il piccolo grado della clearance significa che gli animali possono piegare leggermente, rendendo possibile osservare la contrazione muscolare e l'estensione durante la scansione, utilizzando un indicatore di ioni calcio.
  3. Svolgere il recinto degli animali secondo la procedura di immobilizzazione nella sezione 4.
  4. Osservare macchie fluorescenti di animali (per esempio, verde fluorescente proteina-identificati ceppi) utilizzando un microscopio a fluorescenza e catturare immagini utilizzando una fotocamera digitale montata sul microscopio.
    Nota: Seguire i metodi precedentemente stabilito14,15,16, poiché i metodi di osservazione del microscopio (tra cui osservazione fluorescenza) e la specifica del sistema microscopio dipende lo scopo dell'osservazione.
  5. Propagazione delle onde in ioni di calcio immagine utilizzando acquisizione video per osservare le attività dinamiche, come la contrazione muscolare corpo-parete e l'estensione nel HBR4 worms (Video 1).

7. applicazione di fogli di vite senza fine per irradiazione microbeam

Nota: Il collimatore microbeam irradiazione system5 può utilizzare diverse particelle di ioni pesanti accelerate da azimutalmente vari ciclotrone campo installato presso gli acceleratori di ioni di Takasaki per facilità di applicazione avanzata di radiazione (TIARA) di QST-Takasaki (Figura 4A). C'è una fase automatica per irradiazione sotto l'uscita del fascio (Figura 4B). La procedura per ioni pesanti microbeam irradiazione di c. elegans usando questo sistema è come segue.

  1. Individuare il foglio di vite senza fine che racchiude più animali su un telaio in alluminio su misura per l'impianto di microbeam-irradiazione e impostarlo sulla scena automatica per irradiazione (Figura 4C).
  2. Raccogliere il campione di irradiazione (cioè, animali racchiusi in un foglio di vite senza fine su un telaio), a immediatamente sotto uscita (~ 2 mm) il fascio basato sull'immagine sul monitor da un microscopio situato sotto il palco automatico (Figura 4D).
  3. Dopo il posizionamento verticale, individuare ogni animale a destinazione con l'irradiazione di microbeam utilizzando il software su misura per irradiazione mirata di animali e colture cellulari. Per individuare ogni animale racchiuso tra il canale di microfluidica, consultare la scheda dedicata descritta nel passo 4.7-4.8 (Vedi supplementari File 1) e confermare il numero del canale vicino ai bordi sinistro e destro dei canali.
  4. Controllare la fase automatica in X e Y indicazioni per posizionare gli animali appena sotto la trave uscita utilizzando un sistema di controllo remoto e un mouse laser operati con il software di irradiazione.
  5. All'incirca sintonia della zona di irradiazione guardando la proiezione dal microscopio situato sotto il palco automatico del campione e spostando il cursore nella posizione di irradiazione dell'animale per essere mirati.
  6. Dopo il posizionamento del grezzo, uscire e chiudere la camera di irradiazione e spostare la camera di controllo adiacente per evitare d'irradiazione degli operatori.
  7. Impostare il numero desiderato di particelle di ioni per una procedura di irradiazione, corrispondente all'irradiazione di una regione specifica dell'animale, utilizzando la console di connessi a un sistema di ioni-contatore.
    Nota: Si tratta di uno scintillatore plastico e un moltiplicatore di fotoelettroni nel sistema a irraggiamento microbeam collimatore.
  8. Dalla sala di irradiazione-controllo, ottimizzare la posizione degli animali sulla base dell'immagine del monitor dal microscopio situato sotto il palco automatico, che è la stessa immagine proiettata sul monitor dentro la camera di irradiazione (Figura 4E).
  9. Destinazione l'irradiazione microbeam cliccando il pulsante di irradiazione del software per irradiazione.
    Nota: Nell'esempio mostrato nella Figura 4F, ci rivolgiamo alla faringe nella regione cefalica e irradiare con il numero appropriato di ioni carbonio microbeam. Poiché viene contato il numero di particelle di ioni passando attraverso il campione utilizzando un sistema di ioni-contatore collegato alla console e il software di irradiazione, l'irradiazione viene interrotta dopo la consegna del numero desiderato di particelle di ioni.
  10. Individuare ogni animale registrato sul foglio dedicato e svolgere irradiazione mirata per ogni animale. Ripetere i passaggi 7,8 e 7,9 per tutti gli animali sono stati irradiati.
  11. Immediatamente dopo l'irradiazione, entra nella camera di irradiazione e abbassare il tavolino di irradiazione automatico. Rimuovere l'esempio sul telaio su misura che si trova sulla scena automatica.
  12. Raccogliere gli animali come descritto ai punti 5.1-5.3.
  13. Effettuare analisi comportamentali e/o molecolari come richiesto per valutare gli effetti dell'irradiazione mirata, a seconda dello scopo dello studio.
    Nota: Il dosaggio di locomozione descritto al punto 3.6 è un metodo efficace per valutare gli effetti dell'irradiazione su motilità4,9.

8. trattamento dei fogli della vite senza fine per uso ripetuto

Nota: Fogli di vite senza fine possono essere usato ripetutamente almeno 10 volte9 senza effetti negativi sugli animali se puliti e sterilizzati correttamente dopo l'uso come segue.

  1. Pulizia
    1. Posizionare il foglio usato verme su un 6cm di Petri e rilasciare circa 100 µ l di acqua ultrapura sterilizzata sul foglio intero.
    2. Paddle l'acqua sulla superficie del foglio utilizzando guanti dita per lavare via la sporcizia come polvere, cibo batterico e tutte le uova di cui i canali.
    3. Asciugare l'umidità dei fogli della vite senza fine accuratamente con salviette monouso.
  2. Sterilizzazione
    1. Iniettare circa 5 mL di etanolo al 70% di Petri contenente il foglio di vite senza fine e pagaia la superficie del foglio usando le dita guantate per lavare via lo sporco.
  3. Essiccazione
    1. Rimuovere i trucioli di Petri riempito con etanolo al 70% e lasciare per asciugare naturalmente.
  4. Deposito
    1. Dopo l'essiccazione, posizionare il foglio di vite senza fine su una piastra Petri sterile e coprire. Fogli possono anche essere memorizzati su una piastra Petri sterile riempito con etanolo al 70%.
      Nota: È preferibile smaltire le pellicole di copertura dopo l'uso, ma se essi sono di essere riutilizzati, pulirli come fatto per il foglio di vite senza fine. Tuttavia, se pieghe sviluppano il film di copertura dopo l'uso non aderirà al chip, conseguente disidratazione degli animali, e pertanto deve essere sostituito.

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Risultati

Attivo di c. elegans individui potrebbero essere immobilizzati con successo usando un ultra-sottile, bagnabile PDMS, chip microfluidico (foglio di vite senza fine). Abbiamo studiato l'idoneità delle pellicole di copertina diversa per sigillare il foglio di vite senza fine, come descritto nel protocollo sezione 3. Per valutare gli effetti di tenuta dei film copertura, abbiamo determinato la motilità degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip con copertura in vetro (spessore: ...

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Discussione

Immobilizzazione su chip di c. elegans in condizioni dal vivo utilizzando un bagnabile PDMS microfluidic chip consente l'irradiazione efficiente microbeam mirata di più animali. La facilità di movimentazione e caratteristiche per evitare l'essiccazione rendono questo sistema adatto per applicazioni non solo in microbeam irradiazione, ma anche in diversi saggi comportamentali. Questi fogli di vite senza fine sono già stati commercializzati e possono essere facilmente ottenuti. Chip microfluidici convenzionali, qu...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Atsushi Higashitani per gentile Consiglio per quanto riguarda il trattamento di c. elegans e d. ssa Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi per discussioni importanti. Gli autori ringraziano il centro genetico di Caenorhabditis per la fornitura di ceppi di c. elegans ed Escherichia coli. Ringraziamo l'equipaggio del ciclotrone del diadema a QST-Takasaki per la loro assistenza gentile con gli esperimenti di irradiazione. Ringraziamo il Dr. Susan Furness per la modifica di un progetto di questo manoscritto. Questo studio è stato sostenuto in parte da KAKENHI (Grant numeri JP15K11921 e JP18K18839) da JSP a M.S.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
C. elegans ceppo wild-typeCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USAN2Wild-type C. elegans ceppo generalmente utilizzato in questo studio
C. elegans unc-119(e2498) III mutante ceppoCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USACB4845C. elegans ceppo impiegato solo come esempio di mutanti con forma corporea anormale...
C. elegans ceppo transgenico HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAHBR4Il genotipo di questo ceppo transgenico C. elegans è HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. Questo ceppo è stato impiegato solo per l'osservazione delle immagini.
E. coli ceppoCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USAOP50E. coli ceppo utilizzato come cibo per C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, GiapponeBCM17-0001Chip microfluidico con 25 diritti 50/60-µ m canali di larghezza utilizzati in tutti gli esperimenti e le osservazioni in questo articolo 
Foglio di vite senza fine 60Biocosm, Inc., Hyogo, GiapponeBCM18-0001Chip microfluidico con 20 60 diritti & micro; canali di larghezza m. Questo è adatto per gli adulti 3-5 giorni dopo la schiusa a 20 ° C.
Foglio di vite senza fine 50Biocosm, Inc., Hyogo, GiapponeBCM18-0002Chip microfluidico con 20 50 diritti & micro; canali di larghezza m. Questo è adatto per i giovani adulti ~ 3 giorni dopo la schiusa a 20 ° C.
MICRO VETRO DI COPERTURAMATSUNAMI GLASS IND. LTD.C030401Vetro di copertura (spessore: 130-170 &; micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3
Film di polistireneBiocosm, Inc., Hyogo, GiapponeBCM18-0001/ BCM18-0002Articoli in bundle di fogli di vite senza fine. PS filim (spessore: ~130 µ m) utilizzato nei saggi di locomozione del Protocollo 3.
Pellicola di poliestere LumirrorTORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, GiapponeLumirror T60 (t 125 µ m)Filo PET (spessore: 125 &; micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3
IWAKI 60 mm/piatto non trattatoAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Giappone).1010-060Piatto non trattato utilizzato nell'incuvazione di C. elegans nel Protocollo 1
IWAKI 35 mm/piatto non trattatoAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Giappone).1010-035Piatto non trattato utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3
Milli-QMerck, FranciaAcqua ultrapura
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Giappone62020120 mm x 215 mm; 200 fogli/scatola
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPRaccoglitore di platina specializzato per il prelievo di C. elegans
Sistema di stereomicroscopio di ricercaOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, GiapponeSZX16Micriscopio utilizzato in tutti gli esperimenti e le osservazioni in questo documento
Supporto di messa a fuoco motorizzato per SZX16OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, GiapponeSZX2-ILLBQuesto è stato utilizzato per l'osservazione in campo chiaro nel protocollo 3-8.
Obiettivo (&volte; 1)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, GiapponeSDFPLAPO1× PFNA: 0,15; L.D.: 60 mm. Questo prestito è stato utilizzato per l'osservazione in campo chiaro nel Protocollo 3-8.
Obiettivo (&volte; 2)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, GiapponeSDFPLAPO2XPFCNA: 0,3; L.D.: 20 mm. Questo  Lends è stato utilizzato per osservazioni di imaging.
Mercury Light SourceOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, GiapponeU-LH100HGL'ampio spettro di emissione consente di condurre una serie di esperimenti di imaging a fluorescenza utilizzando tutti i comuni fluorofori.
SZX16 Unità filtro fluorescente (alte prestazioni per YFP)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, GiapponeSZX2-FYFPHQEs: 490-500 nm; Em: 510-560. Questo è stato utilizzato per l'osservazione di immagini della deformazione HBR4.
Fotocamera digitale ad alta velocità EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, GiapponeEX-F1 Le Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C e Video 1 sono state ottenute utilizzando questa fotocamera digitale.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USAEXCEL Software utilizzato per analisi statistiche

Riferimenti

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).

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