L'ormone secernuta dalla corteccia surrenale è vitale per animali contro lo stress e malattie. Qui, presentiamo un protocollo alla cultura il ratto primario cellule adrenali. Potrebbe essere una buona piattaforma in vitro per indagare i meccanismi del reagente di interesse nella steroidogenesi surrenalica e biosintesi lipidica.
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Articolo metodologico
Colture primarie di cellule corticosurrenali ratto e saggi di Steroidogenic funzioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ormone che secerne la corteccia surrenale è vitale per animali contro lo stress e malattie. Il metodo qui descritto è la procedura di cellule adrenali primario coltivati del ratto e saggi funzionali correlati (colorazione di immunofluorescenza di proteina di superficie della gocciolina del lipido, nonché analisi di corticosterone). A differenza di un modello in vivo, la variazione di interexperiments in colture monostrato adrenale è minore e la condizione sperimentale è facile da controllare. Inoltre, l'origine dei ratti è anche più stabile di altri animali, come quelli di bovino. Ci sono anche diverse linee di cellule umane adrenale (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, ecc.) che possono essere utilizzati negli studi adrenali. Tuttavia, la produzione di steroidi di queste linee sarà ancora influenzata da numerosi fattori, che includono il numero di lotto del siero, il numero di passaggio, mutante/perdita di geni distinti, ecc. Fatta eccezione per la mancanza di 17 α-idrossilasi, colture primarie di cellule corticosurrenali ratto sono una tecnica migliore e più conveniente per lo studio della fisiologia adrenale. In sintesi, culture adrenale del ratto primario potrebbero essere una buona piattaforma in vitro per i ricercatori a studiare i meccanismi del reagente di interesse nel sistema della ghiandola surrenale.
Introduzione
Il sistema endocrino è responsabile della regolazione di attività fisiologiche e omeostasi1. Le ghiandole surrenali che si trova al Polo craniale dei reni sono uno dei principali organi endocrini che secernono mineralcorticoidi, glucocorticoidi e androgeni2,3. Ci sono due parti distinte della ghiandola surrenale: la corteccia ed il midollo. La corteccia surrenale è costituito da tre strati: l'esterno glomerulosa, la fascicolata intermedia e i reticularis interna3. La zona glomerulare è il sito originale di secrezione dell'aldosterone, un mineralcorticoide, che aiuta a riassorbire ioni di sodio e acqua nei reni3. La zona fascicolata principalmente produce un livello basale di glucocorticoidi in condizioni fisiologiche normali3. I corticosteroidi in roditori e cortisolo negli esseri umani agiscono per aiutare il corpo a fare fronte allo sforzo regolando sangue glucosio3. In una certa misura, possono inibire le risposte infiammatorie e regolano il sistema immunitario4,5. A differenza di altri mammiferi, topi e ratti non hanno un reticularis di zona funzionale a causa della mancanza di un'espressione di 17 α-idrossilasi in ghiandola adrenale6,7. Così, le ghiandole surrenali da topi e ratti sono privi di secrezione di steroidi surrenali C-19 (cortisolo e androgeni adrenali).
Cellule corticosurrenali coltivate primarie hanno dimostrate di essere utile per investigare i meccanismi che controllano la fisiologia adrenale8. Come altri tessuti steroidogenic, ogni zona adrenale sintetizza la sua steroidi da colesterolo libero9. Stimolazione con l'ormone adrenocorticotropo (ACTH), il colesterolo libero viene rilasciato da goccioline del lipido di ripartizione e, quindi, migliora la produzione di steroidi nella fascicolata e reticularis10.
Molti gruppi hanno tentato di stabilire linee cellulari stabilizzate da carcinomi adrenocorticali. Tuttavia, parecchie preoccupazioni hanno limitato l'uso di linee di cellule corticosurrenali come in vitro modelli8. Le risposte steroide di linee cellulari possono differire fra i passaggi, il numero di lotto del siero e la qualità del siero, ecc. Inoltre, linee cellulari adrenale commerciale (Y1 e SW13) non secernono corticosterone, rendendo più difficile studiare la steroidogenesi surrenalica8. Utilizzando le ghiandole surrenali bovine ed equine come ex vivo modelli potrebbero essere una buona scelta, anche se i tessuti di questi mercati possono oscurare alcuni rischi sconosciuti. Rispetto ad essi, gestione delle ghiandole surrenali del ratto è più facile e la fonte è relativamente più stabile e privo di agenti patogeni. Presi insieme, il presente metodo qui descritto potrebbe essere utilizzato per studiare il meccanismo correlato della sintesi di corticosterone in cellule del ratto fasciculata adrenale.
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Protocollo
Tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate da istituzionale Animal Care e uso Comitato di Kaohsiung Medical University.
1. procedura sperimentale
- Sacrificare i ratti di SD femmina/maschio adulto (da 8 a 12 settimana-vecchi) di CO2 eutanasia.
- Applicare etanolo al 70% e lasciarlo essere assorbito dalla pelle e quindi pulire la pelle con una velina.
- Mettere il ratto su una piastra di plastica pulito in posizione supina.
- Sollevare la pelle con il forcipe curvo "esterno" al midline ed eseguire una dissezione smussa creando una forma di "Y" (dal livello della coscia dell'angolo sottocostale).
- Sciacquare le forbici con etanolo al 70% e, quindi, tagliare il muscolo, creando anche una forma di "Y".
-
Trovare la ghiandola surrenale sinistra dietro lo stomaco.
Nota: adrenale di destra può essere trovato profondamente dietro il fegato.- Utilizzare un paio di pinze per sollevare lo stomaco o fegato e isolare le ghiandole surrenali con un altro forcipe curvo.
- Dopo aver messo le ghiandole surrenali in un piatto sterile, rimuovere con cautela la capsula surrenale con una pinzetta.
- Con un delicato paio di forbici, tagliare le ghiandole surrenali in piccoli pezzi con un po' di Dulbecco privo di siero s modified esente Eagle (DMEM) / F-12 medio.
-
Preparare tre diverse dimensioni dei pori Pasteur pipetta e utilizzare la pipetta di Pasteur prima per aspirare tutti i pezzi adrenali in una provetta conica 50 mL contenente mezzo con collagenasi II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Delicatamente e triturare i pezzi di tessuto a 10x. Utilizzare il resto della pipetta e ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i pezzi diventano più piccoli.
Nota: Le dimensioni differenti dei pori di pipetta Pasteur possono essere create da loro riscaldamento con fuoco. La prima pipetta è la dimensione originale (circa 1 mm), il formato del poro del secondo è di circa 0,8 mm e la pipetta di Pasteur terza è di circa 0,5 mm. Durante la digestione, i pezzi delle surrenali diventerà più piccoli. Così, tramite la procedura meccanica, le ghiandole surrenali possono essere digerite più completato. Incubare la provetta a bagnomaria (a 37 ° C) e agitare ogni 5 min, 4 volte in totale.
- Delicatamente e triturare i pezzi di tessuto a 10x. Utilizzare il resto della pipetta e ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i pezzi diventano più piccoli.
- Dopo l'incubazione di 20 min, aggiungere mezzo fresco e freddo (sestuplo volume; ad esempio, 5 mL di tessuto + 25ml di cool DMEM/F-12 medium) contenente 2,5% siero bovino fetale (FBS) e 5% di siero equino per fermare l'effetto degli enzimi.
- Raccogliere le palline delle cellule mediante centrifugazione a 800 x g per 10 min.
- Aggiungere un volume adeguato di medie di sospendere le cellule.
Nota: Ogni ghiandola può fare circa ~ 3 x 105 a ~ 4 x 105 celle. - Le cellule in piastre desiderate o piatti del piatto con il mezzo di crescita (miscela 1:1 [v/v] del mezzo F-12 di prosciutto e DMEM, completati con 25mm HEPES e 1% penicillina e streptomicina) durante la notte (giorno 0) a 37 ° C, in un ambiente umidificato di 95% aria e 5% CO2.
Nota: Di solito, abbiamo piastra cellule in piastre da 24 pozzetti (quattro ghiandole/piatto) per il dosaggio di corticosterone e in 35 mm piatti (una ghiandola/circa uno o due piatti) per western blot analisi. - Lavare accuratamente le cellule 2 x con caldo privo di siero DMEM/F-12 medio (giorno 1). Sostituire il nuovo mezzo di crescita.
- Mantenere le cellule a 37 ° C in un ambiente umidificato di 95% aria e 5% CO2 fino al giorno 3.
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Risultati
Utilizzando la procedura descritta qui, cellule adrenali coltivate primarie si distinguevano sotto un microscopio a contrasto di fase (Figura 1A). Per confermare ulteriormente che le vescicole all'interno del citoplasma sono le goccioline del lipido, la colorazione di immunofluorescenza della proteina di relazione con la differenziazione adiposa (ADRP) potevano essere condotte sulle colture di giorno-3 (Figura 1B). Le cellule son...
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Discussione
Ghiandole surrenali gioca un ruolo chiave nell'adattamento ambientale3. L'ormone che la corteccia surrenale secerne può regolare e regolare le funzioni fisiologiche e omeostasi3. Il modello in vivo riflette gli effetti reali fisiologici nel corpo. Tuttavia, ancora è influenzato da molti fattori complessi, causando effetti instabili negli esperimenti. Al contrario, il modello in vitro delle cellule ha vantaggi che lo rende incomparabile per il modello animale. In primo luogo...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Science Consiglio Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e un National Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ratti femmina/maschio, SD/Wistar (8-12 settimane) | BioLASCO | sono adatti per gli esperimenti. Le ghiandole surrenali delle femmine sono più grandi dei ratti maschi, tuttavia, le femmine di ratto possiedono i cicli estrali che possono influenzare gli esperimenti | |
| Collagenasi, tipo II | Sigma | C-6885 | isolamento delle cellule surrenali |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | terreni in polvere per cellule surrenali |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | terreni in polvere per cellule surrenali |
| HEPES | JT.baker | 4018 | tampone (polvere) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Siero di cavallo | Hyclone | 16050014 | |
| Siero fetale bovino | SAFC | 12103C | |
| Penicillina (10.000 U)-streptomicina (10.000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotici |
| Pinze curve | BRAUN | BD343R | |
| Forbice | BRAUN | BD331R | |
| Forbice | BRAUN | BC224R | taglio pelle e muscolo di ratto |
| Forbice delicata | BRAUN | BC101R | taglio ghiandole surrenali |
| Proteina correlata alla differenziazione adiposa | Abcam | ab108323 | anticorpo per la proteina associata alle goccioline lipidiche |
| Kit ELISA | cayman | 500655 | test per la sintesi di corticosterone |
| Microscopia a luce invertita | Leica | ||
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | per colorazione in immunofluorescenza |
| IgG anti-coniglio di capra Alexa 488 Anticorpo secondario al fluoro | ThermoFisher | A-11034 | per colorazione in immunofluorescenza |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | per colorazione in immunofluorescenza |
| ProLong Gold montante antisbiadimento | ThermoFisher | P36935 | per colorazione in immunofluorescenza |
Riferimenti
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