È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

7.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/59020

⸱

9 febbraio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering, Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D, Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering, Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University

In questo articolo

Sommario

Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.

Abstract

Sferoidi di tumore sono stati sviluppati come un modello di cultura tridimensionale (3D) delle cellule nella scoperta della droga del cancro ricerca e anti-cancro. Tuttavia, attualmente, modalità di formazione immagine ad alta velocità che utilizza il rilevamento di campo o fluorescenza brillante, si riesce a risolvere la struttura nel complesso 3D della sferoide di tumore a causa della limitata penetrazione della luce, diffusione di coloranti fluorescenti e profondità-possibilità di risoluzione. Recentemente, il nostro laboratorio ha dimostrato l'uso della tomografia a coerenza ottica (OCT), un'etichetta-free e non-distruttivo modalità, per eseguire la caratterizzazione longitudinale di sferoidi multicellulari del tumore in una piastra a 96 pozzetti di imaging 3D. OCT è stato in grado di ottenere informazioni morfologiche e fisiologiche 3D di sferoidi tumore cresce fino a circa 600 µm in altezza. In questo articolo, dimostriamo un sistema di imaging OCT (HT-OCT) ad alta velocità che analizza il piatto intero multi-pozzetto e ottiene automaticamente dati 3D OCT di sferoidi del tumore. Descriviamo i dettagli degli orientamenti HT-OCT sistema e costruzione nel protocollo. Dai dati OCT 3D, si può visualizzare la struttura complessiva della sferoide con 3D rendering e sezioni ortogonali, caratterizzano la curva di crescita longitudinale della sferoide di tumore sulla base delle informazioni morfologiche di dimensione e volume e monitorare la crescita delle le regioni di morti-cellula nella sferoide di tumore basato sul contrasto di attenuazione ottica intrinseca. Mostriamo che HT-OCT utilizzabile come una modalità di imaging ad alta produttività per la droga di screening come pure che caratterizzano i campioni biofabricated.

Introduzione

Il cancro è la seconda causa di morte nel mondo1. Lo sviluppo di farmaci targeting per cancro è di cruciale importanza per i pazienti. Tuttavia, si stima che oltre il 90% di nuovi farmaci anti-cancro non riuscire in fase di sviluppo a causa di una mancanza di efficacia e tossicità inattesa in studi clinici2. Parte della ragione può essere attribuita all'uso di modelli della coltura semplice cellulare bidimensionale (2D) per lo screening di composto, che forniscono risultati limitati valori predittivi di composto efficacia e tossicità per le seguenti fasi di drug discovery2 , 3 , 4. recentemente, tridimensionale (3D) tumore sferoide modelli sono stati sviluppati per fornire i dati fisiologici e farmacologici clinicamente rilevanti per farmaco anti-cancro discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Poiché questi sferoidi possono imitare il tessuto-specifica proprietà di tumori in vivo, quali nutrienti e l'ossigeno gradiente, hypoxic nucleo così come farmaco resistenza19, l'uso di questi modelli potenzialmente possibile abbreviare droga scoperta sequenze temporali, ridurre i costi di investimento e portare nuovi farmaci ai pazienti in modo più efficace. Un approccio critico alla valutazione dell'efficacia di composto in fase di sviluppo di tumore 3D sferoide è monitorare la crescita della sferoide e ricorrenza sotto trattamenti9,26. Per effettuare questa operazione, caratterizzazioni quantitative della morfologia del tumore, che coinvolge il suo diametro e volume, con modalità di imaging ad alta risoluzione, sono di importanza fondamentale.

Modalità di imaging convenzionale, come campo chiaro, contrasto fase7,9,22,24e fluorescenza microscopia8,9,16, 18,22 può fornire una misura del diametro di sferoide ma non riesce a risolvere la struttura complessiva della sferoide nello spazio 3D. Molti fattori contribuiscono a queste limitazioni, tra cui la penetrazione della luce sondaggio in sferoide; diffusione delle tinture fluorescenti in sferoide; che emettono segnali fluorescenti da tinture fluorescenti eccitati all'interno o sulla superficie opposta di sferoide a causa di forte assorbimento e scattering; e profondità-possibilità di risoluzione di queste modalità di formazione immagine. Questo spesso porta a una misura di volume imprecise. Sviluppo del nucleo necrotico in sferoidi imita necrosi in vivo i tumori6,10,15,19,25. Questa caratteristica patologica è improbabile riprodotto in 2D cell culture19,25,27,28. Con una dimensione di sferoide superiore a 500 µm di diametro, una struttura a tre strati concentrica, tra cui uno strato esterno delle cellule di proliferazione, uno strato intermedio di cellule quiescenti e un core necrotico, può essere osservato in sferoide6,10 ,15,19,25, per mancanza di ossigeno e sostanze nutritive. Formazione immagine di fluorescenza cellulare vivi e morti è l'approccio standard per etichettare il contorno del nucleo necrotico. Tuttavia, ancora una volta, penetrazioni di questi coloranti fluorescenti e la luce visibile e ostacolare il potenziale per sondare il nucleo necrotico per monitorare il suo sviluppo nella sua forma attuale.

Un'alternativa 3D modalità di imaging, tomografia a coerenza ottica (OCT) è stato introdotto per caratterizzare le sferoidi di tumore. L'OCT è una tecnica di imaging biomedicina che è in grado di acquisire dati 3D privo di etichetta, non distruttive da fino a 1-2 mm profondità nei tessuti biologici29,30,31,32,33 ,34. L'OCT impiega interferometria di basso-coerenza per rilevare i segnali sparsi indietro da diverse profondità del campione e fornisce immagini ricostruite risolta in profondità a livello di micron risoluzioni spaziali in direzione laterale e verticale. OCT è stato ampiamente adottato in Oftalmologia35,36,37 e angiografia38,39. Gli studi precedenti hanno usato OCT di osservare la morfologia in vitro di sferoidi di tumore nella matrice della membrana basale (ad es., Matrigel) e valutare le loro risposte alla terapia fotodinamica40,41. Recentemente, il nostro gruppo istituito una piattaforma di imaging OCT ad alta produttività per monitorare e quantificare la cinetica di crescita di sferoidi 3D del tumore in piastre multi-pozzetto42sistematicamente. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore 3D utilizzando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto necrotico privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica sono stati dimostrati. Questo articolo descrive i dettagli di come la piattaforma di imaging OCT è stata costruita e impiegata per ottenere immagini ad alta risoluzione 3D di sferoidi del tumore. Le dettagliate analisi quantitativa della cinetica di crescita di sferoidi 3D del tumore, tra cui misure accurate di diametro sferoide e volumi, è descritto. Inoltre, il metodo di rilevazione non distruttiva delle regioni di tessuto necrotico mediante OCT, basata sul contrasto intrinseco attenuazione ottica è presentato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. preparazione delle celle

  1. Ottenere linee cellulari da un fornitore qualificato.
    Nota: Verificare che le cellule da linee cellulari di interesse possono formare sferoide in terreni di coltura o con l'aiuto di un substrato (matrice della membrana basale come Matrigel). Esaminare la letteratura9 o esegue un round di un pre-esperimento per un controllo.
  2. Scongelare le cellule congelate seguendo la procedura specifica fornita dal fornitore linea cellulare. Una procedura generale può essere trovata altrove43.
  3. Coltura delle cellule per 1-2 passaggi in matracci di cultura di 25 cm2 . Le cellule sono quindi pronte all'uso per la coltura cellulare 3D.
  4. Monitorare lo stato di salute delle cellule ogni giorno e mantenerli in un'incubatrice in condizioni standard (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità). Aggiornare i media come necessario.
    Nota: Il terreno di coltura costituito da DMEM (glucosio di 4,5 g/L), 10% di siero fetale bovino, 1% antibiotico antimicotico. Cellule di sottocultura prima che raggiungano la confluenza nella beuta di cultura. Seguire la Guida di riferimento di cultura cellulare fornito dal fornitore. Una procedura generale può essere trovata elsehwhere44.
  5. Eseguire coltura cellulare 3D in piastre multi-pozzetto basati sul seguente protocollo generale9.
    1. Rimuovere il supporto di cultura nel matraccio di cultura e lavare con soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS, riscaldata a 37 ° C).
    2. Risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,5%) nel pallone per 3 min. Aggiungere quindi, terreni di coltura per diluire la tripsina.
    3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare per 5 min a 500 x g e a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 4 mL di terreno di coltura pre-riscaldato. Dispensare una goccia di campione su un emocitometro per conta cellulare per calcolare la concentrazione cellulare. Diluire le celle a concentrazione appropriata per il seeding (ad es., 3.000 cellule/mL).
      Nota: Ottimizzare la concentrazione iniziale delle cellule di sferoide per ogni linea cellulare e ogni tipo di piastra multi-pozzetto (96 pozzetti, 384 pozzetti o 1536 pozzetti).
    5. Celle di seme in una piastra di multi-pozzetto di fondo tondo attacco ultra-basso (ULA). Aggiungere 200 µ l della sospensione di cellule in ogni pozzetto alla concentrazione di 3.000 cellule/mL, in modo che ognuno ha ben circa 600 celle.
    6. A RT, centrifugare tutta la piastra utilizzando un adattatore piastra per 7 min, giusto dopo la semina, a una velocità di 350 x g o la velocità più bassa disponibile.
      Nota: La centrifuga aiuta a raccogliere le cellule al centro del pozzo per facilitare formando uno sferoide singolo, uniforme. La fase di centrifuga viene eseguita una sola volta all'inizio per formare sferoidi del tumore. Non sarà ripetuta quando sferoidi tumorali iniziano a crescere.
    7. Mantenere la piastra multi-pozzetto a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore di cultura e aggiornare i terreni di coltura ogni 3 giorni.
      Nota: Tempo di crescita può variare per differenti 3D condizioni di coltura. Nel nostro studio, 3.000 cellule/mL è usato per sia U-87 MG e HCT 116 linee cellulari in piastre da 96 pozzetti, affinché la sferoide può crescere a ~ 500 μm in 4\u20127 giorni per cellule HCT 116. Considerare l'aggiunta di integratori di media e fattori di crescita per i modelli differenti della sferoide, basato sul generale protocollo 3D cultura.
    8. Eseguire imaging OCT di sferoidi tumore ogni giorni 3\u20124 per uno studio longitudinale della loro crescita.
      Nota: Punti di tempo raccomandato per l'imaging OCT sarebbe giorno 4, giorno 7, giorno 11, giorno 14, giorno 18 e giorno 21.

2. high-throughput OCT piattaforma di Imaging

Nota: Vedi riferimento lavoro29,30,31,32,33,34 per una revisione approfondita dei principi e applicazioni di OCT. Vedere Figura 1 e Huang et al. 42 per i dettagli di personalizzazione di Office personalizzato sistema utilizzato in questo studio di imaging.

  1. Scegliere una sorgente di luce a banda larga appropriata per il sistema di OCT per imaging tumorale sferoide.
    Nota: Qui, un diodo superluminescent (SLD, Figura 1A,B) con una lunghezza d'onda centrale di ~ 1.320 nm e ~ 110 nm di larghezza di banda è stata utilizzata come una sorgente di luce a banda larga.
  2. Costruire il braccio di riferimento e campione del sistema OCT seguendo lo schema elettrico (Vedi Figura 1A,B per i dettagli). Vedi la Tabella materiali per un elenco di componenti ottici per costruire il sistema di OCT. Assicurarsi che la lunghezza del percorso ottico del braccio di riferimento e del braccio del campione sono strettamente abbinati.
  3. Costruire lo spettrometro, tra cui un collimatore, una grata, una lente di F-teta e una fotocamera di scansione lineare (Vedi Figura 1 per installazione34) per dettagli di design di spettrometro di ott. in alternativa, selezionare uno spettrometro commerciale che corrisponde alla lunghezza d'onda concentrare della sorgente luminosa. Assicurarsi che lo spettrometro è allineato correttamente per coprire la larghezza di banda intera laser, collezione di fotoni ad alta efficienza e fornire lento sbiaditura di interferenza.
  4. Caratterizzare le prestazioni del sistema OCT, tra cui le seguenti metriche come forza nelle braccia del campione, totale profondità-dipendente sensibilità, profondità, profondità di messa a fuoco e laterale ad alta risoluzione, risoluzione assiale di imaging. Posizionare un riflettore debole (ad esempio, uno specchio con un filtro a densità neutra) come un campione per misurare la profondità-dipendente sensibilità, risoluzione assiale e profondità di fuoco. Inserire una destinazione di grafico del test di risoluzione USAF come il campione per controllare la risoluzione laterale.
    Nota: Vedi riferimenti34,45 per le definizioni delle metriche di performance OCT e protocolli per caratterizzare queste metriche45. Vedere la tabella 1 per un elenco dei parametri misurati per il sistema OCT personalizzato utilizzato nel nostro studio.
  5. Selezionare un traslatore motorizzato per fornire il movimento orizzontale della piastra multi-pozzetto per immagine tumore sferoidi in diversi pozzi (Vedi Figura 1B). Utilizzare un palco con una gamma di corsa maggiore di 108 mm x 72 mm per garantire una completa scansione di tutti i pozzetti della piastra multi-pozzetto. Utilizzare un traslatore motorizzato a 2D o 3D con software di controllo per abilitare la precisa posizione di ciascun pozzetto e automazione del sistema OCT per l'imaging ad alta velocità.
  6. Utilizzare un adattatore piastra o progettare un portatarga (dalla stampa 3D) per tenere la piastra multi-pozzetto in posizione fissa.
  7. Correggere l'inclinazione e la rotazione del piatto multi-pozzetto usando un 2D inclinando il palcoscenico e una fase di rotazione montati sul palco traslazionale (Vedi Figura 1 D), prima di condurre qualsiasi OCT imaging per minimizzare la variazione del piano centrale da diversi pozzi. Utilizzare D2, D6, D11, B6, G6 come i pozzi di guida durante il monitoraggio di loro posizioni relative nelle immagini OCT (Figura 1A).
  8. Regolare la rotazione del piatto per assicurare che i bordi della piastra sono paralleli con la direzione del movimento scenico, in modo che i pozzi rimangano alle stesse posizioni orizzontale nelle immagini OCT (Figura 1E). Regolare l'inclinazione della piastra devono essere paralleli alla tabella ottica affinché i pozzi rimangono nelle stesse posizioni verticali per OCT imaging (Figura 1F).
    Nota: Regolazione dell'angolo di inclinazione e la messa a fuoco aiutano ad ottimizzare la qualità dell'immagine OCT per tutti i pozzi. Tuttavia, variazioni dell'altezza della coltura in diversi pozzetti possono causare cambiamenti nei percorsi ottici che possono portare ad effetti sfocati dell'immagine sferoide. Messa a fuoco automatica può essere attuato per controllare il piano focale di OCT imaging per ottenere una qualità di immagine ottimizzata. Il passo di regolazione non risolve la scarsa qualità di immagine OCT della sferoide di tumore a causa dei seguenti problemi: il decentramento della sferoide grazie alla posizione iniziale di semina; elevazione della sferoide quando incorporato in biofabricated matrici extracellulari; qualità scadente piastra con grandi variazioni dell'altezza dei fondali ben. Software aggiuntivo di controllo con funzioni di messa a fuoco automatica o di auto-allineamento può essere implementato per ottimizzare le prestazioni dello strumento di personalizzazione sistema di imaging.
  9. Utilizzare un programma di computer personalizzati per controllare l'acquisizione di immagini OCT e il movimento di fase per raccogliere dati da ogni bene in sequenza.

3. OCT, scansione e l'elaborazione di tumore sferoidi

  1. Il giorno dell'imaging OCT di sferoidi di tumore, prendere la piastra multi-pozzetto dall'incubatrice. Trasferire la piastra multi-pozzetto sotto il OCT sistema di imaging. Posizionarlo sopra l'adattatore piastra.
    Nota: Formazione immagine OCT di sferoidi di tumore devono essere eseguita con il coperchio in polistirolo piastra on o off. Tuttavia, le condensazioni di acqua sul coperchio a causa dell'evaporazione dai pozzetti possono influenzare la trasmissione della luce e distorcere il percorso della luce, producendo immagini OCT meno ottimale da sferoidi.
  2. Regolare l'altezza della piastra spostando lungo la direzione z della fase di traduzione. Mantenere la posizione del piano focale a ~ 100 – 200 μm sotto la superficie superiore di ogni sferoide, per ridurre al minimo l'effetto di non-uniforme depth-wise profilo focale.
  3. Impostare un corretto intervallo scansione OCT (ad es., 1 x 1 mm) nel software personalizzato per coprire la sferoide di intero tumore secondo le sue fasi di sviluppo. Fare clic su Salva parametri per salvare l'impostazione.
  4. Utilizzare il software personalizzato per acquisire immagini OCT 3D di sferoidi tumore uno per tutti i pozzetti della piastra che contengono sferoidi. Fare clic sul pulsante Anteprima per visualizzare l'immagine di anteprima e fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire l'immagine OCT.
    Nota: Assicurarsi che i dati di sferoide OCT sono raccolti quando il palco non è in movimento. La sferoide è solitamente situata al centro della U-fondo. Tuttavia, la sferoide potrebbe essere spostata nel mezzo di coltura, quando il palco è accelerazione o decelerazione a causa dell'inerzia della sferoide in terreni di coltura.
  5. Processo 3D OCT DataSet di sferoidi di tumore per generare immagini strutturali di ottobre con un codice di elaborazione personalizzata di C++. Per un diagramma di flusso di post-processing dei dati OCT, vedere Figura 2A .
    Nota: Vedi Figura 4A per le immagini generate 3D OCT strutturali.
    1. Vedere il capitolo 5 di Drexler e Fujimoto34 e Jian et al. 46 per una descrizione di dettaglio delle operazioni post-elaborazione dei dati di OCT. Calibrare le dimensioni dei pixel in tutte e tre le dimensioni. Ri-scalare le immagini strutturali di ottobre sulle scale corrette.
      Nota: La distanza in direzione assiale (direzione z) di immagini di ottobre è una misura la differenza di cammino ottico tra il braccio di riferimento e campione. Così, l'indice di rifrazione del campione (n) deve essere presi in considerazione quando la dimensione in pixel in direzione assiale per il ridimensionamento di calibratura. Nel nostro studio, usiamo n = 1.37 come l'indice di rifrazione del tumore sferoide42.
  6. Generare il collage di immagini di sferoide utilizzando immagini OCT 2D in tre piani XY, XZ e YZ a sezione trasversale attraverso il baricentro della sferoide. Vedere Figura 3–E per l'output rappresentanza di collage di immagini di sferoide. Eseguire la registrazione di immagine per tutti gli sferoidi, utilizzando la funzione MATLAB dftregistration47, per garantire che i centroidi di tutti la sferoide si trovano approssimativamente nella stessa posizione.
  7. Ottenere rendering 3D di sferoide utilizzando un software commerciale o personalizzato.
    Nota: I passaggi seguenti mostrano come ottenere il rendering 3D di sferoidi tumore utilizzando un software commerciale.
    1. Caricare i dati di OCT 3D nel software.
    2. Fate clic sul pannello Surpass . Quindi, fare clic su Aggiungi nuovo Volume. Scegliere il metodo di fusione da utilizzare per il rendering 3D.
    3. Regolare l'angolo di visualizzazione trascinando l'immagine utilizzando il puntatore del mouse.

4. quantificazione morfologica del tumore 3D sferoidi

Nota: Un codice personalizzato scritto in MATLAB elabora questa quantificazione. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare il processo. Vedi Figura 2B per il diagramma di flusso dei passaggi di quantificazione morfologica di sferoidi.

  1. Quantificare sferoide diametro, altezza e diametro-based del volume.
    1. Selezionare immagini OCT 2D in tre piani XY, XZ e YZ cross-sectional che attraversano il baricentro della sferoide.
    2. Misurare il diametro e l'altezza di sferoide nei piani XY e XZ, rispettivamente.
    3. Calcolare sferoide basata su diametro volume tramite: figure-protocol-1 , con una presunzione di forma sferica del tumore.
  2. Quantificare il volume di voxel-based sferoide.
    1. Applicare un filtro di media 3D sui dati strutturali OCT di sferoide per rimuovere le macchioline.
    2. Segmento sferoidi tumore utilizzando il filtro di Canny edge rilevamento48 , fotogramma per fotogramma, con un'adeguata soglia che separa la regione di sferoide di tumore dal fondo ben.
    3. Gruppo connettivo voxel per dati 3D (vedere funzione incorporata: bwconncomp).
    4. Calcolare la distanza media tra ogni voxel connettivo nel gruppo e il centroide di sferoide (scelti manualmente), per ogni gruppo. Identificare l'area di sferoide come il gruppo con la minima distanza media.
    5. Contare il numero di voxel all'interno della regione di sferoide e quindi moltiplicare per il volume effettivo di un singolo voxel (volume/voxel), producendo il volume totale della sferoide.

5. dead-cella regione rilevazione del tumore 3D sferoidi

Nota: In un mezzo omogeneo, intensità retro-sparsi di OCT rilevato in funzione della profondità (io(z)) può essere descritta dalla legge di Lambert-Beer49: figure-protocol-2 , dove z rappresenta la profondità, μ è l'attenuazione ottica coefficiente, e ho0 è l'intensità incidente al campione. Quindi il coefficiente di attenuazione ottica derivata può essere espresso come: figure-protocol-3 . Dal momento che immagini di ottobre vengono spesso tracciati su una scala logaritmica, la pendenza del profilo intensità OCT può essere recuperata per ricavare il coefficiente di attenuazione ottica. Vedere Figura 2 per un diagramma di flusso della generazione delle mappe attenuazione ottica.

  1. Eseguire la segmentazione per rimuovere aree indesiderate di fuori della sferoide. Eseguire 3D filtro medio per sopprimere il rumore di macchiolina che è insito nelle immagini OCT.
  2. Pixel-wise ottenere i coefficienti di attenuazione ottica di lineare montaggio del profilo di intensità scala logaritmica OCT sopra una certa gamma di profondità (finestra mobile), estrarre il relativo pendio e moltiplicare la pendenza -1/2.
    Nota: Il coefficiente di attenuazione a ciascun voxel all'interno della regione segmentata sferoide è calcolato basato sul versante del profilo di intensità OCT in una finestra di profondità 10-voxel (~ 40 μm in profondità), con i voxel situato al centro della finestra.
  3. Applicare i metodi di cui sopra (punti 5.1 e 5.2) a ogni scansione assiale in una cornice e ogni fotogramma in un dataset 3D contenente la regione segmentata sferoide, fino a quando vengono calcolati i coefficienti di attenuazione ottica per tutti i voxel della regione segmentata sferoide.
  4. Eseguire il binaria soglia per evidenziare la regione alta-attenuazione.
    Nota: Vedere Huang et al. 42 per la determinazione della soglia della regione alta-attenuazione utilizzando analisi Istogramma.
  5. Evidenziare la mappa di attenuazione ottica binarizzato sull'immagine originale per etichettare la regione di morti-cella (blending). Generare l'immagine 3D-rendering della mappa blended attenuazione per visualizzare la distribuzione 3D della regione morti-cella.

6. istologia ed immunoistochimica

Nota: L'istologia e immunohistochemistry (IHC) macchiato immagini di sferoidi di tumore sono ottenuti per correlare con i risultati corrispondenti di OCT.

  1. Intervalli di tempo selezionati, selezionare sferoidi di tumore di 1-2 dalla piastra multi-pozzetto per istologia e colorazione IHC. Utilizzare una pipetta con le punte di Pipetta 1ml per trasferire la sferoide dal pozzo a una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
    Nota: Tagliare la punta della pipetta 1ml prima del trasferimento per garantire che l'apertura della punta è maggiore della dimensione della sferoide di tumore per evitare di danneggiare la struttura della sferoide.
  2. Raccogliere ogni sferoide di tumore in un tubo del microcentrifuge singolo 1,5 mL riempita con formaldeide al 10% e correzione per 48 h.
  3. Eseguire i processi IHC e istologia per ogni sferoide, utilizzando tecniche di inclusione a paraffina standard.
    Nota: Macchia 5 μm sezioni spesse di sferoidi di tumore per ematossilina ed eosina (H & E) e terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling rilevazione di apoptosis (TUNEL). Una colorazione di contrasto dell'ematossilina è applicato a TUNEL. Un scanner per diapositive digitale era usato per analizzare il campione macchiato e ottenere alta risoluzione istologica e immagini IHC.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Formazione immagine di tomografia ottica di coerenza di elevato Throughput di sferoidi in una piastra a 96 pozzetti

Figura 3 presenta il risultato della scansione di una piastra a 96 pozzetti con sferoidi tumore HCT 116 il giorno 3 di HT-OCT. La scansione sequenza di tutta la piastra inizia dal pozzo inferiore destro (H12). Figura 3B Mostra il diagramma di flusso di implem...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Attività del tumore è molto importante per la sua struttura morfologica. Simile alla curva di crescita caratteristici per colture cellulari 2D di monitoraggio, rilevamento la curva di crescita per sferoidi 3D del tumore è anche un approccio convenzionale per caratterizzare il comportamento di crescita a lungo termine della sferoide per differenti linee cellulari. In particolare, noi possiamo caratterizzare la risposta di droga analizzando la degradazione del tumore o ricrescita del tumore riflettuto direttamente la curva...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non divulgare alcun interesse concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da NSF concede IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), fondo di avvio di NIH sovvenzioni, R21EY026380, R15EB019704 e R01EB025209 e Lehigh University.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema di imaging OCT su dominio spettrale personalizzatoSviluppato nel nostro laboratorio
Diodo superluminescente (SLD)ThorlabsSLD1325sorgente luminosa
2× 2 accoppiatori in fibra fusa monomodale, rapporto di scissione 50:50AC PhotonicsWP13500202B201
Reference Arm
Lens TubeThorlabs
AdapterThorlabs
Colliming LensThorlabsAC080-020-C
Lente di messa a fuocoThorlabs
Thorlabs
SpecchioThorlabs
Stadio traslazionale 1DThorlabs
Filtro a densità neutra continuaThorlabs
Perno pedonaleThorlabs
Forca di serraggioBraccio Thorlabs
Sample Arm
Lens TubeThorlabs Adattatore Thorlabs
Collimazione LensThorlabs
GalvanometroThorlabs Relay Lens Thorlabs
due lenti a relè per configurare un telescopio
Triangle Mirror MountThorlabs
MirrorThorlabs
ObjectiveMitutoyo
Pedestrial PostThorlabs
Clamping ForkThorlabs
30mm Cage MountThorlabs
Asta a gabbiaThorlabs
Stage
3D stadio di traslazione motorizzataBeijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.
Tavolino
Rotazione Tavolino
portatargaSpettrometro stampato in 3
Lens TubeThorlabs
AdattatoreThorlabs
Collimazione LensThorlabsAC080-020-C
ReticoloWasatchG = 1145 lpmm
Obiettivo F-thetaThorlabsFTH-1064-100
InGaAs Sensore fotocamera a scansione lineareillimitatoSU1024-LDH2
NomeAziendaNumero di catalogo Commenti
Componente per colture cellulari
HCT 116 Linea cellulareATCCCCL-247
Fiaschetta per colture cellulariSPL Life Sciences70025
PipettaFisherbrand14388100
Puntali per pipetteSorenson Bioscience10340
Gibco GlutaMax DMEMThermo Fisher Scientific 10569044
Siero fetale bovino, certificato, origine statunitenseThermo Fisher Scientific16000044
Antibiotico-Antimicotico (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Corning Micropiastra a 96 pozzetti con fondo rotondo trasparente ad attacco ultrabassoCorning7007
Gibco PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Tripsina-EDTA (0,5%)Thermo Fisher Scientific15400054
Forma Serie II 3110 Incubatori a CO2 con rivestimento d'acqua ThermoFisher Scientific3120
GuantiVWR89428-750
ParafilmSigma-AldrichP7793
Pipette di trasferimentoGlobe Scientific138080
CentrifugaEppendorf5702 RPer centrifugare la provetta da 15 mL
CentrifugaNUAIREAWEL CF 48-RPer centrifugare la piastra a 96 pozzetti
MicroscopioOlympus
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Istologia & IHC
Scanner digitale per vetriniLeicaAperio AT2Ottenete immagini istologiche ad alta risoluzione
Servizio istologicoHistowiz Richiedeteun servizio per la colorazione istologica e immunoistologica dello sferoide tumorale
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Elenco degli OCT commerciali
SD-OCT systemThorlabsTelesto Series
SD-OCT systemWasatch PhotonicsWP OCT 1300 nm
NameCompanyNumero di catalogoComments
>Software per l'analisi dei dati
Analisi delle immagini di baseNIHImageJFiji funziona anche.
Rendering 3DThermo Fisher ScientificAmiraSoftware commerciale. Opzione 1
Rendering 3DBitplaneImaris. Opzione 2. Utilizzato nel software
acquisizionesu misura in C++.
Controllo di scenaPechino Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.MRC_3Incorporato nel codice di acquisizione OCT personalizzato
Softwaresviluppato su misura in C++. Utilizza la GPU. Incorporato nel codice di acquisizione dello Strumento di personalizzazione di Office personalizzato.
morfologica e fisiologicasviluppata su misura in MATLAB
Supporto per specchio cinematico AC080-020-C AC254-100-C Polarizzation Controller Thorlabs JTH360XYinclinabile 2D: : , software commerciale di OCT del protocollo sviluppato di elaborazione OCT Analisi

Riferimenti

  1. WHO. Cancer. , Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  5. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  6. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  7. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  8. Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  9. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29(2012).
  10. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  11. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  12. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  13. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  14. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  15. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  16. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348(2015).
  17. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  18. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  19. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  20. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  21. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  22. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846(2016).
  23. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951(2016).
  24. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  28. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  29. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  30. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412(2014).
  31. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), OCT1-OCT13 (2016).
  32. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  33. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  34. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. , Springer Science, Business Media. (2008).
  35. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171(2011).
  36. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  37. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  38. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  39. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).
  40. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  41. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  42. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  43. Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , Verlag von S. Hirzel. (1911).
  44. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331(2007).
  45. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  46. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , International Society for Optics and Photonics. 85710Z(2013).
  47. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  48. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  49. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  50. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  51. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  52. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Imaging 3DOCT ad alta produttivitmonitoraggio longitudinalecrescita tumoraleregioni di cellule morterendering 3Dsezioni ortogonaliscreening di farmaci
Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.