Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

Jingxin Wang; John Hammond; Kristen A. Johnson

doi:10.3791/59021

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Articolo metodologico

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

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DOI:

10.3791/59021

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30 gennaio 2019

Jingxin Wang¹ , John Hammond² , Kristen A. Johnson¹

¹Calibr, The Scripps Research Institute, ²Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

In questo articolo

Sommario

Protocolli dettagliati per entrambi in vitro e nelle celle selettivo 2'-idrossile acilazione analizzati dagli esperimenti di estensione (forma) di primer per determinare la struttura secondaria delle sequenze di pre-mRNA di interesse in presenza di una piccola molecola di RNA-targeting sono presentato in questo articolo.

Abstract

Nel processo di sviluppo di farmaci di RNA-targeting piccole molecole, delucidando i cambiamenti strutturali sulle loro interazioni con sequenze di RNA di destinazione desiderata. Forniamo qui una dettagliata in vitro e nelle celle selettivo 2'-idrossile acilazione analizzati di estensione dell'iniettore protocollo (forma) per studiare il cambiamento strutturale di RNA in presenza di un farmaco sperimentale per l'atrofia muscolare spinale (SMA), sopravvivenza di del neurone di motore (SMN)-C2 e in essone 7 del pre-mRNA del gene SMN2. In forma in vitro, una sequenza di RNA di 140 nucleotidi contenenti SMN2 essone 7 è trascritto da T7 RNA polimerasi, piegata in presenza di SMN-C2 e successivamente modificata da un reagente di acilazione mite 2'-OH, 2-methylnicotinic acido imidazolide (NAI). Questo complesso di 2'-OH-NAI è ulteriormente sondato da un ³²estensione P-con l'etichetta dell'iniettore e risolto mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina). Al contrario, 2'-OH acilazione in forma nelle celle si svolge in situ con SMN-C2 associato RNA cellulare in cellule viventi. La sequenza di pre-mRNA dell'esone 7 del gene SMN2, insieme a forma-indotto mutazioni nell'estensione del primer, poi è stata amplificata dalla PCR e soggette a sequenziamento di nuova generazione. Confrontando le due metodologie, forma in vitro è un metodo più redditizio e non richiede potenza di calcolo per visualizzare i risultati. Tuttavia, il modello in vitro di RNA derivati da SHAPE a volte si discosta dalla struttura secondaria in un contesto cellulare, probabilmente a causa della perdita di tutte le interazioni con le proteine RNA-leganti. Nelle celle forma non ha bisogno di un posto di lavoro materiale radioattivo e produce una struttura secondaria di RNA più precisa nel contesto cellulare. Inoltre, nelle celle forma è solitamente applicabile per un più grandi sequenze di gamma di RNA (~ 1.000 nucleotidi) utilizzando il sequenziamento di nuova generazione, rispetto a in vitro forma (~ 200 nucleotidi) che di solito si basa sull'analisi della pagina. Nel caso dell'esone 7 in SMN2 pre-mRNA, la forma in vitro e nelle celle derivate RNA modelli sono simili tra loro.

Introduzione

Acilazione di selettivo 2'-idrossile analizzati di estensione dell'iniettore (forma) è un metodo di misurazione la cinetica di ogni nucleotide in una sequenza di RNA di interesse e la struttura secondaria a singolo nucleotide risoluzione¹. Metodologie di forma, sia in condizioni in vitro²^,³^,⁴ (RNA purificato in un sistema tampone definito) e in vivo le cellule di mammiferi⁵^,⁶, sono stati sviluppati per indagare il secondario struttura delle sequenze di RNA di media lunghezza (in genere < 1.000 ....