Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l'uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l'esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.
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Articolo metodologico
Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo protocollo abbiamo dettaglio un metodo per ottenere le frazioni subcellulari delle cellule U937 senza l'uso di ultracentrifugazione o detergenti indiscriminati. Questo metodo utilizza buffer ipotonico, digitonina, Lisi meccanica e centrifugazione differenziale per isolare il citoplasma, mitocondri e membrana plasmatica. Il processo può essere scalata per soddisfare le esigenze dei ricercatori, è poco costoso e semplice. Questo metodo permetterà ai ricercatori di determinare la localizzazione della proteina in cellule senza centrifughe specializzati e senza l'uso di kit commerciali, entrambi i quali possono essere proibitivi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per separare citosolico, membrana plasmatica e proteine mitocondriali nella linea cellulare umana monociti U937.
Introduzione
Una identificazione affidabile di localizzazione della proteina è spesso necessaria quando si esaminano le vie molecolari in cellule eucariotiche. Metodi per ottenere le frazioni subcellulari sono utilizzate dai ricercatori di esaminare più attentamente i componenti cellulari di interesse.
La maggior parte dei metodi esistenti di frazionamento cellulare rientra generalmente in due ampie categorie, detergente a base di1,2 e basati su ultracentrifugazione3,4,5, che può essere differenziati per velocità, precisione e costo. Protocolli base detergente si basano sull'uso dei buffer con aumento della forza detergente per solubilizzare le distinte componenti della cellula. Questo è un metodo veloce e conveniente per l'elaborazione di campioni e può essere conveniente se il numero e le dimensioni dei campioni sono piccole. Detergente a base di kit possono essere acquistati per isolare citoplasmico membrana/organello (frazione mista) e frazioni nucleari dalle cellule. Tuttavia, parecchi inconvenienti connessi con questi kit limitano la loro utilità per i ricercatori. Essi sono progettati per isolare facilmente uno o due componenti della cellula, ma sono in grado di isolare tutte le frazioni da un campione contemporaneamente. L'uso di detergenti significa che la membrana plasmatica e degli organelli membrana-racchiuso saranno ugualmente essere solubilizzati e, quindi, incapace di essere separati uno da altro. Un'ulteriore complicazione deriva dai componenti proprietarie in questi kit che impedisce i ricercatori di alterare le condizioni per applicazioni specifiche. Infine, essi sono in numero di impiego limitati e può essere proibitivi per esperimenti su scala più grandi. Kit base detergente non esiste per l'isolamento dei mitocondri, tuttavia, essi non sono progettati per isolare la membrana plasmatica e la resa del campione è significativamente inferiore a quello da centrifugazione di densità basato isolamento protocolli6,7 .
Metodi che utilizzano il ultracentrifugazione per ottenere frazioni sono più termini di tempo, ma spesso risultato in frazioni più pure rispetto a kit a base di detergente. Per isolare il plasma membrane ottenute da cellule senza prima solubilizzanti li (con conseguente contaminazione con gli organelli membrana) richiede loro di essere lisati mediante un metodo non detergente, seguito dalla separazione di componenti cellulari tramite differenziale centrifugazione — con isolamento della membrana plasmatica che richiedono velocità di 100.000 × g per compire. In molti casi, centrifugazione differenziale deve essere seguita da centrifugazione in gradiente di densità isopicnica per un'ulteriore separazione di frazioni cellulari o la rimozione di contaminanti. Mentre questi metodi sono meticolosi e modificabile, gli svantaggi comprendono costo, consumo di tempo e la necessità di un'ultracentrifuga per la separazione di frazioni e ulteriore purificazione tramite densità centrifugazione su gradiente. La maggior parte delle centrifughe ad alta velocità sono ad un costo che è proibitivo per inquirenti e sono spesso condivisi, principali attrezzature alle istituzioni accademiche. Così, disponibilità ultracentrifuga diventa proibitivo in queste situazioni.
In questo protocollo di frazionamento dimostriamo l'isolamento delle frazioni subcellulari senza l'uso di detergenti di solubilizzanti e senza centrifugazione ad alta velocità. Questo metodo permetterà ai ricercatori di isolare la membrana plasmatica, mitocondri e componenti citoplasmatici di una cellula eucariotica con contaminazione minima tra frazioni.
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Protocollo
1. preparare il buffer e reagenti
Nota: Vedere la tabella 1.
- Preparare soluzioni tampone A, buffer di lisi B, tampone del campione e della digitonina.
- Preparare il tampone A aggiungendo 8,77 g di NaCl e 50 mL di HEPES (1 M, pH 7.4) a 900 mL di acqua deionizzata, regolare il volume finale di 1 L con acqua deionizzata.
Nota: Le concentrazioni finali sono NaCl 150 mM e 50 mM HEPES. - Preparare il tampone di lisi B aggiungere 20 mL di HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g di KCl, 0,19 g di MgCl2, 2 mL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA 0.5 M), 2 mL di glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (0,5 M EGTA) , 38,26 g di mannitolo e 23,96 g di saccarosio a 900 mL di acqua deionizzata, regolare il volume finale a 1 L con acqua deionizzata.
Nota: Le concentrazioni finali sono 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, mannitolo di 210 mM e 70 mM saccarosio. - Preparare il tampone del campione aggiungendo 0,01 g di sodio dodecil solfato (SDS) a 10 mL di soluzione fisiologica tamponata (TBS) per una concentrazione finale di 0,1% SDS.
- Preparare una soluzione stock di digitonina aggiungendo 25 mg di digitonina a 100 mL di acqua deionizzata (concentrazione finale è di 250 µ g/mL).
- Memorizzare tutte le soluzioni tampone a 4 ° C e della digitonina-20 ° c fino all'inizio dell'esperimento.
- Preparare il tampone A aggiungendo 8,77 g di NaCl e 50 mL di HEPES (1 M, pH 7.4) a 900 mL di acqua deionizzata, regolare il volume finale di 1 L con acqua deionizzata.
- Preparare soluzioni fresche di inibitori di proteasi e fosfatasi da aggiungere a soluzioni tampone prima dell'aggiunta alle cellule.
- Preparare una soluzione stock di fluoruro di fenilmetanosolfonil (PMSF) aggiungendo 17,4 mg di PMSF a 1 mL di etanolo al 100% (concentrazione finale è di 100 mM).
Attenzione: Indossare adeguati dispositivi di protezione e prestare attenzione quando si maneggia PMSF. PMSF è pericoloso se ingerito e leggermente pericoloso in caso di contatto cutaneo (irritante), contatto con gli occhi (irritante) o inalazione; è corrosivo per gli occhi e la pelle. - Preparare un cocktail di inibitore di proteasi disponibili in commercio (100 ×) secondo le istruzioni del produttore (Vedi la Tabella materiali).
- Preparare una soluzione stock di sodio ortovanadato (SOV) aggiungendo 92 mg di SOV a 1 mL di acqua deionizzata (concentrazione finale è di 500 mM).
Attenzione: Indossare adeguati dispositivi di protezione e usare cautela durante la manipolazione. SOV è pericoloso in caso di contatto con gli occhi (irritante), ingestione o inalazione. Sovresposizione severa può provocare la morte.
- Preparare una soluzione stock di fluoruro di fenilmetanosolfonil (PMSF) aggiungendo 17,4 mg di PMSF a 1 mL di etanolo al 100% (concentrazione finale è di 100 mM).
2. lavaggio con PBS
- Concentratevi e lavare le cellule in tampone fosfato salino (PBS) prima del frazionamento.
- Centrifugare la sospensione cellulare a una velocità adatta a creare una pallina. Ad esempio, centrifugare una sospensione di cellule U937 a 400 × g per 10 min.
- Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in PBS di temperatura a una concentrazione finale di 4 × 106 cellule/mL e pipetta delicatamente per rompere i grumi.
- Centrifugare la sospensione cellulare alle 400 × g per 10 min agglomerare le cellule.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in ghiaccio freddo tampone A ad una concentrazione finale di 2 × 107 cellule/mL.
Nota: Tutti i passaggi successivi devono essere effettuati a 4 ° C o su ghiaccio e tutti i buffer devono essere pre-refrigerati.
3. citosolico proteina isolamento
- Estratto di proteine citosoliche tramite incubazione con il detergente digitonina.
- Immediatamente prima della risospensione delle cellule (punto 3.1.3) aggiungere 10 µ l di brodo PMSF (100 mM), 10 µ l di proteasi inibitore (100 ×), 2 µ l di brodo SOV (500 mM) e 100 µ l di digitonina stock (250 µ g/mL) a 878 µ l di tampone A (concentrazioni finali sono 1 mM PMSF , 1 × inibitore della proteasi, 1mm SOV e 25 µ g/mL digitonina; regolare il volume finale secondo il numero di celle in uso). Conservare la soluzione sul ghiaccio fino oltre al pellet cellulare.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g per 10 min e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in soluzione tampone A contenente inibitori e digitonina (preparata al punto 3.1.1) ad una concentrazione finale di 2 × 107 cellule/mL, pipetta delicatamente per rompere i grumi.
- Incubare la sospensione cellulare in un rotatore di fine oltre a 4 ° C per 20 min.
- Centrifugare la sospensione cellulare alle 400 × g per 10 min. raccogliere il surnatante e metterlo in una provetta pulita.
- Centrifugare il surnatante raccolto a 18.000 × g per 20 min a pellet detriti cellulari.
- Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
- Ripetere i passaggi 3.1.5 e 3.1.6 no pellet è ottenuta dopo la centrifugazione.
- Raccogliere il surnatante contenente le proteine citosoliche e conservarla a 4 ° C (breve termine) o a-20 ° C (lungo termine).
- Rimuovere l'eccesso della digitonina e proteine citosoliche mediante centrifugazione.
- Risospendere il pellet cellulare della digitonina-permeabilized (dal punto 3.1.5) in tampone A ad una concentrazione finale di 4 × 106 cellule/mL e pipetta delicatamente per rompere i grumi.
- Centrifugare la sospensione della digitonina-permeabilized cella a 400 × g per 10 min e rimuovere il surnatante.
Nota: Ripetuti lavaggi in tampone A possono essere eseguite per rimuovere i contaminanti citosolici in eccesso.
4. cellula omogeneizzazione
- Incubare le cellule sul ghiaccio in tampone di lisi B e lisare loro mezzi meccanici.
- Immediatamente prima della risospensione delle cellule (punto 4.1.2) aggiungere 10 µ l di brodo PMSF (100 mM) e 2 µ l di brodo SOV (500 mM) a 988 µ l di tampone di lisi B (concentrazioni finali sono 1 mM PMSF e 1 mM SOV; regolare volume finale per ospitare il numero di celle viene lisato) e mantenere solu zione su ghiaccio fino a oltre al pellet cellulare.
- Risospendere il pellet cellulare (dal punto 3.2.2) in una soluzione di tampone B Lisi freddo ghiaccio contenente PMSF e SOV (preparata al punto 4.1.1) ad una concentrazione finale di 4 × 106 cellule/mL.
- Incubare la sospensione cellulare in ghiaccio per 30 min.
- Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore lisata pre-refrigerato (con un pestello B aderente) sul ghiaccio ed eseguire 40 passaggi con il pestello omogeneizzatore con lento, anche colpi.
Nota: In alternativa utilizzare altri mezzi di lisi cellulare meccanico come dettagliato nella sezione di discussione. - Raccogliere l'omogenato e trasferirlo in una provetta pulita.
- Lavare il tubo con un piccolo volume (1-2 mL) di tampone di lisi B e pestello omogeneizzatore e aggiungerlo all'omogeneizzato.
- Centrifugare l'omogeneizzato a 400 × g (o la velocità minima richiesta per agglomerare cellule ininterrotte) per 10 min.
- Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
Nota: Se un pellet significativo rimane ripetere i punti 4.1.4 attraverso 4.1.6 per aumentare il rendimento delle frazioni come dettagliato nella sezione discussione. Il protocollo può essere messo in pausa qui, e l'omogeneizzato conservati a 4 ° C per breve termine (24 h).
5. differenziale centrifugazione
- Centrifugare l'omogeneato ad aumentare la velocità per rimuovere detriti cellulari, isolare i mitocondri e frazioni della membrana.
- Centrifugare il supernatante (dal passaggio 4.1.8) a 500 × g per 10 min trasferimento surnatante in una provetta per centrifuga pulita e scartare qualsiasi pellet.
- Centrifugare il supernatante (dal punto 5.1.1) a 1.000 × g per 10 min trasferimento il surnatante in una provetta per centrifuga pulita e scartare qualsiasi pellet.
- Centrifugare il supernatante (dal punto 5.1.2) a 2.000 × g per 10 min. trasferimento del surnatante in una provetta per centrifuga pulita e scartare qualsiasi pellet.
- Centrifugare il supernatante (dal punto 5.1.3) a 4.000 × g per 15 min. trasferimento surnatante in una provetta pulita, tenere pellet contenenti mitocondri.
- Risospendere il pellet di mitocondri in un piccolo volume (0.5\u20121 mL) di tampone di lisi B.
- Centrifugare il precipitato sospeso a 4.000 × g per 15 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il mitocondriale pellet nel volume finale desiderato di sample buffer (ad es., 250 e 500 µ l, a seconda delle dimensioni del pellet e desiderato concentrazione).
- Centrifugare il supernatante (dal punto 5.1.4) a 4.000 × g per 15 min. trasferire il surnatante in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio finché non pellet è ottenuta dopo la centrifugazione.
- Girare il supernatante a 18.000 × g per 3 h.
- Rimuovere il surnatante e tenere il pellet contenente proteine di membrana. Risospendere il pellet di membrana in un piccolo volume (0,5 – 1 mL) di lisi del buffer B.
- Centrifugare il precipitato sospeso a 18.000 × g per 1 h.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di membrana nel volume finale desiderato di sample buffer (da 250 a 500 µ l, a seconda della dimensione del pellet e concentrazione desiderata).
- Sottoporre ad ultrasuoni i pellet di campione per 3 s in un bagno di ghiaccio con un'impostazione di alimentazione di 5 (50% della potenza massima di 125 W a 20 kHz, vedere La tabella dei materiali).
- Conservare i campioni a 4 ° C (breve termine) o a-20 ° C (lungo termine).
- Esaminare i campioni per la purezza del frazionamento mediante l'esecuzione di un western blot utilizzando anticorpi contro proteine marker trovato nei compartimenti citoplasma, i mitocondri e la membrana della cellula (fare riferimento alla sezione risultati rappresentativi).
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Risultati
Successo il frazionamento dell'indifferenziato U9378 cellule cresciute in sospensione è stato compiuto utilizzando il protocollo sopra descritti e illustrati nella Figura 1. I campioni ottenuti con questo metodo sono stati sottoposti a western blotting9 utilizzando un metodo di trasferimento bagnato ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF). La membrana è stata successivamente sondata con gli anticorpi c...
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Discussione
Lo sviluppo di questo protocollo è sorto da un'incapacità di separare mitocondriale e campioni di membrana, usando i kit disponibili in commercio, per analisi di localizzazione della proteina durante la necroptosis14. Le limitazioni primarie di premade kit sono loro incapacità di essere adattato alle esigenze dei singoli ricercatori, loro costo per campione e numero limitato di campioni in grado di essere elaborati. Il metodo presentato qui può essere eseguito senza l'uso di reagenti costosi e sen...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi
Ringraziamenti
Lavoro è stato supportato da NIH-1R15HL135675-01 di Timothy J. LaRocca
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | Per l'estrazione del citoplasma |
| D-mannitolo | Sigma-Aldrich | M4125 | Per tampone di lisi B |
| Omogeneizzatore a balze | VWR | 22877-282 | Per l'omogeneizzazione |
| rotatore end-over-end | Barnstead | N/A | Per l'estrazione del citoplasma |
| glicole etilenico-bis(β-amminoetiletere)-N,N,N' ,Acido N'-tetraacetico (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | Per tampone di lisi B |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Per tampone di lisi B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | Per la rilevazione di frazioni citoplasmatiche su western blot, diluizione: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | Per tamponi di lisi A e B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Per tampone di lisi B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | Per tampone di lisi B |
| Na, K-ATPasi a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | Per la rilevazione di frazioni di membrana plasmatica su western blot, <>diluizione: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Per tampone di lisi A |
| fluoruro di fenilmetanosulfonile (PMSF) | VWR | M145 | per l'estrazione e l'omogeneizzazione del citoplasma Sonicatore della sonda tampone |
| Qsonica | Q125-110 | Per i campioni finali | |
| Cocktail di inibitori della proteasi, uso generale | VWR | M221-1ML | Per l'estrazione del citoplasma |
| Centrifuga refrigerata | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | VWR | 227 | Per tampone campione |
| ortovanadato di sodio (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | Per tamponi di lisi A e B |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | Per tampone di lisi B |
| Soluzione salina tamponata tris (TBS) | VWR | 788 | Per tampone campione |
| VDAC (D73D12) | Tecnologie | di segnalazione cellulare4661 | Per la rilevazione di frazioni mitocondriali su western blot, <>diluizione: 1:1000 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
