Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l'uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l'esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.
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Articolo metodologico
Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo protocollo abbiamo dettaglio un metodo per ottenere le frazioni subcellulari delle cellule U937 senza l'uso di ultracentrifugazione o detergenti indiscriminati. Questo metodo utilizza buffer ipotonico, digitonina, Lisi meccanica e centrifugazione differenziale per isolare il citoplasma, mitocondri e membrana plasmatica. Il processo può essere scalata per soddisfare le esigenze dei ricercatori, è poco costoso e semplice. Questo metodo permetterà ai ricercatori di determinare la localizzazione della proteina in cellule senza centrifughe specializzati e senza l'uso di kit commerciali, entrambi i quali possono essere proibitivi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per separare citosolico, membrana plasmatica e proteine mitocondriali nella linea cellulare umana monociti U937.
Introduzione
Una identificazione affidabile di localizzazione della proteina è spesso necessaria quando si esaminano le vie molecolari in cellule eucariotiche. Metodi per ottenere le frazioni subcellulari sono utilizzate dai ricercatori di esaminare più attentamente i componenti cellulari di interesse.
La maggior parte dei metodi esistenti di frazionamento cellulare rientra generalmente in due ampie categorie, detergente a base di1,2 e basati su ultracentrifugazione3,4,5, che può essere differenziati pe....
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Protocollo
1. preparare il buffer e reagenti
Nota: Vedere la tabella 1.
- Preparare soluzioni tampone A, buffer di lisi B, tampone del campione e della digitonina.
- Preparare il tampone A aggiungendo 8,77 g di NaCl e 50 mL di HEPES (1 M, pH 7.4) a 900 mL di acqua deionizzata, regolare il volume finale di 1 L con acqua deionizzata.
Nota: Le concentrazioni finali sono NaCl 150 mM e 50 mM HEPES. - Preparare il tampone di lisi B aggiungere 20 mL di HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g di KCl, 0,19 g di MgCl2, 2 mL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA 0.5 M), 2 mL di glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ethe....
- Preparare il tampone A aggiungendo 8,77 g di NaCl e 50 mL di HEPES (1 M, pH 7.4) a 900 mL di acqua deionizzata, regolare il volume finale di 1 L con acqua deionizzata.
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Risultati
Successo il frazionamento dell'indifferenziato U9378 cellule cresciute in sospensione è stato compiuto utilizzando il protocollo sopra descritti e illustrati nella Figura 1. I campioni ottenuti con questo metodo sono stati sottoposti a western blotting9 utilizzando un metodo di trasferimento bagnato ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF). La membrana è stata successivamente sondata con gli anticorpi c.......
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Discussione
Lo sviluppo di questo protocollo è sorto da un'incapacità di separare mitocondriale e campioni di membrana, usando i kit disponibili in commercio, per analisi di localizzazione della proteina durante la necroptosis14. Le limitazioni primarie di premade kit sono loro incapacità di essere adattato alle esigenze dei singoli ricercatori, loro costo per campione e numero limitato di campioni in grado di essere elaborati. Il metodo presentato qui può essere eseguito senza l'uso di reagenti costosi e sen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi
Ringraziamenti
Lavoro è stato supportato da NIH-1R15HL135675-01 di Timothy J. LaRocca
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | Per l'estrazione del citoplasma |
| D-mannitolo | Sigma-Aldrich | M4125 | Per tampone di lisi B |
| Omogeneizzatore a balze | VWR | 22877-282 | Per l'omogeneizzazione |
| rotatore end-over-end | Barnstead | N/A | Per l'estrazione del citoplasma |
| glicole etilenico-bis(β-amminoetiletere)-N,N,N' ,Acido N'-tetraacetico (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | Per tampone di lisi B |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Per tampone di lisi B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | Per la rilevazione di frazioni citoplasmatiche su western blot, diluizione: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | Per tamponi di lisi A e B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Per tampone di lisi B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | Per tampone di lisi B |
| Na, K-ATPasi a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | Per la rilevazione di frazioni di membrana plasmatica su western blot, <>diluizione: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Per tampone di lisi A |
| fluoruro di fenilmetanosulfonile (PMSF) | VWR | M145 | per l'estrazione e l'omogeneizzazione del citoplasma Sonicatore della sonda tampone |
| Qsonica | Q125-110 | Per i campioni finali | |
| Cocktail di inibitori della proteasi, uso generale | VWR | M221-1ML | Per l'estrazione del citoplasma |
| Centrifuga refrigerata | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | VWR | 227 | Per tampone campione |
| ortovanadato di sodio (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | Per tamponi di lisi A e B |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | Per tampone di lisi B |
| Soluzione salina tamponata tris (TBS) | VWR | 788 | Per tampone campione |
| VDAC (D73D12) | Tecnologie | di segnalazione cellulare4661 | Per la rilevazione di frazioni mitocondriali su western blot, <>diluizione: 1:1000 |
Riferimenti
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K.
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Ristampe e permessi
