Questo studio descrive un throughput elevato, basato su formazione immagine di analisi di micro-neutralizzazione per determinare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo formato di dosaggio è stato testato su tipi di campioni diversi.
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Articolo metodologico
Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Respiratori sinciziali virus-specifici anticorpi neutralizzanti (RSV NAbs) sono un indicatore importante di protezione contro RSV. Un numero di formati diversi test è attualmente in uso in tutto il mondo c'è un'esigenza di un metodo preciso e ad alta produttività per la misurazione NAbs RSV. Descriviamo qui un'analisi micro-neutralizzazione basato su formazione immagine che è stata testata su sottogruppo RSV A e può essere adattata anche per RSV sottogruppo B e tipi di campioni diversi. Questo metodo è altamente riproducibile, con variazioni inter-saggio per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%. Crediamo che questo test può essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Sviluppo di un'analisi migliore, ad alta produttività che misura RSV NAbs rappresenta un significativo passo avanti per la normalizzazione di questo metodo a livello internazionale, oltre ad essere critici per la valutazione di nuovi candidati vaccinali di RSV in futuro.
Introduzione
Virus respiratorio sinciziale (RSV) è la causa principale delle infezioni più basse delle vie respiratorie nella popolazione pediatrica in tutto il mondo1. Nonostante la sua alta difficoltà, non c'è ancora nessun vaccino o trattamento disponibile. Dal 2013, l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha dichiarato lo sviluppo di vaccini di RSV come una priorità di ricerca principali, con annuale WHO consultazione riunioni2,3. L'OMS ha concordato sull'utilizzo RSV neutralizzando misura dell'anticorpo (NAb) per monitorare l'immunogenicità del vaccino, come questo è riconosciuto come il p....
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Protocollo
Nota: Tutte le fasi devono essere eseguite in un cappuccio BSL2 se non diversamente indicato. Titolazione virale è richiesto in anticipo un dosaggio PRN per determinare la concentrazione ottimale di RSV usata per il test PRN. Si raccomanda di aliquota le scorte di virus in un piccolo volume che verrà una volta scongelati e utilizzato per ogni dosaggio NAb. Inoltre è consigliabile utilizzare lo stesso stock virale per tutti i saggi di NAb eseguite per tutti i campioni provenienti da uno studio. Assicurarsi di terreni di coltura e tampone fosfato salino (PBS) è riscaldato a 37 ° C prima di aggiungere alla cella piastre.
1. Tito....
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Risultati
La titolazione di uno stock di virus è stata effettuata da 01:10 a 01:108 diluizione per determinare la concentrazione di stock di virus prima del dosaggio del PRN (risultati rappresentativi illustrati nella Figura 5). Dalla Figura 5, PFU può contare in modo affidabile alle diluizioni di 01:104 e 01:105. È stato calcolato il numero medio di PFU da pozzi triplici con la stessa diluizione. Poiché il.......
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Discussione
Abbiamo sviluppato e ottimizzato un'analisi di micro-neutralizzazione di RSV semplice ed efficiente che può essere facilmente adattata nella maggior parte dei laboratori. Questo test è in grado di misurare la capacità di infezione virale così come l'inibizione di infezione virale di NAb a livello cellulare mediante scansione immagine automatizzata di misura. L'uso di una piattaforma basata su formazione immagine e sistemi basati su anticorpi specifici ha aumentato la specificità e la sensibilità di rilevazione spot rispe.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano tutti i partecipanti coinvolti. Riconosciamo il programma di supporto dell'infrastruttura operativa del governo vittoriano. PVL è un destinatario NHMRC carriera sviluppo Fellowship.
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Materiali
General Materiali di consumo
Siero fetale di vitello (conservato in aliquote da 50 ml a -20 °;Tween 20 polisorbato Sigma-Aldrich 9005-64-5Provette Falcon coniche (50 mL)Invitro Technologies FAL352070 Unità filtrante 0,22 &;
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linea cellulare | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | fornito dal Dr. Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral ceins | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | numero di lotto 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor asino anti-capra IgG (conservato a 4 ° C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sale sodico in polvere | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (senza siero, 3,7 g/L NaHC, P/S) (conservato a 4 ° C) | Servizi scientifici – Coltura tissutale | MCRI in house fornitura | |
| C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV anticorpo | Merck | AB1128 | |
| antisiero policlonale umano contro il virus respiratorio sinciziale (RSV) (conservato in 45 µ L aliquote a -20 ° C) | BEI Resources | NR-4022 | Ordine gratuito tramite BEI Resources al momento della registrazione. Questo siero appartiene a un pannello di antisiero umano e immunoglobuline per RSV (NR-32832) |
| M199 polvere | Life Technologies | 31100035 | |
| Soluzione bloccante diluente al latte (conservata a 4 ° C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillina/Streptomicina (conservato in aliquote da 6 ml a -20 gradi; C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O dal dispenser Milli-Q | Merck | Dispensazione interna | |
| Sterile 1x PBS per coltura (conservato a 4 ° C) | Servizi scientifici – Coltura tissutale | MCRI in house supply | |
| m (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Provette sterili Eppendorf (1,5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Piastre sterili a fondo piatto (96 pozzetti con coperchio) | Interpath | 655180 | |
| Piastre sterili con fondo a U (96 pozzetti con coperchio) | Interpath | 650180 | |
| Pipetta sierologica da 5 mL | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| pipetta sierologica da 10 mL | Interpath | 607180 | |
| pipetta sierologica da 25 mL | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilizzato 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipetta 5-20 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilizzato 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipetta 100-1.000 &; LClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipetta 1-10 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Attrezzature e software | |||
| ELISpot sistema di lettura | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburgo, Germania | ||
| AID ELISpot software versione 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburgo, Germania | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Riferimenti
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
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Ristampe e permessi
