La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.
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Articolo metodologico
Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'osso è un tessuto connettivo costituito da osteoblasti, osteociti e osteoclasti e una matrice extracellulare mineralizzata, che gli conferisce la sua forza e flessibilità e gli permette di svolgere le sue funzioni. L'osso è continuamente esposto a una varietà di stimoli, che in condizioni patologiche possono deregolare il rimodellamento osseo. Per studiare biologia e malattie ossee e valutare potenziali agenti terapeutici, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo.
Questo manoscritto descrive il processo di dissezione e le condizioni di coltura dei calvarias isolati dai topi neonemici per studiare la formazione ossea e il microambiente tumorale osseo. A differenza dei modelli in vitro e in vivo, questo modello ex vivo consente la conservazione dell'ambiente tridimensionale del tessuto e della diversità cellulare dell'osso durante la coltura in condizioni definite per simulare il microambiente desiderato. Pertanto, è possibile studiare il rimodellamento osseo e i suoi meccanismi, nonché le interazioni con altri tipi di cellule, come le interazioni tra cellule tumorali e ossa.
I saggi qui riportati usano calvarias da topi BALB/C di 5-7 giorni. Le emi-calvarias ottenute sono coltivate in presenza di insulina, cellule del cancro al seno (MDA-MB-231), o mezzo condizionato dalle colture di cellule del cancro al seno. Dopo l'analisi, è stato stabilito che l'insulina ha indotto nuova formazione ossea, mentre le cellule tumorali e il loro rinnovano osseo medio condizionato. Il modello calvariale è stato utilizzato con successo nella ricerca di base e applicata per studiare lo sviluppo osseo e le malattie ossee indotte dal cancro. Nel complesso, è un'opzione eccellente per un saggio facile, informativo e a basso costo.
Introduzione
L'osso è un tessuto connettivo dinamico che ha diverse funzioni, tra cui sostenere i muscoli, proteggere gli organi interni e il midollo osseo, e immagazzinare e rilasciare calcio e fattori di crescita1,2. Per mantenere la sua integrità e la corretta funzione, il tessuto osseo è continuamente sotto il processo di rimodellamento. In termini generali, un ciclo di rimodellamento osseo può essere diviso in risorsurare l'osso e la formazione ossea1. Uno squilibrio tra queste due fasi di rimodellamento osseo può portare allo sviluppo di patologie ossee. Inoltre, malattie come il cancro al sen....
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Protocollo
Tutti i topi utilizzati in questi saggi sono stati ottenuti da ceppi di topi BALB/c, usando indiscriminatamente topi maschi e femmine. Precedenti esperimenti di coltura sono stati eseguiti anche utilizzando altri ceppi, come FVB, topi svizzeri, CD-1 e mouse CsA11,12,14. Tutti i topi sono stati ospitati secondo le linee guida dei National Institutes of Health (NIH), le procedure dell'Appendice Q. che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) presso il Center for Scientific Research and Higher Education di Ensena....
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Risultati
Per valutare la formazione ossea nel modello calvariale, abbiamo coltivato le emi-calvarias nei media con o senza 50 g/mL di insulina. Le sezioni dei tessuti sono state preparate e macchiate di H&E. In queste condizioni, l'istologia ha dimostrato che l'integrità strutturale dell'osso calvariale è stata mantenuta, consentendo l'identificazione dei suoi diversi componenti (Figura 1). Le calvarias trattate con insulina presentavano un aumento della quantità .......
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Discussione
Qui, descriviamo il protocollo per un modello di ex vivo calvariale per valutare la formazione o il risurrezione ossea e per studiare le interazioni delle cellule tumorali con l'osso cavariale del topo. I passaggi critici di questa tecnica sono la dissezione, la cultura, l'incorporamento e l'analisi istomormetrica dei calvarias. Durante la dissezione delle calvarias, è fondamentale tagliare le emi-calvarias in un trapezio, in quanto faciliterà fortemente l'orientamento durante l'inclusione della paraffina. Quand.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Mario Nomura, M.D. e Rodolfo Daaz per il loro aiuto con l'istologia, e Pierrick Fournier, Ph.D. per i suoi preziosi commenti per migliorare la qualità della carta.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coltura cellulare a 24 pozzetti | Corning | CLS3524 | |
| Coltura non tissutale a 24 pozzetti | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL crioviale | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotici-Antimicotici | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifuga | Eppendorf | 22628188 | Centrifuga 5810R |
| Vetrini coprioggetti | Corning | 2935-24X50 | |
| Resina citosigillante | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, con 4,5 g/L di glucosio e L-glutammina, senza piruvato di sodio | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Cassette di ebedding | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Stazione di lavoro per inclusione | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Etanolo assoluto | JALMEK | E5325-17P | |
| Siero fetale bovino | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filtri | Corning | CLS431229 | |
| Pinze e forbici | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalina tamponata 10% | Sigma | HT501320 | |
| Vetrini 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| Lame ad alto profilo | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulina da pancreas bovino | Sigma | 16634 | |
| Microscopio | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Cibo per topi, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Arancione G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffina | Paraplast | 39601006 | |
| Sezione di paraffina Bagno di galleggiamento | Elettrotermico | MH8517X1 | |
| Piastra di Petri | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Dispenser di cera | Elettrotermico | MH8523BX1 | |
| Xilene | Dorato | 534056-500ML |
Riferimenti
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no ....
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Ristampe e permessi
