Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.
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Articolo metodologico
Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo un metodo per produrre una Nanoemulsione composto da un nucleo di acids-Pt(II) acido oleico e un rivestimento (KYF) di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE incapsula PT al 10% in peso, ha un diametro di 107 ± 27 nm e una carica negativa di superficie. KYF-Pt-NE è stabile in acqua e in siero ed è biologicamente attivo. La coniugazione di un fluoroforo di KYF permette la sintesi di una Nanoemulsione fluorescente che è adatto per l'imaging biologico. La sintesi del Nanoemulsione viene eseguita in un ambiente acquoso e le forme di KYF-Pt-NE via auto-assemblaggio di un peptide KYF breve e un coniugato acido oleico acids-platinum(II). L'auto-assemblaggio processo dipende la temperatura della soluzione, il rapporto molare dei substrati e la portata dell'aggiunta del substrato. Passi fondamentali includono mantenendo il tasso ottimale di agitazione durante la sintesi, permettendo un tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e pre-concentrando la Nanoemulsione gradualmente in un concentratore centrifugo.
Introduzione
Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'ingegneria di nanoparticelle per applicazioni biomedicali come consegna della droga e bioimmagini1,2,3,4. La multifunzionalità dei sistemi basati su nanoparticelle richiede spesso incorporando più componenti all'interno di una formulazione. I mattoni che si basano sui lipidi o polimeri spesso differiscono in termini di loro proprietà fisico-chimiche nonché loro biocompatibilità e biodegradabilità, che alla fine potrebbe influenzare la funzione della nanostruttura1
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Protocollo
1. sintesi del coniugato acido oleico Acids–Platinum(II)
- Attivazione di cisplatino
- Sospendere 50 mg (0.167 mmol) di cisplatino in 4 mL di acqua (ad es., nanopure) a 60 ° C.
- Aggiungere goccia a goccia 55,2 mg (0.325 mmol) di AgNO3 in 0,5 mL di acqua per la soluzione di cisplatino e mescolare la reazione per almeno 2 h a 60 ° C. Il precipitato bianco di AgCl formerà che indica l'avanzamento della reazione.
- Per determinare se la reazione di attivazione è stata completata, eseguire il test con 10% HCl per la presenza dello ione di Ag+ libero in soluzione. Il test dovrebbe essere negativo (nessun precipitato di ....
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Risultati
Immagine rappresentante TEM di KYF-Pt-NE preparato usando questo protocollo è mostrato nella Figura 2A. KYF-Pt-NEs sono sferici in morfologia, ben dispersero e di dimensioni uniformi. Il diametro del nucleo di KYF-Pt-NEs, misurata direttamente da tre immagini TEM con un minimo di 200 misure effettuate, è 107 ± 27 nm. Il diametro idrodinamico di KYF-Pt-NE, analizzato usando la spettroscopia luce dinamica (DLS), è stato trovato per essere 240 nm con un indice d.......
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Discussione
Fasi critiche nella sintesi Nanoemulsione includono il rapporto molare dei substrati di regolazione, mantenendo il controllo di tasso di flusso e temperatura durante l'aggiunta di acido oleico acids–Pt(II), fornire tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e purificare il prodotto utilizzando un colonna di concentratore centrifugo. Questi parametri influenzano le dimensioni e la morfologia di KYF-Pt-NE; Pertanto, è particolarmente importante mantenere il corretto rapporto molare e regolare correttamente le condizioni sin.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno un conflitto di interessi di divulgare.
Ringraziamenti
Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dal National Cancer Institute, concedere SC2CA206194. Concorrenti interessi finanziari non vengono dichiarati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU) | ANASPEC INC.: | AS-20376 | |
| Piatto confocale a camera a 4 pozzetti | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 | Per l'imaging | |
| dell'acido 6-bromoesanoico | Chem-Impex INT' L INC. | 24477 | Modifica a scatto per il peptide |
| A2780 | Generosamente curato dal professor John Martignetti del Mount Sinai Hospital | Linea cellulare per il cancro ovarico | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | sistema di filtrazione dell'acqua |
| BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | Per la rimozione del solvente e l'essiccazione del campione |
| Centrifuga 5810 R | eppendorf | 5811F | Per la separazione del complesso di platino |
| Cis-diclorodiammina platino (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | test in vitro |
| CP70 | Generosamente curato dal professor John Martignetti del Mount Sinai Hospital | Linea cellulare per il cancro ovarico | |
| d'acqua digitale | VWR | 97025-134 | Per il riscaldamento di terreni per colture cellulari |
| Diffusione dinamica della luce (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | Per le misure delle dimensioni delle nanoparticelle | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | linea cellulare di cancro ovarico |
| Fmoc-L-Lys (Boc) -OH 99,79% | Chem-Impex INT' L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe Resina di alcool 4-alcossibenzilico (0,382 meq/g), | Chem-Impex INT' L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i Incubatore a CO2 | Thermo Scientific Incubatore Fisher | ||
| Pompa a siringa ad alta pressione | New Era | 1010-US | Per l'aggiunta di complessi di platino nella sintesi di nanoparticelle |
| Piastra riscaldante/agitatore | VWR | 12365-382 | Per l'agitazione e il riscaldamento |
| del campioneAnticorpo LAMP-1 (coniugato con Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | Per imaging |
| N,N-diisopropiletilammina (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| Ninidrina 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
| Acido | oleico Chem-Impex INT' L INC. | 01421 | Per la sintesi del complesso di platino |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | Linea cellulare di carcinoma ovarico |
| PBS | Corning | 21-031-CV | Per il lavaggio cellulare |
| Terreno di montaggio Permount | Fisher Chemical | SP15-100 | Per l'imaging |
| Fenolo | Fisher Chemical | A92500 | Test Kaiser |
| Acido fosfotungstico | Fisher Chemical | A248-25 | colorante negativo per TEM |
| Piperidina 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml per curva |
| di calibrazione Propargyl bromuro 97% | Alfa Aesar | L10595 | Per la modifica alchino della fluoresceina |
| Cabina biologica scientifica | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood per coltura cellulare |
| Sistema per vuoto autopulente | Welch | 2028 | Pompa per vuoto rotavapor |
| Nitrato d'argento | Acros Organics | 19768-0250 | Attivazione del cisplatino |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Linea cellulare di cancro ovarico |
| Idrossido di sodio | Fisher Scientific | S313-1 | Per la sintesi del complesso di platino |
| Cloruro | di stagno (II)Sigma Aldrich | 208256 Test per la presenza di platino | |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Linea cellulare di cancro ovarico |
| Acido trifluoroacetico 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| Triisopropilsilano (TIPS) | Chem-Impex INT' L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | Per l'imaging |
| Polvere di uranina 40% | Fisher Scientific S25328A | Per la modifica alchinica della fluoresceina | |
| Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | Per il lavaggio e la condensazione delle nanoparticelle |
| VWR Microscopio invertito VWR | VWR | 89404-462 | Per il monitoraggio delle colture cellulari |
Riferimenti
- Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
- Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translat....
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Ristampe e permessi
