Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Summary

Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.

Abstract

Materia organica naturale (NOM) è composto da una miscela molto complessa di migliaia di composti organici che, storicamente, si è rivelata difficile da caratterizzare. Tuttavia, per comprendere i controlli termodinamici e cinetici di produzione di gas (anidride carbonica [CO₂] e [CH₄] metano) serra derivanti dalla decomposizione di NOM, una caratterizzazione a livello molecolare accoppiato con microbica analisi del proteoma è necessario. Clima e cambiamenti ambientali si prevedono ulteriori, per perturbare gli ecosistemi naturali, sconvolgendo potenzialmente complesse interazioni che influenzano sia la fornitura di substrati di materia organica e i microrganismi eseguire le trasformazioni. Una dettagliata caratterizzazione molecolare della materia organica, proteomica microbica e le vie e le trasformazioni mediante il quale la materia organica viene decomposta sarà necessaria prevedere la direzione e l'entità degli effetti dei cambiamenti ambientali. Questo articolo viene descritto un throughput metodologico per la caratterizzazione completa del metabolita in un singolo campione di iniezione diretta Fourier transform ionica risonanza ciclotronica (FTICR-MS), gas cromatografia spettrometria di massa (GC-MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), liquido cromatografia spettrometria di massa (LC-MS) e l'analisi proteomica. Questo approccio si traduce in un set di dati completamente accoppiato che migliora la confidenza statistica per la deduzione delle vie di decomposizione di materia organica, la risultante di CO₂ e tassi di produzione₄ CH e le loro risposte a perturbazioni ambientali. Qui presentiamo i risultati dell'applicazione di questo metodo a NOM campioni raccolti da torbiere; Tuttavia, il protocollo è applicabile a qualsiasi campione NOM (ad es., torba, terreno boscoso, sedimenti marini, ecc.).

Introduction

Globalmente, le zone umide sono stimate a contengono Pg 529 del carbonio (C), principalmente come C organico seppellito in depositi di torba¹. Attualmente, tali torbiere agiscono come un lavandino C netto, sequestrante 29 Tg C y^-1 nel Nord America da solo¹. Tuttavia, disturbi ambientali come drenante, incendi, siccità e temperature più calde possono compensare questo sink C aumentando la decomposizione di materia organica con conseguente aumentata C perdite tramite gas serra (anidride carbonica [CO₂] e ^1,produzione di metano [CH₄])

Protocol

1. sequenziale estrazione della materia organica da suolo, sedimenti o torba

1. Raccogliere il suolo, sedimenti o torba tramite carotaggi e dividere nuclei secondo l'ipotesi che in fase di test (ad es., profondità). Esempi di Store in politetrafluoroetilene rivestito contenitori e congelare a-80 ° C per la conservazione prima dell'analisi.
   Nota: Circa 25 mg C è necessario per questo protocollo. Per torba (in genere 45% C), 50 mg di torba secca è richiesto. Grandi quantità di campione può essere necessaria per Bassi campioni organici come suoli minerali o boscose alture a seconda la C contenuto (fino a 5 g). Poiché l'estrazione con solventi ....

Results

Abbiamo eseguito il protocollo descritto analisi complementari ed abbiamo paragonato la torba con profondità nella palude S1 in abete e le torbiere risposta sotto cambiando ambienti (SPRUCE) sito in Minnesota, Stati Uniti d'America. Questi risultati sono paragonati a quelli da una palude di permafrost e fen dal nord della Svezia per mostrare come siti possono variare nelle attività metabolita e degli enzimi. Abbiamo identificato 3.312 enzimi nell'analisi proteomica. Un'analisi delle attività di enzimi con profondità rive.......

Discussion

Il singolo-throughput, analisi completamente accoppiati flusso utilizzato per caratterizzare metaboliti e il proteoma fornisce intuizioni le vie da cui C ciclismo è in corso in un complesso ecosistema. Terreno e torba sono matrici eterogenee, e di conseguenza, si verifica una delle fasi critiche di questo metodo nei primi passaggi nel garantire che la partenza di torba o materiale del terreno è altamente omogeneo. È preferibile per macinare il campione bene come aggregati possono ridurre l'efficienza di estrazione. Si tr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
metossiamina cloridrato	Sigma Aldrich	226904	agente di derivatizzazione
5 mm sonda fredda tollerante al sale a tripla risonanza	strumentazione	Bruker
Colonna HP-5MS (30 m &volte; 0,25 mm &volte; 0,25 μ m)	Agilent	AG19091S-433
(3,0 mm &volte; 150 mm & 1,7 μ	Strumentazione	ThermoFisher
Fiale in vetro da 2 mL	VWR International	46610-722	fiale per campioni fiale
autocampionatori	VWR International	97055-324;	9467671 fiale per campioni
Chloroformio	VWR International	JT9174-3	solvente
Etanolo	VWR International	BDH67002.400	solvente
metanolo	VWR International	BDH85681.400	solvente
piridina	VWR International	BDH67007.400	solvente
2,2-dimetil-2-silapentano-5-solfonato-d6	Sigma Aldrich	178837	standard
C8-C24 estere metilico degli acidi grassi	Sigma Aldrich	CRM18918	standard
N-metil-N- (trimetilsilil)trifluoroacetammide	Sigma Aldrich	24589-78-4	standard
Suwanee River Fulvic Acid standard	International Humic Substances Society	2S101F	standard
trimetilclorosilano	Sigma Aldrich	89595
standard Soluzione di sintonizzazione	Agilent
Software di analisi FTICR-MS	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Software di formularità	Pacific Northwest National	Laboratory Formularity	disponibile per il download all'indirizzo: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS	Agilent	Agilent GC 7890A con assorbente a base di silice MSD 5975C
	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5	VWR International KT897820-0008		NMR tube
Spettrometro NMR Varian Direct Drive da 600 MHz	Varian Inova	Varian Direct Drive Spettrometro NMR da 600 MHz
Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	NMR Software
cromatografo liquido ad alte prestazioni	acque	Acquity UPLC H	cromatografo liquido
Spettrometro di massa Velos-ETD Orbitrap	Spettrometro di massa ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos