Interazioni proteina-proteina sono critiche per sistemi biologici, e studi di cinetica di legame forniscono intuizioni la dinamica e la funzione dei complessi della proteina. Descriviamo un metodo che quantifica i parametri cinetici di una proteina complessa che utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza e la tecnica di flusso interrotto.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine sono i principali operatori dei sistemi biologici, e di solito interagiscono con altri macro - o piccole molecole per svolgere le loro funzioni biologiche. Tali interazioni possono essere altamente dinamiche, significato le subunità interagenti sono costantemente associate e dissociate a determinate tariffe. Mentre l'affinità di legame utilizzando tecniche quali discesa quantitativa rivela la forza dell'interazione, studiare la cinetica di legame di misurazione fornisce intuizioni su come veloce si verifica l'interazione e per quanto tempo ogni complesso può esistere. Inoltre, la cinetica di un'interazione in presenza di un fattore supplementare, ad esempio un fattore di scambio di proteina o un farmaco, di misura aiuta a rivelare il meccanismo mediante il quale l'interazione è regolata da un altro fattore, fornendo conoscenze importanti per la avanzamento della ricerca biologica e medica. Qui, descriviamo un protocollo per la misurazione la cinetica di legame di un complesso proteico che ha un tasso di alta associazione intrinseco e possa essere dissociato rapidamente da un'altra proteina. Il metodo utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza per segnalare la formazione del complesso della proteina in vitro, e consente il monitoraggio veloce associazione e dissociazione del complesso in tempo reale su un fluorimetro flusso interrotto. Usando questa analisi, le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso proteico sono quantificate.
Introduzione
Attività biologiche sono in ultima analisi, effettuate dalle proteine, più di cui interagire con gli altri per corrette funzioni biologiche. Utilizzando un approccio computazionale, l'importo totale delle interazioni proteina-proteina in essere umano è stimato essere ~ 650.0001e rottura di queste interazioni spesso conduce a malattie2. A causa del loro ruolo essenziale nel controllo dei processi cellulari e organismi, sono stati sviluppati numerosi metodi per lo studio delle interazioni proteina-proteina, quali lievito-due-ibrido, complementazione bimolecolare fluorescenza, Spalato-luciferasi 3ana....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. progettazione del dosaggio FRET.
- Scaricare il file di struttura dei Cul1•Cand1 complessi da Protein Data Bank (file 1U6G).
- Visualizzare la struttura della Cul1•Cand1 complesso in PyMOL.
- Utilizzare la funzione di misurazione nel menu di creazione guidata di PyMOL per stimare la distanza tra il primo amminoacido di Cand1 e l'ultimo amminoacido di Cul1 (Figura 1).
- Il visualizzatore online spettri di carico (Vedi Tabella materiali) e visualizzare contemporaneamente l'eccitazione e spettri di emissione di 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) e FlAsH (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per testare il FRET tra Cul1AMC e FlAsHCand1, abbiamo determinato in primo luogo l'intensità di emissione di 70 nM Cul1AMC (il donatore) e 70 nM Cand1 FlAsH(il ricettore), rispettivamente (Figura 3A-C, blu linee). In ogni analisi, solo un picco di emissione era presente e l'emissione di Cand1 FlAsH(il ricettore) era basso. Quando 70 nM ogni di Cul1AMC e Cand1 FlAsHso.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
FRET è un fenomeno fisico che è di grande interesse per lo studio e la comprensione di sistemi biologici19. Qui, presentiamo un protocollo per il testing e usando FRET per studiare la cinetica di legame di due proteine interagenti. Quando si progetta FRET, abbiamo considerato tre fattori principali: la sovrapposizione spettrale tra donatore di emissione e accettore di eccitazione, la distanza tra i due fluorofori e l'orientamento del dipolo dei fluorofori28. Per scegliere i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) per penetranti discussione sullo sviluppo del dosaggio FRET. M.G., Y.Z. e X.L. sono stati finanziati dai fondi di avvio dalla Purdue University a Y.Z. e X.L.This lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di seme da Purdue University Center per biologia vegetale.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Colonna per cromatografia a scambio anionico | GE Healthcare | 17505301 | Colonna per cromatografia a scambio anionico HiTrap Q FF |
| Centrifuga refrigerata da banco | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Cloruro di calcio | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Scambio cationico colonna per cromatografia | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Colonna di desalinizzazione | GE Healthcare | 17085101 | |
| Centrifuga modello da pavimento (alta velocità) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Centrifuga modello da pavimento (bassa velocità) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Spettroscopio di fluorescenza Viewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| Fluorimetro FluoroMax | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | sintesi personalizzata | |
| Perline di glutatione | GE Healthcare | ||
| Glicerolo | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropil-beta;-D-tiogalattoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Brodo | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarosio | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumina | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vettore | GE Healthcare | 28954550 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Glutatione ridotto | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Agitatore refrigerato | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale | GE Healthcare | 28990944 | Colonna Superdex 200 10/300 GL |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Fluorimetro a flusso arrestato | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP· HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Trombina | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Membrana di ultrafiltrazione | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Unità filtranti centrifughe, Ultra-15, 30.000 NMWL |
Riferimenti
- Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
- Kuzmanov, U., Emili, A. Prot....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
