Un flusso di lavoro semplice migrazione/invasione utilizzando un Imager di vivere-cella automatizzata

Summary

L'attuale protocollo descrive un metodo integrato, indagando la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione su un'unica piattaforma in tempo reale, fornendo un'opzione facilmente riproducibile e tempo efficiente per studiare la morfologia e la mobilità delle cellule.

Abstract

Mobilità delle cellule di cancro è fondamentale per l'avvio della metastasi. Di conseguenza, indagine del movimento cellulare e capacità invasiva è di grande importanza. Saggi di migrazione forniscono conoscenza base del movimento cellulare a un livello 2D, considerando che le analisi di invasione sono più fisiologicamente rilevanti, che imita il dislodgment delle cellule tumorali in vivo dal sito originale e invadendo attraverso la matrice extracellulare. Il protocollo attuale prevede un unico flusso di lavoro per saggi di migrazione e invasione. Insieme con la fotocamera integrata di microscopica automatizzata per immagini HD in tempo reale e modulo built-in analisi, dà i ricercatori un tempo-efficiente, semplice e riproducibile opzione sperimentale. Questo protocollo comprende anche le sostituzioni per i materiali di consumo e metodi di analisi alternativa per gli utenti da scegliere.

Introduction

Invasione e migrazione cellulare sono importanti processi biologici che permettono le funzioni normali del corpo umano, come la chiusura della ferita, invasione di placenta in utero e della ghiandola mammaria morfogenesi^1,2,3. Il corpo umano ha un controllo preciso e rigoroso di questi eventi biologici; Tuttavia, ci sono alcune eccezioni. I tumori maligni, ad esempio, sono in grado di sfuggire questa salvaguardia, esporre la proliferazione anormale e invadere nel tessuto limitrofo, che è chiamato metastasi. La metastasi è la causa principale della mortalità legata al cancro⁴.

Cancro al seno è il più comunemente diagnosticato cancro nelle donne ed è la seconda più alta causa di morte per cancro tra le donne in paesi sviluppati in tutto il mondo⁵. Cancro al seno è originario di condotti o lobuli costituiti da uno o più strati di cellule epiteliali. Nella mammella normale, cellule epiteliali aderiscano uno a altro e alla membrana basale attraverso proteine di membrana come E-caderina e integrine⁶. Tuttavia, cellule di carcinoma mammario invasivo hanno perso la loro polarità e adesione cellula-cellula e classicamente subiscono epiteliali transizione mesenchimale (EMT) e acquisiscono la capacità di muoversi. Dopo lo stravaso, queste cellule possono attraversare la matrice extracellulare (ECM) e immettere il vaso sanguigno o il sistema linfatico, seguita poi da intravasation e crescita metastatica⁷. La comprensione dei meccanismi con cui questo si verifica è di grande importanza, dal momento che è la causa più comune di mortalità legata al cancro ed è strettamente legata al cancro metastasi delle cellule migrazione/invasione. Per visualizzare il movimento delle cellule tumorali, saggi di migrazione e invasione sono modelli ideali per studiare il movimento delle cellule 2D e 3D, rispettivamente. Migrazione valuta direttamente il movimento delle cellule, mentre l'invasione comporta l'interazione con il microambiente e la capacità di degradare le barriere biologiche. I due processi non sono completamente indipendenti uno da altro, come la migrazione è un requisito dell'invasione.

Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare la migrazione e l'invasione. Come Recensito da Kramer et al., saggi di migrazione come la guarigione delle ferite, recinzione e saggi di micro-elemento portante generano una zona senza cellula per consentire alle cellule di muoversi in, valutare il cambiamento di zona; considerando che, in saggi di transwell e capillare sono basati sul numero di cellule che si muovono verso un attractant⁸. Per le analisi di invasione, un ambiente di ECM ha da istituire con ECM gel o collagene per esempio, e movimento 3D può essere valutata controllando i conteggi di zona, la distanza e la cella del invasione (ad es. analisi di transwell, analisi della platypus)⁸. Un altro tipo di analisi di invasione è di combinare le cellule invasive con cellule non-invasivo e valutare il comportamento delle cellule invasive (ad es. sferoide saggi). I metodi di cui sopra hanno il loro pro e contro e un modo di facile approccio, facile da ripetere e di combinare l'analisi di migrazione e invasione assay in un flusso di lavoro simile è preferenziale nel disegno sperimentale.

Questo protocollo descrive la misura della migrazione cellulare e invasione usando un imager di cellule vive. È un cellulare in tempo reale monitoraggio sistema installato in un'incubatrice di coltura cellulare standard. Prende immagini ad alta definizione secondo il set di intervalli e misurazioni di scansione applicando maschere appropriate per le celle o gli obiettivi fluorescenti. Il modulo di analisi di migrazione/invasione include l'utilizzo di uno strumento di gratta e Vinci 96-pin, che è adatto a fare ferite omogenee gratta e Vinci su un monostrato di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Il meccanismo si basa sulla ferita in vitro guarigione dosaggi, monitoraggio movimento 2D cellulare su una plastica o rivestimento. Può essere valutato anche invasione o movimento 3D attraverso un ulteriore ECM entro il graffio della ferita. Un breve flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1.

Protocol

Nota: Due linee cellulari devono essere maneggiate separatamente. Le procedure seguenti dovrebbero essere applicate a una singola cella linea se non specificate.

1. ottimizzare la densità delle cellule prima del ferimento

1. Coltura di cellule aderenti in beute di coltura del tessuto di T75 cm² a circa l'80% confluenza in di rosso fenolo libero Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 200 mM L-Glutammina e 2 µ g/mL insulina a 37 ° C con 5% CO₂ ( condizioni di incubazione standard per la maggior parte delle linee cellulari di cancro, formulazioni di cultura sono cella linea-dipendente).
2. Rimuovere il supporto di cultura pipettando fuori un contenitore per rifiuti. Pipettare 2 mL di pre-riscaldato 0,1% tripsina-EDTA a risciacquare brevemente il monostrato cellulare e dispensare. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,1% e mettere il pallone in condizioni standard di incubazione a 37 ° C per 5 min.
3. Picchiettare delicatamente la boccetta per garantire il distacco delle cellule e quindi aggiungere 10 mL di terreno di coltura pre-riscaldato per arrestare la reazione proteolitica.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA). Attentamente rimuovere il supernatante senza agitazione del pellet e risospendere con un altro 10 mL di coltura pre-riscaldato.

2. contare il numero di cellulare utilizzando un contatore di cellule automatizzato (o un qualsiasi metodo di conteggio)

1. Diluire 200 µ l di sospensione cellulare sedimento con 800 µ l di 1 x fosfato di Dulbecco tampone salino (DPBS) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
2. Collegare un sensore di conteggio delle cellule di 60 µm per il contatore di cella, tenere premuto il toggle e unire la punta in una sospensione cellulare. Rilasciare lentamente la leva fino a quando la sospensione cellulare viene disegnata correttamente nel sensore. Concentrazione cellulare viene visualizzata in cellule/mL.
3. Calcolare il numero di cellule in sospensione delle cellule di 10 mL.

3. cellula placcatura

1. Cellule di piastra a una gamma di densità delle cellule (40.000-90.000 cellule/pozzetto) in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti.
2. Inserire la piastra l'imager di cellule vive e pianificare l'analisi ogni 2 h per 24 h.
   1. Nel software, fare clic su pianificazione scansioni dall'elenco attività. Nel riquadro Configurazione di cassetto, determinare la posizione della piastra, fare clic su Aggiungi nave e scegliere il tipo di piatto. Nel riquadro Configurazione di scansione , scegliere o modificare il modello di scansione secondo il programma di installazione di piastra sperimentale e impostare Tipo di scansione come Standard.
   2. Fare clic con il pulsante destro sulla Timeline e selezionare Impostare intervalli. Impostare Scansioni aggiungere ogni 2 h a una pianificazione di 24 h. Fare clic su applica.

4. determinare la cella ottima densità di semina per il dosaggio di migrazione

1. Stop scansione dopo 24 h, si applicano alla confluenza elaborazione analysis tool per le immagini di contrasto HD-fase raccolte automaticamente e generare una curva di proliferazione delle cellule contro il tempo.
   1. Determinare immagini rappresentative di 3-6 e metterli in una nuova Raccolta di immagini.
   2. Determinare una maschera adeguata come Definizione di elaborazione.
   3. Avviare un processo di analisi.
   4. Determinare la densità delle cellule ottimizzato secondo confluenza contro il tempo (circa il 100% confluenza entro 6-18 h a seconda di quando inizia il test di migrazione).
      Nota: Quanto tempo che ci vuole per crescere le cellule a confluenza varia a seconda della diluizione di semina.

5. i giorni 1 e 2: preparazione per la migrazione e invasione saggi

1. Il giorno 1, rivestire la piastra per analisi di invasione.
   Nota: gel di ECM devono essere trattati su ghiaccio e con le punte che sono stati collocati in frigorifero durante la notte.
   1. Diluire il gel ECM con terreni di coltura ghiacciato a 100 µ g/mL e aggiungere 50 µ l di diluito ECM gel/media nei pozzetti designati.
   2. Posizionare la piastra alle condizioni standard di incubazione durante la notte.
2. Il giorno 2, aspirare delicatamente il terreno in eccesso. Piatto di cellule con densità ottimizzata delle cellule in 2 piastre da 96 pozzetti destinate per il dosaggio di migrazione (non rivestito) e l'analisi di invasione (rivestito) in triplici copie seguendo le sezioni 1-3 nel tardo pomeriggio (nel protocollo corrente, densità di semina ottimizzato per ZR75-1 e MDA-MB-231 erano 90.000/pozzetto e 50.000/pozzetto, rispettivamente).
3. Posto piastre alle condizioni standard di incubazione durante la notte.

6. giorno 3: Ferita zero

1. Spruzzare e pulire lo strumento gratta e Vinci e 2 barche con etanolo al 70% di lavaggio prima di metterli nella biosicurezza armadietto. Riempire la barca di lavaggio 1 e 2 con esattamente 45 mL di acqua distillata, acqua e 70%, etanolo, sterile (in autoclave), rispettivamente.
2. Per la sterilizzazione, posizionare il blocco pin strumento gratta e Vinci (in alto) il lavaggio barca 1 e 2 per 5 minuti ciascuno.
3. Iniziare con la piastra di test di migrazione.
   1. Spostare la piastra che contiene cellule dall'incubatrice e assicurarsi che nessun pozzo è asciutto per non danneggiare lo strumento gratta e Vinci. Rimuovere il coperchio e inserire nel porta-piastra di base dello strumento gratta e Vinci e posizionare con cura la parte superiore sulla parte di base guidando tasselli. Premere e tenere premuto la leva nera e nel frattempo sollevare con cautela il blocco pin. Lacune in ciascun pozzetto sono di solito visibili ad occhio nudo e sotto il microscopio.
   2. Immergere rapidamente i perni in acqua; Questo è sufficiente per pulire lo strumento gratta e Vinci prima di graffiare la piastra di dosaggio di invasione se la piastra è identico. In caso contrario, ripetere i passaggi di sterilizzazione con acqua distillata sterile e poi con etanolo al 70% per 5 minuti ciascuno.
4. Lavare i tempi piatto 1 o 2 con mezzi di coltura pre-riscaldato per evitare indipendente celle o cella fogli riattaccare al pozzo.
5. Aggiungere 100 µ l di fresco caldo media nei pozzetti designati con o senza trattamenti.
6. Passaggi aggiuntivi per analisi di invasione.
   1. Posizionare la piastra di dosaggio di invasione a 4 ° C per 5 min equilibrare e aspirare accuratamente i media freddi.
   2. Diluire il gel ECM con terreni di coltura ghiacciato a 5 mg/mL, aggiungere 50 µ l di gel di ECM diluiti nei pozzetti designati e posto sotto standard incubazione per 30 min.
   3. Aggiungere 100 µ l di media riscaldato-up con o senza prove composti.
7. Posizionare la piastra in cellule vive imager e lasciarlo equilibrare per 5 min. Scegli Tipo di imbarcazione come piastra di imagelock. Impostare Tipo di scansione come Scratch ferita, scegliere o modificare Pattern di scansione secondo il programma di installazione di piastra sperimentale (1 immagine/pozzetto e modalità wide) e pianificare il 24-h ripetere analisi ogni 1-2 h per 72 h fino a quando le ferite sono guarite.
8. Per pulire lo strumento gratta e Vinci, mettere il blocco perno superiore in ciascuna delle seguenti soluzioni (45 mL in barche di lavaggio) per 5 min: 0,5% detergente 1 (Vedi Tabella materiali), 1% detergente 2 (Vedi Tabella materiali), sterile distillata acqua e 70% di etanolo. Posizionare l'utensile graffio indietro sulla sua piastra di base e archivio in un ambiente privo di polvere.

7. analisi dei dati

1. Interrompere la scansione la piastra designata dopo tutte le ferite sono guarite scegliendo la piastra sperimentale sul Cassetto installazione e facendo clic su Rimuovere la nave.
2. Raccogliere immagini rappresentative di 3-6 si estende in un intervallo di percentuali audio, tra cui immagini direttamente dopo che è stato fatto la ferita, chiusura della ferita del 10% e 50%.
3. Per determinare una definizione corretta elaborazione, utilizzare Segmentazione regolazione, pulizia e filtri per applicare appropriato Scratch ferita maschera e Maschera di confluenza. Utilizzare l'Anteprima di corrente/tutti per visualizzare la precisione delle maschere.
4. Avviare il processo di analisi.
5. Dati possono essere analizzati all'interno del software o esportati per ulteriori analisi. Tre metriche fornite dal software possono essere utilizzati per valutare le immagini HD-fase: ferita confluenza di larghezza (µm), ferita (%) e la densità relativa ferita (%). I confronti saranno discussi nella sezione seguente.

Results

Questa analisi di migrazione/invasione è basata su analisi guarigione della ferita, che valuta il tasso delle cellule in movimento in un'area senza cellula creata dallo strumento scratch 96-pin. La differenza tra i saggi di migrazione e invasione sono che la migrazione dosaggi celle di misura lo spostamento su coltura di tessuti trattata plastica superficie invasione misure delle cellule e del movimento attraverso gel di ECM.

Lo...

Discussion

Migrazione e invasione sono parametri importanti per valutare la mobilità delle cellule tumorali. Utilizzando lo strumento di gratta e Vinci di 96-pin, è possibile condurre la cicatrizzazione in saggi in 2D e 3D simultaneamente. Oltre a facilitare la scansione automatica, fornendo un ambiente di cultura cellulare stabile con il minimo disturbo, il dosaggio di gratta e Vinci condotto utilizzando il tool di gratta e Vinci di 96-pin fornisce costanti ferite gratta e Vinci, consentendo esperimenti che sono più robusti e ripr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,5% (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Diluire a 2x in DPBS
Countess II FL Contatore di celle automatizzato	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Contatore di cellule automatizzato
Detergente 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0,5% di concentrazione di lavoro
Detergente 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% di lavoro concentrazione
Dulbecco' s Eagle Medium modificato, senza rosso fenolo	ThermoFisher Scientific	21063-045	Fornito con il 10% di FBS, 200 mM di L-glutammina, 2 μ g/ml di insulina
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo
Essen ImageLock Piastra a 96 pozzetti, fondo piatto	Essen	4379
EVE Vetrini di conteggio	BioTools	EVS-50
Siero fetale bovino (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessori	Essen	4444	Incluso CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Kit di migrazione cellulare	Essen	4493	Compreso il blocco pin a 96 pozzetti, 2x barche di lavaggio e il software
IncuCyte ZOOM	Essen		Sistema di analisi delle cellule vive
Soluzione di insulina umana	Sigma-Aldrich	19278-5ML
Soluzione di L-glutammina (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Pallone per coltura tissutale, 75 cm2 area di crescita	Greiner Bio-One	658175