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Articolo metodologico

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

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DOI:

10.3791/59043

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16 aprile 2019

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1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

In questo articolo

Sommario

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Abstract

Accumulazione del tessuto delle cellule immuni altamente attivate in modo schiacciante rappresenta un segno distintivo di varie malattie infiammatorie croniche ed emerso come un obiettivo terapeutico attraente nella gestione clinica dei pazienti affetti. Al fine di ottimizzare ulteriormente le strategie finalizzate a regolamento terapeutico di infiltrazione del tessuto patologico squilibrata delle cellule immuni pro-infiammatorie, sarà di particolare importanza per il raggiungimento di migliori intuizioni in malattia organo-specifiche e Proprietà Homing dei linfociti periferici. Il protocollo sperimentale descritto qui permette di polmone accumulo di linfociti umani fluorescente contrassegnati e passivamente trasferiti nel contesto di infiammazione polmonare indotta da papaina. In contrasto con l'analisi in vitro standard si è frequentemente utilizzata per l'analisi di chemiotassi e migrazione delle cellule immuni, l'impostazione ora introdotto in vivo tiene conto di aspetti specifici del polmone dell'organizzazione del tessuto e l'influenza del complesso infiammatorio scenario che si svolgono nell'organismo vivente murino. Inoltre, imaging microscopica tridimensionale a sezione trasversale luce-foglio fluorescenza non fornisce solo dati quantitativi su infiltrazione di cellule immuni, ma raffigura anche il modello di localizzazione delle cellule immuni all'interno del polmone infiammato. Nel complesso, siamo in grado di introdurre una tecnica innovativa di alto valore per le ricerche immunologiche nel campo delle malattie polmonari croniche infiammatorie, che può essere facilmente applicato seguendo il protocollo fornito dettagliato.

Introduzione

Classici disordini infiammatori del polmone, come l'asma allergica e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono ben noti per essere guidato da un aumentato reclutamento di linfociti attivati nel tessuto polmonare1,2. Linfocita-rilasciato citochine (ad es., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promuovere ulteriormente la chemiotassi di cellule immuni innate ed adattabili, indurre fibrotica vie respiratorie che ritoccano o direttamente danneggiare il parenchima polmonare2. Finora, i meccanismi di fondo responsabili dell'accumulo patologico dei linfociti all'interno del tessuto polmonare ancora completamente non sono capiti. In analogia al tessuto-selettivo delle cellule di T imprinting descritto per homing intestinale e della pelle, polmonare cellule dendritiche (DCs) sono ovviamente in grado di prime cellule di T periferiche per infiltrazione polmonare preferenziale, almeno in parte tramite l'induzione dell'espressione di CCR4 sul superficie di linfociti3. Oltre CCR4, delle vie respiratorie-infiltrazione di cellule T sono anche caratterizzate da una particolare aumentata espressione dei recettori chemochinici CCR5 e CXCR3 rispetto alle cellule di T all'interno il sangue periferico1,4,5. Nel complesso, esistenti dati sono coerenti con il concetto che polmone homing dei linfociti T in condizioni fisiologiche o infiammatorie coinvolge un numero di recettori per le chemochine diversi e loro rispettivi ligandi e così fondamentalmente dipende un strettamente controllata la collaborazione tra le cellule immuni innate ed adattabili1. Soprattutto, durante la fase iniziale dell'esposizione dell'agente patogeno o allergene, cellule del sistema immunitario innato rispondono alla stimolazione dei TLR o di IgE-mediata reticolazione dell'immediato rilascio di chemioattrattanti differenti, come LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD21,6,7. Come un primo esempio, l'interazione tra PGD2 e il recettore chemoattractant CRTh2 è noto per essere di particolare importanza per chemiotassi di cellule Th2 e così è comparso come promettente bersaglio terapeutico nell'amministrazione clinica di asma. Infatti, i pazienti con asma moderata hanno mostrato un miglioramento dei sintomi e un aumento significativo del volume espiratorio forzato in un secondo (FEV1) dopo il trattamento con un antagonista selettivo CRTh2 rispetto al gruppo placebo8 ,9. In uno stato più progredito della risposta infiammatoria, già reclutato le cellule T sono in grado di amplificare ulteriormente accumulazione polmonare del linfocita tramite il rilascio di IL-4 e IL-13 come potenti stimoli per DCs polmonare. Successivamente, queste cellule innate mieloide-derivato in su-regolano l'espressione di CCL17 e CCL22 in un STAT6-dipendente modo1,10,11.  Anche se la complessità dello scenario descritto ancora ostacola una comprensione completa del polmone delle cellule T homing, offre una pletora di bersagli molecolari per un controllo terapeutico potenzialmente ottimizzato delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di tecniche sperimentali innovative, che sono in grado di approfondire e integrare la nostra conoscenza nel campo della cellula T chemiotassi e polmone homing ulteriormente.

Dovuto al fatto che homing polmonare dei linfociti all'interno del corpo umano è influenzata da molteplici parametri cellulari, umorale e fisica1, la maggior parte dei metodi sperimentali esistenti non sono in grado di modellare tutta la complessità di questo processo immunologico. Invece, molti protocolli standard per l'analisi del polmone homing selettivamente concentrano su un aspetto specifico coinvolto nella cascata di attrazione del linfocita, adesione, migrazione e ritenzione. Oltre ad una determinazione puramente descrittiva del pattern di espressione di mRNA o proteina delle integrine e chemochine recettori sui linfociti periferici o polmone-infiltrazione e la misura complementare di chemokine rispettivi livelli nel sangue, il lavaggio broncoalveolare (BAL) o tessuto polmonare12,13,14,15, saggi di cultura consolidata in vitro delle cellule consentono una caratterizzazione funzionale di adesione dei linfociti o chemiotassi al momento definito condizioni sperimentali16,17,18. In linea di principio, saggi di adesione statica in vitro monitorare la capacità legante di linfociti coltivati per un monostrato endoteliale o diapositive di vetro rivestiti con molecole di adesione endoteliali ricombinante (ad es., MAdCAM-1, VCAM-1), mentre in vitro standard chemiotassi sono solitamente applicati al fine di quantificare la capacità dei linfociti di migrano lungo un gradiente di chemokine in un sistema di transwell19. Entrambe le impostazioni in vitro permettono una regolazione controllata e la modulazione delle condizioni sperimentali, ma d'altra parte mancano importanti variabili note criticamente l'impatto sulla chemiotassi in vivo e l'adesione dei linfociti. Principalmente, saggi di cultura statica cellulare ignorare l'influenza delle forze di taglio causate dal flusso di sangue permanente19 e potenzialmente trascurano il coinvolgimento del milieu immunologica circostante e interagenti non-linfocita cellule immunitarie, entrambi presenti in un organismo vivente. Per superare queste limitazioni, l'interpretazione dei risultati acquisiti nelle analisi in vitro statiche di chemiotassi o aderenza bisogno ulteriore convalida negli esperimenti di adesione dinamico sotto flusso condizioni20,21 e in vivo modelli di infiammatorio organo patologia19. Infatti, importanti studi sugli animali potrebbero trarre conclusioni sulla regolamentazione del polmone delle cellule T homing in condizioni infiammatorie o allergiche analizzare geneticamente topi modificati in modelli definiti di diverse malattie polmonari3, 22 , 23. il confronto quantitativo del polmone infiltrazione di linfociti tra topi selvatici e topi con un deficit per un gene specifico di interesse rappresenta uno strumento ben consolidato e largamente usato per definire l'impatto del cellulare particolare percorsi o recettori sul modello di malattia basato di distribuzione delle cellule T. Tuttavia, contrariamente a prima discusso saggi di cultura in vitro delle cellule, un disegno di studio basato su modelli animali classici manca la capacità di analizzare e monitorare le cellule T umane primarie direttamente derivate dal sangue o BAL di pazienti affetti da un infiammatorio del polmone malattia. Così, rimane ancora impegnativo per convalidare funzionalmente se una malattia polmonare diagnosticamente specificato è in grado di imprimere i linfociti umani per tropismo preferenziale del polmone e fino a che punto i parametri clinici potrebbero avere un impatto su questo scenario. Recentemente, un approccio molto elegante in vivo è stato introdotto nel contesto delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), che era in grado di superare la maggior parte di queste limitazioni e aperto nuove strade per studi avanzati traslazionali su linfociti intestinali homing24 . Approfittando dei protocolli per schiarimento del tessuto solvente seguita da microscopia di fluorescenza di luce-foglio trasversale come un potente strumento di imaging, è stato possibile visualizzare l'infiltrazione e la distribuzione delle cellule T umane passivamente trasferite nell'intestino dei topi immunodeficienti colitic24. In particolare, questa impostazione sperimentale implementato due innovazioni principali: (1) cellule immuni umane primarie possono essere analizzati in condizioni in vivo sperimentalmente definite; (2) una zona piuttosto grande di organo malato (circa 1,5 x 1,5 cm) può essere imaged in qualità ad alta risoluzione, seguita da ricostruzione 3D. Inoltre, parecchi studi recenti stabilito con successo l'uso del tessuto a base di solvente di compensazione e microscopia a fluorescenza di luce-foglio come strumenti importanti per polmonare avanzato imaging25,26. Al fine di beneficiare di questo progresso tecnologico nel campo dell'immunologia polmonare, abbiamo ora adottato il sistema per analisi di homing polmonare.

Il protocollo qui presentato fornisce un'introduzione passo passo come purificare e fluorescente etichetta primaria umana T cellule per trasferimento in topi con infiammazione polmonare indotta e, inoltre, descrive in dettaglio il processo successivo di luce-foglio imaging al microscopio di fluorescenza, tra cui organo preparazione ed elaborazione di immagini. Nel complesso, ci auguriamo sostenere gli studi traslazionali futuri nel campo delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche introducendo un sofisticato, ma modello tuttavia fattibile, sperimentale per il monitoraggio di homing polmonare del linfocita umano su condizioni in vivo.

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Protocollo

Esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalle autorità locali competenti a Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). Topi sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche. La raccolta di sangue umano è stata approvata dal comitato etico locale e il Comitato di revisione istituzionale dell'Università di Erlangen-Norimberga. Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto.

1. indurre infiammazione allergica polmonare in topi

Nota: Come descritto in precedenti studi27, la seguente procedura sperimentale permette che inducono l'infiammazione allergica della via aerea in topi e, di conseguenza, innesca l'accumulo delle cellule immuni innate ed adattabili nel BAL. Il protocollo descritto è stato stabilito nei topi C57BL/6J, ma l'adozione di altri ceppi inbred standard dovrebbe essere possibile.

Vedere la Figura 1A per un riepilogo delle procedure sperimentali in vivo.

  1. Anestetizzare topi tramite l'iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina.
    Nota:     utilizzare solo più di 6 settimane e con un peso corporeo di almeno 16 g i topi C57BL/6J.
    1. Preparare la soluzione di chetamina/xilazina in PBS (12 mg/mL ketamina; xilazina 1,6 mg/mL) e determinare il peso esatto dei topi.
    2. Iniettare il primo mouse con 8 µ l/kg di peso corporeo di chetamina/xilazina soluzione intraperitonealmente e confermare l'anestesia profonda tramite l'assenza del riflesso del pizzico di zampa prima di procedere al punto 1.3.
  2. Appena preparare 5 mg/mL di papaina in PBS. Pipettare lentamente 10 µ l (50 µ g) della soluzione papaina nella narice. Monitorare attentamente il mouse fino al risveglio.
  3. Ripetere i passaggi da 1.1 e 1.2 per tutti i mouse inclusi nell'esperimento. Eseguire passaggi 1.1 – 1.3 in tre giorni consecutivi.

2. purificare ed etichettare fluorescente CD4 di sangue periferico umano+ le cellule di T

Nota: Processo delle cellule in condizioni sterili.

  1. Raccogliere 18 mL di sangue intero umano da una vena periferica. Eseguire centrifugazione in gradiente di Ficoll-Hypaque al fine di selezionare la frazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC).
    Nota: Raccolta e analisi di materiale umano primario devono essere approvati dalle autorità locali etica. Solo una persona con un'adeguata qualificazione medica è consentita prelevare il sangue da una vena periferica.
    1. Raccogliere il sangue in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-che contiene monovettes (1,6 mg di EDTA/mL di sangue) al fine di evitare la coagulazione.
      Opzionale: Utilizzare il sangue di buffy-coat, un sottoprodotto della donazione di sangue arricchito nei leucociti, invece di sangue venoso completa.
    2. Trasferimento di sangue in una provetta conica 50 mL e diluire 1:2 in tampone fosfato salino (PBS). Con attenzione aggiungere 10 mL di Ficoll-medio (densità 1,077 g/mL) come uno strato di fondo sotto il sangue diluito. Centrifugare il campione (800 x g per 15 min a temperatura ambiente senza freno).
    3. Con attenzione rimuovere il tubo da centrifuga e trasferire l'interfase di PBMC-contenenti in una nuova provetta conica 50 mL. Scartare il superiore e inferiore. Riempire la provetta contenente PBMC con PBS e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Eliminare il surnatante.
      Nota: Facoltativamente, se necessario, eseguire la lisi degli eritrociti rimanenti. Il pellet cellulare sedimento e vortexare il campione attentamente aggiungere 3 mL di tampone di lisi (ACP) ammonio-cloruro-potassio (cloruro di ammonio 155mm; 19mm potassio idrogeno carbonato e 0.68 mM EDTA pH 7,27). Agitare le provette per 3 min. Per rimuovere il tampone di lisi ACP, aggiungere 40 mL di PBS e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Gettare il surnatante.
  2. Purificare il CD4+ T cellule via CD4 microsfere.
    Nota: In generale, ci sono diversi distributori di microperle magnetiche per purificazione di CD4 umana+ cellule, che dovrebbero provocare livelli comparabili di purezza delle cellule. Scelta del prodotto dovrebbe essere basata su preferenze individuali. I seguenti passaggi del protocollo (2.2.2–2.2.7) sono regolati per un prodotto di Microperlina CD4 definiti e colonne di separazione rispettivi ulteriormente indicato nella Tabella materiali. Alcune modifiche del protocollo possono essere richieste nel caso che un prodotto alternativo di Microperlina CD4 è selezionato.
    1. Risospendere il pellet PBMC in un minimo di 80 µ l di PBS contenente 0.5% siero bovino fetale (FBS) e 2 mM EDTA (FBS/EDTA-tampone, PBS) ogni 107 PBMC. Uso una popolazione di partenza di circa 30 x 106 PBMC per finire con circa 3 x 106 a 6 x 106 purificato umano CD4+ T cellule.
    2. Aggiungere 20 µ l di microsfere di CD4 ogni 107 PBMC, mescolare delicatamente e incubare per 20 min a 4 ° C. Riempire il tubo con PBS/FB/EDTA-buffer (raffreddato fino a 4 ° C) e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Rimuovere il surnatante.
    3. Inserire una colonna di separazione in un campo magnetico. Lavare la colonna con 3 mL di PBS/FB /-soluzione tampone dell'EDTA. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di PBS/FB /-soluzione tampone dell'EDTA (raffreddato fino a 4 ° C) e trasferire la sospensione cellulare sulla colonna risciacquata separazione collocata all'interno di un campo magnetico.
    4. Lavare la colonna di separazione tre volte con 3 mL di PBS/FB /-soluzione tampone dell'EDTA (raffreddato fino a 4 ° C) e scartare l'effluente.
    5. Rimuovere la colonna di separazione dal campo magnetico e metterlo in una provetta da 15 mL. Eluire il CD4+ frazione di cellule in 5 mL di PBS/FB/EDTA-buffer utilizzando lo stantuffo.
    6. Riempire il tubo con PBS e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
    7. Determinare il numero delle cellule ha prodotto con un metodo standard di scelta (ad es., camera di Neubauer).
  3. Etichetta CD4+ T cellule con una tintura di proliferazione delle cellule fluorescenti.
    1. Risospendere CD4+ T cells in PBS (fino a 107 cellule/mL; non utilizzare meno di 500 µ l di PBS).
    2. Preparare una soluzione di 6 µM di una proliferazione delle cellule eccitabili luce rossa colorante (Vedi Tabella materiali) in PBS (pre-riscaldato a temperatura ambiente). Mescolare questa soluzione 1:2 con la prima preparato accuratamente sospensione cellulare e vortice (concentrazione finale di 3 µM).
    3. Incubare per 10 min a 37 ° C (protetto dalla luce). In seguito, aggiungere cinque volumi di mezzo RPMI contenente 10% FBS e incubare per 5 minuti sul ghiaccio (riparo dalla luce).
    4. Lavare con etichetta cellule tre volte in RPMI medium contenente 10% FBS (Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C). Risospendere le cellule con etichettate in PBS, memorizzare sul ghiaccio e proteggere dalla luce fino all'utilizzo.
      Nota: Prolungata conservazione delle cellule (> 60 min) potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle cellule.
      Opzionale: Determinare la purezza del CD4+ frazione e l'efficacia della procedura d'etichettatura delle cellule tramite flusso cytometry. Risospendere 0,5 x 106 a 1 x 106 CD4+ cellule in 100 µ l di tampone (1% FBS, 2 mM EDTA in PBS) e aggiungere un anticorpo anti-umane CD4 accoppiato con un colorante fluorescente di scelta. Incubare per 30 min a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di tampone e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Gettare il surnatante. Procedere con la misurazione di cytometric di flusso del campione (rappresentativo risultato è raffigurato in Figura 1B, C).

3. passivamente trasferimento umano CD4+ T Cells in papaina-esposti destinatario Mmice

Nota: Vedere la Figura 1A per un riepilogo di in vivo eseguito Procedura sperimentale. Eseguire trasferimento di cellule un giorno dopo l'ultima somministrazione intranasale di papaina.

  1. Regolare le sospensioni di fluorescente contrassegnati CD4 umana+ T cellule (passo 2.3.4) ad una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL in PBS. Riempire 100 µ l di sospensione cellulare in un 1 mL/30 G-siringa.
  2. Posizionare con attenzione il primo mouse C57BL/6J papaina-esposti (punti 1.1-1.3) in un dispositivo di ritenuta per iniezione della vena della coda. Utilizzare la siringa preparata (punto 3.1) per forare la vena caudale e iniettare lentamente 100 µ l di sospensione cellulare contenente 1 x 106 etichettato CD4 umana+ cellule. Non estrarre immediatamente l'ago dopo l'iniezione, ma attendere altri 5 secondi al fine di impedire lo scarico della sospensione delle cellule.
  3. Rilasciare il mouse dal dispositivo di ritenuta e procedere con il prossimo animale. Mantenere almeno un animale papaina-esposti, che non subisce trasferimento con cellule fluorescente contrassegnate per servire come controllo negativo per microscopia di fluorescenza di luce-foglio.

4. preparare il tessuto polmonare per microscopia di fluorescenza di luce-foglio

Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite 3 h dopo trasferimento di fluorescente etichettati cellule umane (punto 3.2). Le procedure sperimentali descritte tra cui raccolta di tessuto polmonare, fissazione e tessuto a base di solvente di compensazione sono stati adattati da protocolli attualmente descritti24,28.

  1. Sacrificare il mouse per inalazione di anidride carbonica (C02).
  2. Irrorare il polmone in situ con PBS contenente 5mm EDTA.
    1. Aprire il torace tramite taglio lungo lo sterno per esporre il cuore. Punctate ventricolo di destra con una cannula di 21 G collegato ad un catetere.
    2. Aprire il ventricolo sinistro dal taglio e quindi consentire il sangue e l'aspersione fluido uscire. Irrorare lentamente il polmone con 20 mL di PBS ghiacciata contenente 5mm EDTA tramite catetere.
  3. Al fine di eseguire in loco fissazione del polmone, non rimuovere il catetere dal ventricolo destro. Irrorare lentamente il polmone con 2 mL di gelida paraformaldeide al 4% (PFA) risolto in PBS. Rimuovere il catetere e la cannula.
    Nota: PFA-basato in situ fissazione del tessuto polmonare rappresenta una consolidata tecnica al fine di preparare il tessuto polmonare murino per successive analisi microscopiche29,30.
    Attenzione: PFA è tossico e deve essere gestito sotto una cappa con cura.
  4. Riempire il polmone con 0,75% agarosio in situ.
    1. Preparare dell'agarosi 0,75% in PBS e mantenerlo solido a 50 ° C in un termo-agitatore fino all'utilizzo. Rimuovere le ghiandole salivari del mouse, tagliare il muscolo sternohyoid ed esporre la trachea facendo scorrere un forcipe sotto.
    2. Punteggiano la trachea esposta con un ago 30g e sostituirlo con un catetere di 30g smussato per prevenire ulteriori danni della trachea con conseguente perdite indesiderate di agarosio. Sigillare la giunzione tra il catetere inserito e la trachea utilizzando un porta-aghi.
      Opzionale: Combinare il qui descritto procedura con collezione di BAL per analizzare le cellule umane infiltrate in BAL come recentemente descritto in dettaglio31 (Vedi Figura 2,E per risultati rappresentativi).
    3. Riempire attentamente le vie aeree con 0,75% agarosio (raffreddato alla temperatura corporea) tramite il catetere fino al completo dispiegamento del polmone; attendere fino a solidificazione completa di agarosio. Rimuovere il catetere e accuratamente raccolto polmone in una provetta da 2 mL buia riempito con 4% PFA.
  5. Per ulteriore fissaggio Incubare il campione in 4% PFA risolto in PBS per 2 h a 4 ° C sotto rotazione continua (31 giri).
  6. Disidratare tessuto incubando successivamente campione in rotazione continua (31 giri) a 4 ° C in 50% di etanolo (pH 9), etanolo al 70% (pH 9) ed etanolo 100%; ogni passaggio per almeno 4 ore. Alla fine, è necessario eseguire una seconda incubazione in etanolo al 100% per 4 h.
  7. Eseguire solvente schiarimento del tessuto utilizzando etile cinnamato (ECi). Di conseguenza, è possibile trasferire il campione in ECi. Incubare per una notte a temperatura ambiente (in costante rotazione) fino a quando il tessuto appare traslucido (Vedi Figura 1D per immagini rappresentative).
    Nota: I campioni conservati in ECi a temperatura ambiente (riparo dalla luce) sono stabili sopra parecchie settimane ai mesi.

5. eseguire la microscopia di fluorescenza di luce-foglio dei lobi del polmone murino Wwhole

Nota: Il microscopio di fluorescenza di luce-foglio e il software corrispondente, su cui si basano i passaggi seguenti, vedere la Tabella materiali particolari. Sistemi analoghi di altri produttori, tuttavia, possono essere utilizzati anche con sviluppatore specifiche modifiche del protocollo seguente. Prima di iniziare, prendere confidenza con il manuale di istruzioni specifiche del microscopio e seguire le istruzioni tecniche dalla persona responsabile in loco.

  1. Impostare il microscopio di luce-foglio.
    1. Accendere il microscopio di luce-foglio e aprire il relativo imaging software sul computer. Riempire la camera del campione con ECi filtrata (filtro 100 µm) e collocarlo nella sua posizione tra i raggi laser.
    2. Utilizzare una piccola goccia di organico stabile al solvente colla per attaccare il polmone a supporto del campione. Per mantenere la profondità di penetrazione necessaria di luce-fogli più piccolo possibile, impostare il lobo del polmone in posizione verticale. Successivamente, inserire il supporto del campione nella sua camera.
    3. Impostare l'indice di rifrazione dell'obiettivo a 3.5 utilizzando ECi reagente di compensazione.
  2. Regolare le impostazioni al microscopio luce-foglio per rilevare cellule umane nel contesto dell'intero organo.
    1. Selezionare laser richiesto (filtro per misura > attivare le caselle di controllo dei laser richiesto) e scegliere intensità appropriata del software di controllo (trasmissione controllo laser > utilizzare il cursore per impostare intensità del laser > applicare). Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm (525/50 filtro) per rilevare il tessuto polmonare autofluorescent e 640 nm (680/30 filtro) per eccitare le cellule umane etichettate con un fluoroforo che emette nello spettro del rosso.
    2. Concentrarsi sul campione eccitato a 488 nm e adattare la messa a fuoco tramite lo strumento di 'correzione cromatica' la lunghezza d'onda di eccitazione di 640 nm (usare il cursore per impostare la correzione cromatica > applicare).
    3. Scegliere un fattore di zoom appropriato; Cenni preliminari su un ingrandimento basso (ad es., 6.3 x) per determinare la distribuzione complessiva delle cellule con etichettate all'interno del tessuto polmonare e immagini ingrandite (ad es., 32x) per la localizzazione dettagliata.
    4. Selezionare una larghezza di foglio delucidamento uniformemente l'intero organo o una sezione specifica di interesse (ottica > usare il cursore per impostare la larghezza del foglio; solitamente fra 20 – 40%). Definire l'apertura numerica (NA) di foglio con NA superiore creando immagini più nitide (ottica > utilizzare il dispositivo di scorrimento per impostare il foglio NA; per un lobo del polmone murino espanso alle dimensioni fisiologiche un NA di 0.025% può essere spesso utilizzato).
    5. Selezionare il numero di luce-fogli da utilizzare sotto 'impostazioni avanzate misura'. In caso di illuminazione bidirezionale, unire fogli di luce sinistra e destra per creare un'immagine omogeneamente illuminata (Avanzate > unire lightsheets > selezionare la modalità di fusione > cursori consentono di definire la sovrapposizione tra due fogli di luce).
      Nota: Si consiglia di sfruttare l'illuminazione bidirezionale del campione con tre luce-fogli ciascuno.
      Opzionale: Per aumentare ulteriormente la qualità dell'immagine, utilizzare l'operazione di messa a fuoco dinamica. Questo permette di spostare lo stato attivo nella direzione x durante l'acquisizione di immagini.
    6. Definire le posizioni di inizio e di fine dello z-stack per essere misurata e impostare la dimensione del passo a 5 µm (xyz-tabella Z > intervallo di scansione).
      Nota: Posizioni iniziale e finale di uno z-stack dipendono dalla dimensione e posizionamento del lobo del polmone all'interno del pozzetto. Tuttavia, circa 300-800 z-stack sono solitamente acquisito per un lobo del polmone singolo (dimensione del passaggio di 5 µm).
    7. Salvare i file utilizzando "impostazioni di salvataggio automatico" e avviare la misurazione per catturare immagini. Dopo la rifinitura di acquisizione dati, pulire il portacampioni ECi-contaminato e vaschetta sotto l'acqua corrente.
      Nota: Utilizzare le stesse impostazioni all'immagine diversi lobi del polmone che si suppone possano essere confrontati in seguito.

6. post-elaborazione di immagini e quantificazione delle cellule umane del polmone-accumulata

Nota: Per dettagli sul post-formazione immagine software per l'analisi 3D, su cui si basano i passaggi seguenti, vedere Tabella materiali . Tuttavia, alternativa post-imaging software può essere utilizzato come bene.

  1. Caricare la prima immagine di uno z-stack (attivare il pulsante di superare, il file > Apri > Seleziona immagine) al fine di avviare l'apertura di tutte le altre immagini dello z-stack selezionate e loro ricostruzione 3D automatico.
  2. Per garantire la corretta visualizzazione di x, y e z dimensioni, controllare i formati di voxel e regolarle se necessario (Modifica > Proprietà immagine > immettere la dimensione del voxel manualmente). Per la dimensione del voxel di z, immettere la dimensione scelta di passaggio tra due immagini (qui 5 µm).
  3. Visualizzare ogni canale in un colore distinto (modificare > Visualizza regolazione del display). Clicca su ogni canale uno dopo l'altro per definire un colore di scelta (in Figura 2A, B, C, D il segnale di autofluorescenza è visualizzato in grigio ed etichettato CD4 umana+ cellule in rosso).
  4. Regolare l'intensità, livello del nero e contrasto per ogni canale (modificare > Visualizza regolazione del display) usando i triangoli nei bar canale o immettendo i numeri esatti nelle impostazioni del canale. Per la regolazione dell'intensità, utilizzare il triangolo di destra. Per la regolazione del livello di nero, usare il triangolo di sinistro e per la regolazione del contrasto, utilizzare il triangolo centrale.
    Nota: Utilizzare il polmone derivata dal mouse controllo senza trasferimento di cellule (punto 3.3) per differenziare tra segnali cellula-derivati umani specifici e aspecifiche sfondo.
  5. Per quantificare con etichettate cellule all'interno del tessuto polmonare utilizzano 'Aggiungi il nuovo spot' nella barra degli strumenti e selezionare 'saltare la creazione automatica, modificare manualmente' per il conteggio manuale delle cellule.
    Nota:     in alternativa, utilizzare la cella automatica Conteggio strumento sotto 'punti'. Tuttavia, conteggio manuale permette di distinguere più precisamente tra segnali specifici e non specifici.
    1. Per confrontare l'accumulo di cellule umane attraverso diversi campioni, definire un cubo del polmone con un volume specifico utilizzando lo strumento di taglio 3D (modificare > ritagliare 3D) (qui 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Per contare le cellule accumulate selezionare il canale 640 nm e definire una 'scala di raggio' di 10 µm. Quindi, fare clic su 'modifica', controllare 'selezionare' nel menu di puntatore e segnare ogni cella con un punto tramite Maiusc + clic con il pulsante sinistro del mouse. Trovare il numero complessivo delle cellule contate mostrate nelle statistiche.
      Nota: È consigliabile contare diversi cubetti per lobo del polmone (qui cinque) per garantire l'affidabilità dei risultati e compensare per la selezione di scienziato-dipendente del volume polmonare contati (risultati di strategia e rappresentante di quantificazione sono raffigurati in Figura 2D).
  6. Acquisire un'immagine usando lo strumento 'istantanea' e/o registrare un video utilizzando lo strumento 'animazione'. Risparmia il regolato dei file come IMS (file > Esporta).
    Nota: Per gli scopi rappresentativi, mostrare o nascondere la cornice selezionando o deselezionando la cornice sulla barra degli strumenti. Inoltre, visualizzazione immagini sia come proiezione di massima intensità (MIP) (barra degli strumenti > volume > modalità > Verifica MIP) oppure utilizzare la modalità' superficie' (barra degli strumenti > Aggiungi nuove superfici). La modalità di' superficie' deve essere attivato separatamente per ogni canale evidenziare l'architettura del tessuto e/o corpi cellulari (immagini rappresentative sono mostrati in Figura 2C).

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Risultati

Il protocollo presentato descrive un modello sperimentale del topo, che consente di monitorare e quantificare l'accumulo di linfociti T umani passivamente trasferiti nel polmone tramite microscopia a fluorescenza di luce-foglio. Figura 1 A fornisce una descrizione schematica dei passaggi del piano sperimentale in vivo. Al fine di garantire risultati affidabili, è di importanza notevole per garantire una buona qualità dell'isolato e fluorescente etichettato CD4 umana+

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Discussione

L'impostazione sperimentale descritto qui offre la possibilità di monitorare la capacità di homing polmonare delle cellule immuni umane primarie sotto condizioni infiammatorie in vivo e quindi relativo complementi classicamente eseguita la chemiotassi e l'adesione in vitro saggi. Per tener conto delle caratteristiche specifiche dell'organo anatomico del polmone, aspetti importanti della cellula immunitaria homing (compreso distribuzione chemiotassi e cella all'interno dell'organo bersaglio) n...

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Dichiarazioni

M.F. Neurath ha servito come consulente per Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. Gli autori rimanenti non divulgare qualsiasi conflitto.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine finanziamenti dalla DFG Collaborative Research centri SFB 1181 e TRR 241. L'Optical Imaging centro Erlangen (OICE) e in particolare Ralf Palmisano, Philipp Tripal e Tina Fraaß (progetto Z2 del DFG CRC 1181) sono riconosciuti per il supporto tecnico di esperti per l'imaging di fluorescenza di luce-foglio microscopico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarosio NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania2267.4
AlexaFlour594 anticorpo CD45 umanoBioLegend, San Diego, USA304060
Cloruro di ammonioCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermaniaK2981
Cannula 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA301300
Colorante per la proliferazione cellulare eflour670eBioscience Inc., San Diego, USA65-0840-85
CD4 MicroBeads, umanoMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germania130-045-101
EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania8043.1
Provetta per la raccolta del sangue con EDTA di potassio, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania112372-100G
Etanolo ≥ 99,5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania5054.3
FBS (siero fetale bovino) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, GermaniaP40-47500
Filtro 100 &; m VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germania732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurigo, Svizzeran.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Germanian.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Friburgo, Germania3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germanian.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germania130-042-303
Cannula Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania851638035
Ago da 30 GB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germania9161502
Neubauer camera di conteggioneoLab Migge GmbH, Heidelberg, GermaniaC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü sseldorf, GermaniaPSK1C
LS colonnaMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germania130-042-401
Terreno di separazione dei linfociti (densità 1.077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainaMerck1.071.440.025
PBS Dulbecco (soluzione salina tamponata con fosfato)Biochrom GmbH, Berlino, GermaniaL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-umano CD4BioLegend, San Diego, USA317428
PerCP/Cy5.5 topo IgG2b, κ isotipo CtrlBioLegend, San Diego, USA400337
PFA (paraformaldeide)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania0335.1
Carbonato acido di potassioCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermaniaP7481
Pipetta sierologica 10 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania86.1254.001 
Siringa 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germania9166017V
Siringa 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
Siringa 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260069
Provetta 1,5 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania72.706.400
Provetta 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania72.695.400 
Provetta 2 mL, marroneSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania72.695.001
Provetta 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania62.554.502 
Provetta 50 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Germania62.547.254 
Separatore QuadroMACSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germania130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, GermaniaKPOBD32

Riferimenti

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