Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Sommario

Questo protocollo comprende dissezione delle ossa lunghe murine e isolamento del midollo osseo, per generare i macrofagi del midollo osseo e producono gli osteoclasti usando fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago o fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e loro arresto dall'anticorpo anti-c-fms, ricevitore di M-CSF.

Abstract

Rimodellamento osseo è un processo complesso e coinvolge periodi di deposizione e di riassorbimento. Riassorbimento dell'osso è un processo mediante il quale osso è ripartito dagli osteoclasti in risposta a stimoli diversi. Precursori degli osteoclasti differenziano in osteoclasti multinuclear in risposta al fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago. In circostanze patologiche, il profilo di citochina è diverso e coinvolge una miscela di citochine infiammatorie. Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) è una delle più importanti citochine come si trova in grandi quantità nelle aree coinvolte con osteolysis infiammatorio. Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un metodo mediante il quale midollo osseo murino è isolato per generare osteoclasti attraverso induzione con M-CSF e RANKL o TNF-α, che verrà successivamente inibita aumentando le dosi dell'anticorpo anti-c-fms, il recettore per M-CSF. Questo esperimento evidenzia il valore terapeutico dell'anticorpo anti-c-fms in malattie di riassorbimento infiammatorio dell'osso.

Introduzione

Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate, e si differenziano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la fusione di più precursori degli osteoclasti. Essi sono essenziali per il rimodellamento del tessuto osseo sano e contribuire al riassorbimento osseo patologico associato a malattie osteolitiche infiammatorie come l'artrite reumatoide e la malattia parodontale¹.

Funzione di osteoclastogenesi e degli osteoclasti sono mediati da due fattori chiave; fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago. Sia M-CSF e RANKL sono importanti per la differenziazione di osteoclasto². Un altro fattore che è stato indicato per indurre la formazione di osteoclasti da macrofagi del midollo osseo in vitro è il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α)^3,4,5. TNF-α formazione mediata degli osteoclasti è stato indicato per essere critico per osteolisi in malattie ossee distruttive come artrite reumatoide⁶, malattia parodontale⁷e⁸di osteoporosi postmenopausale.

C-fms è il recettore di membrana di M-CSF e media la sua azione. Il ruolo di c-fms è ben documentato nella letteratura come è stato dimostrato che la somministrazione di un anticorpo contro c-fms (anticorpo anti-c-fms) completamente arrestato osteoclastogenesis in un modello di artrite come pure in TNF-α ha indotto le erosioni dell'osso mentre osteoclastogenesis lontano dall'articolazione infiammata era ancora robusto⁹. La somministrazione dell'anticorpo anti-c-fms ha inibito osteoclasto formazione e riassorbimento osseo indotto dal lipopolysaccharide (LPS) in mouse calvariae¹⁰ pure come LPS indotta periodontitis modello¹¹. Inoltre, l'anticorpo anti-c-fms ha inibito il riassorbimento della radice indotta da stress meccanico durante di movimento ortodontico del dente¹², come pure il movimento ortodontico del dente e riassorbimento osseo associato di movimento ortodontico del dente¹³.

M-CSF è stato segnalato per avere altre funzioni che sono essenziali per la risposta immunitaria. L'assenza di M-CSF in topi op/op con polmonite batterica portare all'aumento della carica batterica e la diffusione batterica al fegato con necrosi epatica¹⁴. Pertanto, M-CSF è importante per la risposta immunologica nella protezione dall'infezione.

Questo studio dimostra l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms su M-CSF e RANKL o TNF-α ha indotto la formazione degli osteoclasti in vitro e M-CSF ha indotto la proliferazione dei precursori degli osteoclasti. Questo protocollo viene illustrato l'isolamento delle cellule del midollo osseo murino da ossa lunghe e i passaggi per generare i macrofagi di midollo osseo (BMM) che sono considerati come precursori degli osteoclasti e per indurre la differenziazione delle BMM in osteoclasti multinuclear da due Metodi; RANKL o TNF-α. Il protocollo confronta anche l'arresto di osteoclastogenesi in entrambi i metodi usando l'anticorpo anti-c-fms.

Il processo mediante il quale midollo osseo viene estratta e successivamente utilizzato per generare precursori degli osteoclasti è affidabile nella produzione di grandi quantità di culture osteoclast puro che possono essere utilizzate in molteplici applicazioni a valle come test anti-droga. L'uso di RANKL o TNF-α per indurre il osteoclastogenesi in questo protocollo distingue osteoclastogenesi come un processo fisiologico (RANKL) da osteoclastogenesis come un processo patologico (TNF-α), che a sua volta prevede due procedure alternative per guidare la decisione di cui uno è superiore in termini di reagenti da utilizzare in applicazioni a valle. Questo protocollo fornisce inoltre un metodo mediante il quale possiamo determinare un'adeguata concentrazione di anticorpo anti-c-fms che può essere tranquillamente utilizzato per gli studi successivi coinvolti nel riassorbimento dell'osso e malattie osteolitiche.

Protocollo

Tutte le procedure di animale e cura degli animali sono state eseguite secondo norme e regolamenti di Università di Tohoku.

1. manipolazione e dissezione murino Hindlimb

1. Prima della dissezione, riempire un piatto con circa 50 mL di α-MEM a seconda delle dimensioni del contenitore e collocarlo sul ghiaccio. Questo servirà come un contenitore di raccolta fino al completamento della dissezione di tutte le ossa. Per questo e i successivi esperimenti, utilizzare α-MEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina.
2. Eutanasia del mouse C57Bl/6J per inalazione di una dose eccessiva di 5% isoflurane.
3. Difficoltà il mouse in posizione supina con perni trafitto le palme e piedi e spruzzo accuratamente con etanolo al 70%.
4. Fare un'incisione della pelle utilizzando forbici chirurgiche sterili e pinzette a livello dell'anca ed estenderlo fino ai piedi, esponendo i muscoli.
5. Tagliare il tendine allegando il muscolo quadricipite ed il tendine di associare il muscolo bicipite femorale fino all'osso. Togliere i muscoli esponendo le articolazioni di anca e di ginocchio. Individuazione di questi tendini faciliterà liberando entrambi i muscoli da loro allegati senza lasciare tag dei tessuti molli. Non tagliare l'osso.
6. Posizionare la forbice tra la testa del femore e spazio articolare e tagliati in essa liberando il femore ma mantenendo intatto l'osso. Ciò consentirà il distacco delle ossa senza il rischio di esporre il midollo osseo.
7. Allo stesso modo tagliare via i muscoli allegare alla tibia. Tagliare la tibia gratis dal relativo collegamento all'articolazione della caviglia mantenendo intatto per evitare la contaminazione dell'osso.
8. Raschiare eventuali tessuti molli rimanenti dal femore e tibia utilizzando le forbici lame e kimwipe e metterlo in un piatto con α-MEM posizionato su ghiaccio.

2. murino Hindlimb del midollo osseo isolamento

1. Riempire una siringa ago 30g con α-MEM.
2. Scollegare la tibia e femore dall'articolazione del ginocchio.
3. Tagliare le estremità delle ossa lunghe da entrambi i lati con le forbici.
4. Tenere l'osso dall'albero con una pinzetta, inserire l'ago nello spazio del midollo dell'osso e lentamente svuotare il contenuto del midollo in una piastra di coltura di 6 cm. L'osso apparirà bianca, che indica l'estrazione di tutto il contenuto del midollo osseo. Ripetere per tutte le ossa.
5. Ceppo il midollo osseo estrarre utilizzando un colino di cella di 40 μm in nylon in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.
6. Eliminare il supernatante, lavare con 5 mL di α-MEM e centrifugare a 300 x g per 5 min lavaggio ripetere per un totale di 2 volte.
7. Risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM ed eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro come segue:
   1. Fai una diluizione di 1:1 di sospensione cellulare aggiungendo 10 µ l di sospensione cellulare a 10 μL di 0,4% trypan blu in una provetta da 1,5 mL e dispensare una volta.
   2. Coprire l'emocitometro camera con una diapositiva e trasferire la sospensione di tintura l'emocitometro. È importante non sovraccaricare o sovra la camera e consentire la sospensione fino a riempire la camera per azione capillare.
   3. Posto l'emocitometro su una fase di microscopio. Utilizzando obiettivo 10x, concentrarsi sulla Piazza del centro. Contare tutte le celle vincolate da 3 linee. Per assicurarsi che le celle non vengono conteggiate due volte, contare gli angoli superiori e destro di ogni quadrato. Le cellule morte apparirà blu scuro, questi sono esclusi dal conteggio.
8. A seconda dell'applicazione a valle, le cellule del seme in un vaso di coltura appropriato. Per questo particolare esperimento, seguire la sezione 3.

3. generazione di BMM

1. Semi 1 x 10⁷ cellule/10 mL in un 10cm cultura piatto e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 ° C, 5% CO₂ per 3 giorni.
2. Dopo 3 giorni, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule vigorosamente con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) due volte per rimuovere le cellule non-aderenti, aggiungere 5 mL di tripsina EDTA 0.02% temperatura ambiente in PBS e incubare a 37 ° C, 5% CO₂ per 5 min.
3. Staccare le cellule pipettando approfondita. Assicurarsi che le celle siano state staccate osservando la cultura sotto un microscopio (le cellule dovrebbero apparire arrotondato e galleggiante in media). Se le cellule rimangono attaccate, ripetere accuratamente il pipettaggio per staccarli. Quando le cellule sono state staccate, aggiungere 5 mL di α-MEM per inattivare la reazione.
4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e lavare con 5 mL di α-MEM.
5. Centrifugare a 300 x g per 5 min e risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM.
6. Eseguire un conteggio delle cellule come precedentemente descritto al punto 2.7.1.
7. Semi 1 x 10⁶ cellule/10 mL in un 10cm cultura piatto e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 ° C, 5% CO₂ per 3 giorni.

4. generazione di osteoclasti da BMM come precursori degli osteoclasti

1. Dopo 3 giorni, raccogliere le cellule allegate che rappresentano BMM come precursori degli osteoclasti, seguendo passaggi 3.2-3.7.
2. BMM seme a 5 x 10⁴ cellule/200 μL di α-MEM in un piatto ben 96. Aggiungere RANKL per una concentrazione finale di 50 ng/mL o TNF-α per una concentrazione finale di 100 ng/mL. Aggiungi M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL in ciascun pozzetto.
3. Aggiunta dell'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ad ogni pozzetto.
4. Incubare a 37 ° C, 5% CO₂ per 4 giorni. Cambiare supporto ogni altro giorno per 4 giorni.

5. macchia di fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP)

1. Dopo 4 giorni di incubazione, aspirare delicatamente il terreno di coltura di ciascun pozzetto. Lavare ogni bene una volta con 200 μL di PBS 1X temperatura ambiente.
2. Aggiungere 200 μL di formalina al 10% ad ogni pozzetto per la fissazione e incubare per 1 h a temperatura ambiente. La formalina di aspirare e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.
3. Aggiungere 200 μL di 0,2% Triton X-100 in PBS a ciascuno per permeabilizzazione ed incubare per 1 h a temperatura ambiente. il X-100 Triton di aspirare e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.
4. Aggiungere 200 μL di soluzione di macchia di trappola ad ogni pozzetto. Visualizzare la macchia sotto il microscopio. Ci vorranno da 10-30 min per la macchia a svilupparsi correttamente.
5. Aspirare la macchia e lavare ciascun pozzetto con acqua deionizzata 3 volte ed asciugare all'aria. Conservare a temperatura ambiente per utilizzare in ulteriore osservazione.

6. analisi di proliferazione

1. BMM seme come precursori degli osteoclasti a 5 x 10³ celle/200 μL di α-MEM in un piatto ben 96. Aggiungi M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL in ciascun pozzetto.
2. Aggiunta dell'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubare a 37 ° C, 5% CO₂ per 3 giorni senza cambiamento medio.
3. Dopo 3 giorni, lavare le cellule con PBS 1X. Aggiungere 100 μL di α-MEM in ciascun pozzetto.
4. Aggiungere 10 μL di soluzione di kit di conteggio delle cellule e incubare a 37 ° C, 5% CO₂ per 2 h e determinare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

Risultati

Lo scopo del presente protocollo è di valutare l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti in presenza di RANKL o TNF-α e di determinare l'effetto di M-CSF sulla proliferazione dei precursori degli osteoclasti. In questo protocollo, abbiamo fornito un affidabile processo mediante il quale vengono generate grandi quantità di culture osteoclast puro. Abbiamo anche fornito un modo per testare l'anticorpo anti-c-fms concentrazione adatto per inibire la formazione di...

Discussione

In questo studio, abbiamo studiato l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti RANKL-indotta, formazione di osteoclasti indotta da TNF-α e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti M-CSF-indotto. Abbiamo trovato che la quantità effettiva di anticorpo anti-c-fms per l'inibizione dell'osteoclastogenesi tra formazione di osteoclasti RANKL-indotta, TNF-α indotto da osteoclasto formazione e M-CSF-indotto di proliferazione dei precursori degli osteoclasti è diversa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
		anti-c-Fms	AFS98, un anticorpo monoclonale di ratto, antimurino, c-Fms (IgG2a)
TNF-&alfa;			TNF-alfa murino ricombinante, preparato nel nostro laboratorio. TNF-&alfa; Frammento di cDNA clonato mediante RT-PCR e clonato in un pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) per generare una proteina di fusione GST. GST-TNF-&alfa; è stato espresso nelle cellule BL21 di Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA). Le cellule sono state lisate in condizioni non denaturanti e GST-TNF-&alfa; è stato purificato su una colonna di glutatione-sefarosio. La GST è stata scissa dalla PreScission Protease (Amersham Biosciences) dal produttore ed è stato rimosso da una colonna di glutatione-sefarosio.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Ligando murino-ricombinante sRANK, Fonte: E. coli
M-CSF M-CSF			umano ricombinante. 1/10 vol di CMG14– 12 surnatante di coltura di linea cellulare a 5x106  cellule in una piastra di coltura in sospensione di 10 cm.
α-MEM	Wako		con L-Glutammina e rosso fenolo
Siero fetale bovino	Biowest	s1820-500	Siero fetale bovino Origine francese Piatto
di coltura	Corning		100 mm x 20 mm piastra a
96 pozzetti	Thermofischer Scientific		Nun clon Delta kit
di conteggio delle cellule-8	Dojindo, Kumamoto, Giappone
Lettore di micropiastre	Sunrise REMOTE; Tekan Giappone, Kawasaki, Giappone
Filtro cellulare	Corning		40 μ m Nylon
Provetta da centrifuga	Corning		50 mL Tappo CentriStar
Triton X-100	Wako		Poliossietilene (10) Etere ottiliferico

Anticorpo