Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Il primo passo dell'induzione della risposta immunitaria innata è riconoscimento di host di double-stranded RNA (ds) dai recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG-io e melanoma differenziazione-associato proteina obbligatoria 5 (MDA-5)¹. Per i virus del RNA di senso positivo, dsRNA può solitamente essere facilmente individuata utilizzando anticorpi monoclonali (Mab) anti-dsRNA J2 o K1². Interazione tra dsRNA e PRRs in positivo-incagliano i virus del RNA, come picornavirus, è stata caratterizzata mediante microscopia confocale³. Tuttavia, per il negativo-senso virus a RNA, visualizzazione e caratterizzazione dell'interazione PRR e dsRNA è stato ostacolato dalla mancanza di anticorpi sensibili a dsRNA. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) di RNA è stato applicato per la visualizzazione di virale RNA e PRRs⁴. Tuttavia, la metodologia di pesce richiede la conoscenza del target sequenza di RNA e potrebbe non essere compatibile con la PRR co-macchiatura. Recentemente, il 5 9 Mab, che è stato originariamente sviluppato per la diagnosi di pan-enterovirus, infezione, è stato trovato per essere più sensibile il Mab J2 e può facilmente rilevare dsRNA in negativo-senso RNA virus infezione^5,6. Così, Mab 9 5 è un romanzo e strumento utile per studiare la replicazione virale e l'interazione tra PRR e RNA virale per-senso RNA virus.

Arenavirus sono una famiglia di virus del RNA singolo-incagliato, negativo-senso, che comprendono diversi patogeni umani, come virus di Lassa (LASV), Junín virus (JUNV) e virus di Machupo (MACV), che causano malattie febbre emorragica severa in esseri umani⁷. Dati clinici da mortali e gravi casi di argentino febbre emorragica causata dal nuovo mondo arenavirus JUNV esibiscono livelli insolitamente elevati di siero IFN-α^8,9. Abbiamo dimostrato che il patogeno arenavirus NW (JUNV e MACV), ma non i patogeni vecchio mondo arenavirus, LASV, indurre un tipo ho risposta di interferone (IFN) in cellule dentritiche monocito-derivate umane¹⁰. Inoltre, RIG-I è uno dei sensori di mediare la reazione di tipo I IFN in cellule infettate JUNV¹¹. Abbiamo anche trovato che il recettore di R (PKR) della chinasi di proteina, che è tradizionalmente conosciuto per il riconoscimento di dsRNA, è attivato in patogeni NW arenavirus infezione¹². Per capire meglio il meccanismo di risposta IFN virus-specifica durante l'infezione arenavirus, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo per visualizzare l'interazione tra dsRNA virale e la PRRs citoplasmico.

Esperimenti di infezione con patogeni JUNV, MACV e LASV devono essere eseguite in biosicurezza 4 (BSL-4) strutture di livello. Così, oltre al livello presumibilmente basso di dsRNA formata nell'infezione arenavirus, soddisfare i requisiti di biosicurezza è un'altra sfida tecnica durante l'esecuzione di studi di formazione immagine per questi virus ad alta patogenicità. Utilizzando il 5 9 anticorpo e il ceppo vaccinale Candid1 # di JUNV, un protocollo basato su microscopia confocale è descritto in questo rapporto, che è stato usato con successo per visualizzare dsRNA, proteina virale e PRR contemporaneamente in cellule infettate da arenavirus in Laboratori BSL2. Il protocollo è anche adatto per la visualizzazione della distribuzione intracellulare di dsRNA e PRR durante l'infezione patogena arenavirus in strutture BSL4.

1. preparazione di cellule A549 e JUNV infezione

1. Cellule epiteliali di seme 2 x 10⁵ polmonari umane A549 sulla poli-D-lisina (PDL) rivestito vetrini coprioggetti in 12 pozzetti a 24 ore prima dell'infezione.
2. Preparare aliquote di 150 mL di JUNV¹³ a una moltiplicazione di infezione (MOI) di 1,0 placca formando unità per cella diluito in media Medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco per volta completati con 2% siero bovino fetale (FBS) e 1%, penicillina e streptomicina (P/S ).
3. Rimuovere supporti dalla coltura delle cellule. Inoculo di virus su ciascun vetrino coprioggetti contenenti ed incubare per 1,5 h a 37 ° C. Agitare le piastre ogni 15 min.
4. Rimuovere l'inoculo di virus, aggiungere 1 mL di DMEM completate con 5% di FBS e 1% P/S. Incubare la piastra a 37 ° C per punto di tempo desiderato.

2. fissazione e immunostaining

1. Aspirare i media. Sciacquare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) completata con calcio e magnesio in ciascun pozzetto.
2. Rimuovere PBS. Aggiungere 1 mL di metanolo (MeOH) pre-raffreddato a-20 ° C ed incubare a-20 ° C o il ghiaccio secco per 15 min.
3. Rimuovere MeOH.
4. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto, e campioni di lavaggio a 4 ° C con dolce dondolo per 5 min, ripetere il lavaggio per totale di 4 volte.
5. Lavare le cellule fisse sulle lamelle in 1 mL di 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol per 5 min a 4 ° C, con dolce dondolio.
6. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto. Lavare i campioni a 4 ° C per 5 min con dolce dondolio. Ripetere la fase di lavaggio per totale di 4 volte.
7. Per rilevare dsRNA e MDA5, incubare i campioni in 200 mL di anticorpi primari diluito in 3% albumina di siero bovino (BSA). Diluire l'anticorpo anti-dsRNA 9 5 ad una diluizione di 1:2 e diluire l'anticorpo anti-MDA-5 a 1: 250. Incubare con dolce dondolo a 4 ° C durante la notte.
8. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare ogni bene con 1 mL di PBS per 5 min con dolce dondolo a RT. Ripeti questo lavaggio quattro volte di più.
9. Aggiungere 200 mL di anticorpi secondari (1:2, 000 diluizione) diluito in 3% BSA e incubare per 1h a RT.
10. Rimuovere gli anticorpi secondari e lavare ogni bene con 1 mL di PBS per 5 min con dolce dondolo a RT. Ripeti questo lavaggio quattro volte di più.
11. Per rilevare la nucleoproteina JUNV (NP) e RIG-, aggiungere 200 mL di anticorpi coniugati diluito in 3% BSA. Diluire il coniugato anti-JUNV NP (AG-12) a 1:1,000 e incubare i campioni per 2 h a RT con dolce dondolio. Diluire il coniugato anti-RIG-io anticorpo a 1: 500 e incubare a 4 ° C durante la notte con dolce dondolio.
12. Rimuovere gli anticorpi coniugati e lavare ogni bene con 1 mL di PBS per 5 min con dolce dondolo a RT. Ripeti questo lavaggio quattro volte di più.
13. Colorante di contrasto i coprioggetti con DAPI (1:1, 000) per 3 min con dolce dondolo a TA.
14. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte, ogni volta per 5 min in 1 mL di 0.5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol con dolce dondolo a TA.
15. Lavare due volte in 1 mL di PBS per 5 min ogni volta con dolce dondolo a TA.
16. Lavare una volta in 1 mL di ddH₂O per 1 min a RT, a dondolo delicatamente.
17. Montare le lamelle su vetrini utilizzando mezzi di montaggio. Lasciate che la cura durante la notte.
18. Sigillare le diapositive con smalto e aria secca per 1 h.
19. Immagine al microscopio confocale con la x 60 / 1.42 obiettivo ad immersione apertura numerica usando le stesse emissioni laser per ogni campione.
20. Quando si analizzano i dati, se necessario, effettuare regolazioni di luminosità e contrasto utilizzando la stessa regolazione lineare per tutti i campioni.

Questo protocollo è stato applicato per studiare la distribuzione e la colocalizzazione tra il RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA in cellule infettate da JUNV. Come illustrato nella Figura 1 e Figura 2, l'accumulo di dsRNA aumenta nel tempo come progredisce l'infezione virale. Concentrato di MDA-5 (Figura 1) e RIG-I (Figura 2) segnali sono stati trovati colocalized con le strutture punctate della NP e dsRNA.

Figura 1: corso di tempo del dsRNA e formazione JUNV NP e la distribuzione di MDA-5. JUNV-infettati e mock-infettato cellule A549 erano fissi, macchiate e stampate secondo il protocollo a 24, 36 e 48 ore post infezione (HPI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: corso di tempo del dsRNA e formazione JUNV NP e la distribuzione di RIG-I. JUNV-infettati e mock-infettato cellule A549 erano fissi, macchiate e stampate secondo il protocollo a 24, 36 e 48 HPI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.