Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Sommario

RNA double-stranded prodotto durante la replicazione del virus RNA possa essere riconosciuto dai recettori di riconoscimento di pattern per indurre una risposta immunitaria innata. Per i virus del RNA negativo-senso, l'interazione tra il basso livello dsRNA e PRRs rimane poco chiaro. Abbiamo sviluppato un metodo di microscopia confocale per visualizzare arenavirus dsRNA e PRR in singole celle.

Abstract

Doppia elica (ds) RNA è prodotto come un intermedio replicativo durante l'infezione da virus a RNA. Riconoscimento di dsRNA da recettori di riconoscimento di pattern host (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG- ed il melanoma differenziazione-collegata della proteina 5 (MDA-5) conduce all'induzione della risposta immunitaria innata. La formazione e la distribuzione intracellulare di dsRNA in senso positivo l'infezione del virus del RNA è stata ben caratterizzata da microscopia. Molti virus del RNA negativo-senso, tra cui alcuni arenavirus, innescare la risposta immunitaria innata durante l'infezione. Tuttavia, virus del RNA negativo-senso sono stati pensati per produrre bassi livelli di dsRNA, che ostacola il studio di imaging del riconoscimento PRR di dsRNA virale. Inoltre, esperimenti di infezione con patogenicità arenavirus devono essere eseguiti in strutture di contenimento elevato biosicurezza livello (BSL-4). L'interazione tra RNA virale e PRRs per virus altamente patogeno del RNA è in gran parte sconosciuto a causa di ulteriori sfide tecniche che i ricercatori devono affrontare nelle strutture BSL-4. Recentemente, un anticorpo monoclonale (Mab) (clone 5 9) originariamente utilizzato per il rilevamento di pan-enterovirus è stato trovato per rilevare in modo specifico il dsRNA con una sensibilità maggiore rispetto gli anticorpi di anti-dsRNA J2 o K1 tradizionale. Nel presente documento, utilizzando il 5 9 anticorpo, descriviamo un protocollo di microscopia confocale che è stato usato con successo per visualizzare dsRNA, proteina virale e PRR contemporaneamente in singole cellule infettate da arenavirus. Il protocollo è anche adatto per studi di dsRNA e distribuzione PRR in cellule patogene arenavirus infettati in BSL4 strutture di formazione immagine.

Introduzione

Il primo passo dell'induzione della risposta immunitaria innata è riconoscimento di host di double-stranded RNA (ds) dai recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG-io e melanoma differenziazione-associato proteina obbligatoria 5 (MDA-5)¹. Per i virus del RNA di senso positivo, dsRNA può solitamente essere facilmente individuata utilizzando anticorpi monoclonali (Mab) anti-dsRNA J2 o K1². Interazione tra dsRNA e PRRs in positivo-incagliano i virus del RNA, come picornavirus, è stata caratterizzata mediante microscopia confocale³. Tuttavia....

Protocollo

1. preparazione di cellule A549 e JUNV infezione

1. Cellule epiteliali di seme 2 x 10⁵ polmonari umane A549 sulla poli-D-lisina (PDL) rivestito vetrini coprioggetti in 12 pozzetti a 24 ore prima dell'infezione.
2. Preparare aliquote di 150 mL di JUNV¹³ a una moltiplicazione di infezione (MOI) di 1,0 placca formando unità per cella diluito in media Medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco per volta completati con 2% siero bovino fetale (FBS) e 1%, penicillina e streptomicina (P/S ).
3. Rimuovere supporti dalla coltura delle cellule. Inoculo di virus su ciascun vetrino coprioggetti contenenti ed incubare per 1,5 h a 3....

Risultati

Questo protocollo è stato applicato per studiare la distribuzione e la colocalizzazione tra il RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA in cellule infettate da JUNV. Come illustrato nella Figura 1 e Figura 2, l'accumulo di dsRNA aumenta nel tempo come progredisce l'infezione virale. Concentrato di MDA-5 (Figura 1) e RIG-I (Figura 2) segnali sono stati trovati colocalized con le stru.......

Discussione

Per senso positivo RNA virus e virus dsDNA, dsRNA è facilmente rilevato con l'anticorpo di anti-dsRNA J2 ampiamente utilizzato. Tuttavia, virus del RNA negativo-senso si ritiene che producono il dsRNA ad un livello basso o sotto il livello di rilevamento utilizzando lo stesso anticorpo². Così, molti aspetti di interazione virale RNA e PRR sono in gran parte poco chiari per virus del RNA negativo-senso. Abbiamo tentato di macchiare per dsRNA in arenavirus infezione usando l'anticorpo J2 ma i segnal.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di marcatura degli anticorpi APEX Alexa Fluor 647	Invitrogen	A10475
BSA	Sigma Aldrich	A4503
DAPI	Cell Signaling	4083	Diluizione 1:1.000
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-11058	Diluizione 1:2.000; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's medium	Corning	10-013-CV
Siero fetale bovino	Atlanta Bio	S11150
Vetrini per microscopio Fisher		12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029	1:2000 diluizione; Lotto #: 1874804
Cellule epiteliali polmonari umane A549	ATCC	CCL-185
Metanolo	Fisher	A412	Conservato a -20 ° C
Mouse MAb anti-JUNV NP	BEI	NA05-AG12	Coniugato ad Alexa-647 a diluizione 1:1.000
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagente	Millipore Sigma	3361	pronto all'uso; diluito a 1:2; Lotto #: 3067445
PBS additivato con Ca e Mg	Corning	21-030-CV
PDL Vetrini coprioggetto rivestiti	Neuvitro	H-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifade	Invitrogen	P10144
Rabbit MAb MDA-5	Abcam	ab126630	diluizione 1:250; Lotto #: GR97758-7
ceppo Candid#1 riconvenzionale di JUNV	Lab generato		Lab generato Come precedentemente descritto nel riferimento 13.
RIG-I mouse MAb coniugato ad Alexa-594	Santa Cruz	sc-376845	diluizione 1:1000; Lotto #: AO218
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787