Articolo metodologico

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

DOI:

10.3791/59095

⸱

26 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch

In questo articolo

Sommario

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RNA double-stranded prodotto durante la replicazione del virus RNA possa essere riconosciuto dai recettori di riconoscimento di pattern per indurre una risposta immunitaria innata. Per i virus del RNA negativo-senso, l'interazione tra il basso livello dsRNA e PRRs rimane poco chiaro. Abbiamo sviluppato un metodo di microscopia confocale per visualizzare arenavirus dsRNA e PRR in singole celle.

Abstract

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Doppia elica (ds) RNA è prodotto come un intermedio replicativo durante l'infezione da virus a RNA. Riconoscimento di dsRNA da recettori di riconoscimento di pattern host (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG- ed il melanoma differenziazione-collegata della proteina 5 (MDA-5) conduce all'induzione della risposta immunitaria innata. La formazione e la distribuzione intracellulare di dsRNA in senso positivo l'infezione del virus del RNA è stata ben caratterizzata da microscopia. Molti virus del RNA negativo-senso, tra cui alcuni arenavirus, innescare la risposta immunitaria innata durante l'infezione. Tuttavia, virus del RNA negativo-senso sono stati pensati per produrre bassi livelli di dsRNA, che ostacola il studio di imaging del riconoscimento PRR di dsRNA virale. Inoltre, esperimenti di infezione con patogenicità arenavirus devono essere eseguiti in strutture di contenimento elevato biosicurezza livello (BSL-4). L'interazione tra RNA virale e PRRs per virus altamente patogeno del RNA è in gran parte sconosciuto a causa di ulteriori sfide tecniche che i ricercatori devono affrontare nelle strutture BSL-4. Recentemente, un anticorpo monoclonale (Mab) (clone 5 9) originariamente utilizzato per il rilevamento di pan-enterovirus è stato trovato per rilevare in modo specifico il dsRNA con una sensibilità maggiore rispetto gli anticorpi di anti-dsRNA J2 o K1 tradizionale. Nel presente documento, utilizzando il 5 9 anticorpo, descriviamo un protocollo di microscopia confocale che è stato usato con successo per visualizzare dsRNA, proteina virale e PRR contemporaneamente in singole cellule infettate da arenavirus. Il protocollo è anche adatto per studi di dsRNA e distribuzione PRR in cellule patogene arenavirus infettati in BSL4 strutture di formazione immagine.

Introduzione

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Il primo passo dell'induzione della risposta immunitaria innata è riconoscimento di host di double-stranded RNA (ds) dai recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG-io e melanoma differenziazione-associato proteina obbligatoria 5 (MDA-5)1. Per i virus del RNA di senso positivo, dsRNA può solitamente essere facilmente individuata utilizzando anticorpi monoclonali (Mab) anti-dsRNA J2 o K12. Interazione tra dsRNA e PRRs in positivo-incagliano i virus del RNA, come picornavirus, è stata caratterizzata mediante microscopia confocale3. Tuttavia, per il negativo-senso virus a RNA, visualizzazione e caratterizzazione dell'interazione PRR e dsRNA è stato ostacolato dalla mancanza di anticorpi sensibili a dsRNA. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) di RNA è stato applicato per la visualizzazione di virale RNA e PRRs4. Tuttavia, la metodologia di pesce richiede la conoscenza del target sequenza di RNA e potrebbe non essere compatibile con la PRR co-macchiatura. Recentemente, il 5 9 Mab, che è stato originariamente sviluppato per la diagnosi di pan-enterovirus, infezione, è stato trovato per essere più sensibile il Mab J2 e può facilmente rilevare dsRNA in negativo-senso RNA virus infezione5,6. Così, Mab 9 5 è un romanzo e strumento utile per studiare la replicazione virale e l'interazione tra PRR e RNA virale per-senso RNA virus.

Arenavirus sono una famiglia di virus del RNA singolo-incagliato, negativo-senso, che comprendono diversi patogeni umani, come virus di Lassa (LASV), Junín virus (JUNV) e virus di Machupo (MACV), che causano malattie febbre emorragica severa in esseri umani7. Dati clinici da mortali e gravi casi di argentino febbre emorragica causata dal nuovo mondo arenavirus JUNV esibiscono livelli insolitamente elevati di siero IFN-α8,9. Abbiamo dimostrato che il patogeno arenavirus NW (JUNV e MACV), ma non i patogeni vecchio mondo arenavirus, LASV, indurre un tipo ho risposta di interferone (IFN) in cellule dentritiche monocito-derivate umane10. Inoltre, RIG-I è uno dei sensori di mediare la reazione di tipo I IFN in cellule infettate JUNV11. Abbiamo anche trovato che il recettore di R (PKR) della chinasi di proteina, che è tradizionalmente conosciuto per il riconoscimento di dsRNA, è attivato in patogeni NW arenavirus infezione12. Per capire meglio il meccanismo di risposta IFN virus-specifica durante l'infezione arenavirus, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo per visualizzare l'interazione tra dsRNA virale e la PRRs citoplasmico.

Esperimenti di infezione con patogeni JUNV, MACV e LASV devono essere eseguite in biosicurezza 4 (BSL-4) strutture di livello. Così, oltre al livello presumibilmente basso di dsRNA formata nell'infezione arenavirus, soddisfare i requisiti di biosicurezza è un'altra sfida tecnica durante l'esecuzione di studi di formazione immagine per questi virus ad alta patogenicità. Utilizzando il 5 9 anticorpo e il ceppo vaccinale Candid1 # di JUNV, un protocollo basato su microscopia confocale è descritto in questo rapporto, che è stato usato con successo per visualizzare dsRNA, proteina virale e PRR contemporaneamente in cellule infettate da arenavirus in Laboratori BSL2. Il protocollo è anche adatto per la visualizzazione della distribuzione intracellulare di dsRNA e PRR durante l'infezione patogena arenavirus in strutture BSL4.

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Protocollo

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1. preparazione di cellule A549 e JUNV infezione

  1. Cellule epiteliali di seme 2 x 105 polmonari umane A549 sulla poli-D-lisina (PDL) rivestito vetrini coprioggetti in 12 pozzetti a 24 ore prima dell'infezione.
  2. Preparare aliquote di 150 mL di JUNV13 a una moltiplicazione di infezione (MOI) di 1,0 placca formando unità per cella diluito in media Medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco per volta completati con 2% siero bovino fetale (FBS) e 1%, penicillina e streptomicina (P/S ).
  3. Rimuovere supporti dalla coltura delle cellule. Inoculo di virus su ciascun vetrino coprioggetti contenenti ed incubare per 1,5 h a 37 ° C. Agitare le piastre ogni 15 min.
  4. Rimuovere l'inoculo di virus, aggiungere 1 mL di DMEM completate con 5% di FBS e 1% P/S. Incubare la piastra a 37 ° C per punto di tempo desiderato.

2. fissazione e immunostaining

  1. Aspirare i media. Sciacquare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) completata con calcio e magnesio in ciascun pozzetto.
  2. Rimuovere PBS. Aggiungere 1 mL di metanolo (MeOH) pre-raffreddato a-20 ° C ed incubare a-20 ° C o il ghiaccio secco per 15 min.
  3. Rimuovere MeOH.
  4. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto, e campioni di lavaggio a 4 ° C con dolce dondolo per 5 min, ripetere il lavaggio per totale di 4 volte.
  5. Lavare le cellule fisse sulle lamelle in 1 mL di 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol per 5 min a 4 ° C, con dolce dondolio.
  6. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto. Lavare i campioni a 4 ° C per 5 min con dolce dondolio. Ripetere la fase di lavaggio per totale di 4 volte.
  7. Per rilevare dsRNA e MDA5, incubare i campioni in 200 mL di anticorpi primari diluito in 3% albumina di siero bovino (BSA). Diluire l'anticorpo anti-dsRNA 9 5 ad una diluizione di 1:2 e diluire l'anticorpo anti-MDA-5 a 1: 250. Incubare con dolce dondolo a 4 ° C durante la notte.
  8. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare ogni bene con 1 mL di PBS per 5 min con dolce dondolo a RT. Ripeti questo lavaggio quattro volte di più.
  9. Aggiungere 200 mL di anticorpi secondari (1:2, 000 diluizione) diluito in 3% BSA e incubare per 1h a RT.
  10. Rimuovere gli anticorpi secondari e lavare ogni bene con 1 mL di PBS per 5 min con dolce dondolo a RT. Ripeti questo lavaggio quattro volte di più.
  11. Per rilevare la nucleoproteina JUNV (NP) e RIG-, aggiungere 200 mL di anticorpi coniugati diluito in 3% BSA. Diluire il coniugato anti-JUNV NP (AG-12) a 1:1,000 e incubare i campioni per 2 h a RT con dolce dondolio. Diluire il coniugato anti-RIG-io anticorpo a 1: 500 e incubare a 4 ° C durante la notte con dolce dondolio.
  12. Rimuovere gli anticorpi coniugati e lavare ogni bene con 1 mL di PBS per 5 min con dolce dondolo a RT. Ripeti questo lavaggio quattro volte di più.
  13. Colorante di contrasto i coprioggetti con DAPI (1:1, 000) per 3 min con dolce dondolo a TA.
  14. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte, ogni volta per 5 min in 1 mL di 0.5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol con dolce dondolo a TA.
  15. Lavare due volte in 1 mL di PBS per 5 min ogni volta con dolce dondolo a TA.
  16. Lavare una volta in 1 mL di ddH2O per 1 min a RT, a dondolo delicatamente.
  17. Montare le lamelle su vetrini utilizzando mezzi di montaggio. Lasciate che la cura durante la notte.
  18. Sigillare le diapositive con smalto e aria secca per 1 h.
  19. Immagine al microscopio confocale con la x 60 / 1.42 obiettivo ad immersione apertura numerica usando le stesse emissioni laser per ogni campione.
  20. Quando si analizzano i dati, se necessario, effettuare regolazioni di luminosità e contrasto utilizzando la stessa regolazione lineare per tutti i campioni.

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Risultati

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Questo protocollo è stato applicato per studiare la distribuzione e la colocalizzazione tra il RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA in cellule infettate da JUNV. Come illustrato nella Figura 1 e Figura 2, l'accumulo di dsRNA aumenta nel tempo come progredisce l'infezione virale. Concentrato di MDA-5 (Figura 1) e RIG-I (Figura 2) segnali sono stati trovati colocalized con le stru...

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Discussione

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Per senso positivo RNA virus e virus dsDNA, dsRNA è facilmente rilevato con l'anticorpo di anti-dsRNA J2 ampiamente utilizzato. Tuttavia, virus del RNA negativo-senso si ritiene che producono il dsRNA ad un livello basso o sotto il livello di rilevamento utilizzando lo stesso anticorpo2. Così, molti aspetti di interazione virale RNA e PRR sono in gran parte poco chiari per virus del RNA negativo-senso. Abbiamo tentato di macchiare per dsRNA in arenavirus infezione usando l'anticorpo J2 ma i segnal...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare l'UTMB imaging core strutture e Maxim Ivannikov per assistenza di microscopio.

Questo lavoro è stato supportato dal servizio sanitario pubblico concedere RO1AI093445 e RO1AI129198 assegnato a SP, UTMB impegno fondo P84373 a CH e T32 AI007526 di EM.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di marcatura degli anticorpi APEX Alexa Fluor 647InvitrogenA10475
BSASigma AldrichA4503
DAPICell Signaling4083Diluizione 1:1.000
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA-11058Diluizione 1:2.000; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's mediumCorning10-013-CV
Siero fetale bovinoAtlanta BioS11150
Vetrini per microscopio Fisher12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488InvitrogenA-110291:2000 diluizione; Lotto #: 1874804
Cellule epiteliali polmonari umane A549ATCCCCL-185
MetanoloFisherA412Conservato a -20 ° C
Mouse MAb anti-JUNV NPBEINA05-AG12Coniugato ad Alexa-647 a diluizione 1:1.000
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 ReagenteMillipore Sigma3361pronto all'uso; diluito a 1:2; Lotto #: 3067445
PBS additivato con Ca e MgCorning21-030-CV
PDL Vetrini coprioggetto rivestitiNeuvitroH-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifadeInvitrogenP10144
Rabbit MAb MDA-5Abcamab126630diluizione 1:250; Lotto #: GR97758-7
ceppo Candid#1 riconvenzionale di JUNVLab generatoLab generato Come precedentemente descritto nel riferimento 13.
RIG-I mouse MAb coniugato ad Alexa-594Santa Cruzsc-376845diluizione 1:1000; Lotto #: AO218
Triton X-100Sigma AldrichT8787 

Riferimenti

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