Articolo metodologico

Adsorbimento di spora come un sistema di visualizzazione Nonrecombinant per gli enzimi e gli antigeni

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DOI:

10.3791/59102

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19 marzo 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Federico II University, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è centrato sull'uso delle spore batteriche come strumento nanobiotecnologica "dal vivo" di adsorbire molecole eterologhe con varie attività biologiche. I metodi per misurare l'efficienza di adsorbimento sono anche mostrati.

Abstract

La spora batterica è una cellula metabolicamente quiescente, costituita da una serie di strati protettivi che circondano un citoplasma disidratato. Questa struttura molto particolare rende la spora estremamente stabili e resistenti e ha suggerito l'uso della spora come una piattaforma per mostrare le molecole eterologhe. Finora, una varietà di antigeni ed enzimi sono state visualizzate su spore di Bacillus subtilis e di poche altre specie, inizialmente da un approccio ricombinante e, quindi, da un semplice ed efficace metodo di nonrecombinant. Il sistema di visualizzazione nonrecombinant è basato sull'adsorbimento di molecole eterologhe sulla superficie spora, evitando la costruzione di ceppi ricombinanti e il rilascio di batteri geneticamente modificati nell'ambiente diretto. Molecole adsorbite sono stabilizzati e protetti dall'interazione con le spore, che limita la rapida degradazione degli antigeni e la perdita di attività enzimatica in condizioni sfavorevoli. Una volta utilizzato, spora-adsorbito enzimi possono essere raccolti facilmente con una minima riduzione di attività e riutilizzati per reazione ulteriori giri. In questa carta è indicato come di adsorbire molecole modello a purificata spore di Bacillus subtilis, come valutare l'efficienza di adsorbimento e come raccogliere le spore usate per riciclarle per nuove reazioni.

Introduzione

Sistemi di visualizzazione sono finalizzati a presentare molecole biologicamente attive sulla superficie dei microrganismi e trovare applicazioni in vari campi, da industriale a biotecnologie mediche e ambientali. Oltre alle cellule di varie gram-negativo e - positivo specie3,4,5,6,7, fagi1,2 e sono state anche le spore batteriche proposto come sistemi di visualizzazione da due approcci8,9.

Per la sua peculiare struttura, vale a dire un citoplasma disidratato, circondato da una serie di strati protettivi10, la spora offre diversi vantaggi rispetto dei fagi e basate sulle cellule display sistemi8,9. Un primo vantaggio deriva dalla estrema robustezza e stabilità delle spore alle condizioni che sarebbero deleterie per tutte le altre cellule10,11. Spora-visualizzati gli antigeni e gli enzimi sono stabili dopo prolungato stoccaggio a temperatura ambiente12 e protetto dal degrado a basso pH e alte temperature13. Un secondo vantaggio delle spore è la sicurezza di molte specie di spore. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanse numerose altre specie sono utilizzati in tutto il mondo come i probiotici e sono stati sul mercato per uso umano o animale per decenni14,15. Questo record di sicurezza eccezionale è un requisito generale ovvio per un sistema di visualizzazione della superficie ed è di particolare rilevanza quando il sistema è inteso per uso umano o animale16. Un terzo, importante vantaggio di un sistema di visualizzazione basati su spore è che non ha limitazioni per la dimensione della molecola che deve essere esposto. Nei sistemi basati su fagi, una grossa proteina eterologa può influenzare la struttura del capside, mentre nei sistemi basati su cellulare, possono influenzare la struttura della membrana o limite/possono compromettere la traslocazione di membrana passo17. Gli strati protettivi che circonda la spora sono composti da più di 70 diverse proteine10 e sono abbastanza flessibili da accettare grandi proteine straniere senza evidenti difetti strutturali o compromissione funzionale8. Inoltre, con due sistemi di visualizzazione basati su spore, la traslocazione di membrana della proteina eterologa non è richiesto8,9. Infatti, le proteine eterologhe sono sia prodotta nel citoplasma della cellula madre e assemblate su spore che si sta formando nel citoplasma stesso o adsorbito la spora matura8,9.

Visualizzazione di spora inizialmente è stata ottenuta attraverso lo sviluppo di un sistema genetico per la superficie di spora18l'ingegnere. Questo sistema genetico è stato basato su i) la costruzione di una fusione genica tra il gene che codifica per una proteina del cappotto di spora (usata come vettore) e del gene che codifica per la proteina essere visualizzati - la presenza dei segnali trascrizionali e traslazionali dell'endogena gene controllerà l'espressione della fusione e ii) integrazione del gene chimerico sul cromosoma di b. subtilis per garantire stabilità genetica. Una varietà di antigeni ed enzimi sono stati esposti da questo approccio ricombinante, utilizzando varie proteine di superficie spore come vettori e che mira a vari potenziali applicazioni, che vanno dal vaccino mucoso biocatalizzatore, biosensori, bioremediation, o Bioanalytical strumento8,13.

Più recentemente, un approccio diverso del display spora è stato sviluppato19. Questo secondo sistema è nonrecombinant e si basa sull'adsorbimento di molecole sulla superficie spora9spontanea ed estremamente stretto. Antigeni19,20 ed enzimi13,21 sono state visualizzate in modo efficiente e hanno rivelato che questo metodo è molto più efficiente rispetto a quello ricombinante. Questo approccio nonrecombinant permette la visualizzazione di proteine in forma nativa20 e può essere utilizzato anche con autoclavato, spore morte19. Il meccanismo molecolare di adsorbimento non è stato completamente chiarito ancora. La carica negativa e l'idrofobicità della spora sono stati proposti come proprietà rilevanti per l'adsorbimento13,19,22. Recentemente, è stato indicato che una modello proteina, la proteina autofluorescent rosso (mRFP) del corallo Discosoma, quando adsorbiti alla spora, era in grado di infiltrarsi attraverso gli strati superficiali di localizzazione nel cappotto interno23. Se si è rivelato vero per altre proteine, la localizzazione interna delle proteine eterologhe potrebbe spiegare loro maggiore stabilità quando adsorbito a spore23.

In uno studio recente, due enzimi che catalizza due passaggi successivi del pathway di degradazione xilano in modo indipendente sono stati visualizzati su spore di Bacillus subtilis e, quando incubati insieme, erano in grado di eseguire entrambi degradazione passi21. Spore raccolti dopo la reazione erano ancora attive e in grado di continuare la degradazione di xilano sull'aggiunta di substrato fresco21. Anche se la seconda reazione21è stata osservata una perdita di circa il 15% del prodotto finale, la riutilizzabilità degli enzimi adsorbiti per reazioni singole, così come multi-step, è un ulteriore vantaggio importante del sistema di visualizzazione di spora.

Pan et al.24 segnalato un approccio aggiuntivo per visualizzare le proteine eterologhe sulla superficie spora: proteine eterologhe (una proteina endoglucanase e una beta-galattosidasi uno) prodotte nella cellula madre durante la sporulazione erano spontaneamente racchiuso nel cappotto spora che forma, senza la necessità di un vettore. Questo sistema di visualizzazione aggiuntive spora è una combinazione dei due approcci descritti finora. Infatti, è ricombinante poiché le proteine eterologhe sono state progettate per essere espressa nella cellula madre durante la sporulazione, mentre loro assemblaggio all'interno il cappotto è stato spontaneo e, quindi, nonrecombinant24. Tuttavia, l'efficienza del display di questo approccio supplementare rimane per essere testato e confrontato con gli altri due approcci utilizzando le stesse proteine eterologhe.

Il presente protocollo esclude i processi di produzione di spore e purificazione, che sono stati descritti ampiamente altrove24. Esso comprende la reazione di adsorbimento, la valutazione dell'efficienza di adsorbimento da microscopia di fluorescenza e macchiare del puntino, e il riciclaggio degli enzimi adsorbiti per reazione ulteriori giri.

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Protocollo

1. reazione adsorbimento

  1. Incubare 2, 5 e 10 µ g di mRFP con 2 x 109 di b. subtilis spore purificate di selvaggio-tipo a 200 µ l di binding buffer, citrato di sodio di 50 mM, pH 4,0 (16,7 mM sodio citrato diidrato; acido citrico 33,3 mM) per 1 h a 25 ° C in un agitatore oscillante (Figura 1) .
  2. Centrifugare le miscele di associazione (13.000 x g per 10 min) per frazionare pellet (P2, P5 e P10) e surnatanti (S2, S5 e S10). Memorizzare i surnatanti per la valutazione indiretta dell'efficienza di adsorbimento descritto al punto 3.2.
  3. Lavare il pellet 2 x con 200 µ l di binding buffer e risospendere in 100 µ l di binding buffer e utilizzarlo per l'analisi successiva.
    Nota: La reazione di associazione avviene preferenzialmente a un valore di pH inferiore al punto isoelettrico della proteina; in genere, 1,5 M tampone fosfato salino (PBS), pH 4.0, o citrato di sodio di 50 mM, pH 4.0, vengono utilizzati.

2. diretta valutazione dell'efficienza di adsorbimento

  1. Estrazione delle proteine di superficie e l'analisi western blot
    1. Prendere 50 µ l di risospensione adsorbito mRFP spore (P2, P5 e P10 di passaggio 1.3) e aggiungere 50 µ l di sodio dodecil solfato (SDS): 2x-ditiotreitolo (DTT) (0.1 M Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 0,1 M DTT) per solubilizzare le proteine di superficie spora.
    2. Utilizzare il mRFP libero, purificata ed estratti delle stesse quantità di spore che non sono adsorbite alla proteina come controlli positivi e negativi, rispettivamente.
    3. Dopo 45 min di incubazione a 65 ° C, centrifugare (13.000 x g per 10 min) le miscele e analizzare 10 µ l di proteine estratte (surnatante) mediante western blot con anticorpo monoclonale anti-suo anticorpo riconoscendo il suo tag presenti al N-terminale di mRFP ( Figura 2A).
  2. Osservazioni di microscopia fluorescente
    Nota: Utilizzando proteine eterologhe fluorescenti o esecuzione di un'analisi di immunofluorescenza, è possibile localizzare e quantificare le molecole adsorbite da microscopia di fluorescenza.
    1. Prendere 5 µ l di risospensione le spore adsorbito dal passaggio 1.3 e 95 µ l di PBS 1X, pH 4.0, ottenere ~ 1 x 106 spore / µ l.
    2. Posto 5 µ l di sospensione su un vetrino da microscopio, coprire con un vetrino coprioggetto precedentemente trattato con poli-l-lisina per 30 s e osservarlo con un microscopio a fluorescenza.
    3. Per ogni campo, salvare l'immagine di microscopia di contrasto di fase e l'immagine di microscopia di fluorescenza (Figura 2B).
      Nota: In alternativa, spore fluorescente possono essere analizzate mediante citofluorimetria. Risospendere un totale di 106 spore adsorbito o non-adsorbito con la proteina eterologa in 1 mL di PBS 1X, pH 4.0 e analizza la sospensione utilizzando un citometro a flusso (Figura 2C).
  3. Analisi dei dati utilizzando ImageJ
    1. Aprire le immagini di microscopia di fluorescenza con software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) e verificare che tutte le immagini sono in formato 8-bit (immagine | Tipo | 8-bit).
    2. Se necessario, regolare il contrasto (immagine | Regolare | Luminosità contrasto) e verificare che la scala dell'immagine è PIXEL (immagine | Impostare la scala).
    3. Dal menu Analizza, selezionare Set di misure. Assicurarsi di avere la zonae Densità integrata Significa grigio valore selezionato.
    4. Disegnare una linea attorno la spora di interesse utilizzando uno degli strumenti di disegno/selezione (cioè, cerchio, poligono, o a mano libera) (Figura 3).
    5. Selezionare la misura dal menu Analizza (o premi cmd + M). Verrà visualizzata una finestra di popup con una pila di valori per questo primo spora (Figura 3).
    6. Ripetere questi due passaggi per almeno 50 altre spore nel campo di vista scelto da misurare.
    7. Selezionare diverse regioni senza eventuali spore (che non hanno nessuna fluorescenza) e ripetere la misurazione; Questo sarà lo sfondo.
      Nota: La dimensione non è importante. Questi valori di fluorescenza di fondo corrispondente utilizzerà per sottrarre manualmente sullo sfondo.
    8. Selezionare tutti i dati nella finestra risultati e copiare i risultati in un foglio di calcolo.
    9. Calcolare la media della Densità integrata e della zona delle spore selezionate e dei valori di fluorescenza di fondo e utilizzarli per ottenere il corretta fluorescenza totale per cella (CTCF) utilizzando la formula: CTCF = Integrated Media Densità - (Area media x media fluorescenza di fondo).
      Nota: In alternativa, se tutte le spore appaiono ben separate, è possibile analizzare tutte le spore del campo dell'immagine utilizzando la funzione di Analizzare particelle, seguendo le istruzioni di ImageJ. Per evitare che il software legge una fluorescenza specifica o aggregati di spore, la dimensione delle particelle deve essere impostato a pixelˆ2 = 50-200 (Figura 4).

3. indiretta valutazione dell'efficienza di adsorbimento

  1. Preparare diluizioni seriali per la proteina purificata.
    1. Preparare una prima provetta da 1,5 mL contenente 250 µ l di purificato mRFP ad una concentrazione finale di 0,5 ng / µ l, utilizzando il buffer di associazione. Questo volume è sufficiente per caricare due corsie.
    2. Eseguire sei duplice diluizioni seriali di 250 µ l (volume finale) ciascuno, utilizzando il buffer di associazione.
  2. Preparare la duplice diluizioni seriali per gli esempi di supernatanti contenente la frazione non associato mRFP della reazione di adsorbimento (S2, S5 e S10 dal punto 1.2).
    1. Mettere 100 µ l di ogni surnatante in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di tampone di associazione. Eseguire sei duplice diluizioni seriali di 200 µ l (volume finale) ciascuno, utilizzando il buffer di associazione.
  3. Tagliare una nitrocellulosa membrana (0,45 µm cut-off), 9 x 10 cm in dimensione, per coprire l'area di 5 (numero di campioni) x 6 punti (numero di diluizioni). La membrana non si estenda oltre il bordo della guarnizione dell'apparato di dot blot.
  4. Posizionare la membrana ha nell'apparato di dot blot. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra la membrana e la guarnizione. Coprire la parte non utilizzata dell'apparato con nastro o paraffina film per impedire l'aria si muove attraverso quei pozzi.
  5. Montare l'apparecchiatura di macchia del puntino come descritto dal produttore.
  6. Se un vuoto viene utilizzato durante il montaggio, reidratare la membrana con 100 µ l di 1X PBS per pozzetto per garantire l'uniforme associazione dell'antigene ed evitare aloni o un segnale debole di individuazione.
  7. Rimuovere delicatamente il buffer dai pozzi di vuoto. Non appena la soluzione tampone drena da tutti i pozzetti, fermare la pompa del vuoto e scollegarlo.
  8. Caricare lo standard a due corsie più esterne e i campioni al centro (Figura 5). Riempire i pozzetti con 100 µ l di ciascuna diluizione. Lo stesso volume usato per ciascun pozzetto dovrebbe garantire una filtrazione omogenea di tutti i pozzetti.
  9. Accendere la pompa del vuoto per 2 min, fermarlo e poi, lasciare il campione attraverso la membrana del filtro da flusso di gravità.
  10. Lavare tutti i pozzetti con 100 µ l di 1X PBS e lasciare che la pompa del vuoto funzionare per un altro 5 min dopo il tampone di lavaggio è stato completamente svuotata dall'apparecchio.
  11. Con il vuoto, allentare le viti e aprire con cautela l'apparato di macchia del puntino.
  12. Disattivare il vuoto, prendere la membrana ed elaborare seguendo un protocollo occidentale della macchia.
  13. Eseguire un'analisi densitometrica del filtro, utilizzando il software appropriato, ad esempio ImageJ.
    1. Misurare la densità integrata di ciascun punto strutturarle con un cerchio della stessa area e utilizzando il comando Analyze/misura .
    2. Apportare una correzione di sfondo dell'immagine, disegnare un cerchio in un'area vuota e misura della sua densità integrato o utilizzando il comando di Processo/Sottrai sfondo .
    3. Correlare la densità dei punti standard integrata con la quantità di proteina caricata e ottenere una linea di calibrazione (R2 valori per la calibrazione curve dovrebbero essere sopra 0.95).
    4. Utilizzare la curva di taratura per estrapolare la concentrazione di mRFP di ogni punto del campione.
    5. Calcolare la concentrazione del mRFP restanti nelle frazioni non associate.
      Nota: Per garantire la corretta chiusura dell'apparato di dot blot e, quindi, al soggetto la membrana ad una pressione uniforme, serrare le viti seguendo uno schema incrociato in diagonale e, quindi, aprire la pompa a vuoto per stringere le viti più fortemente.

4. raccolta di spore e riutilizzare

  1. Per il riciclaggio della spora adsorbita, eseguire due reazioni di adsorbimento di 2.0 x 109 purificato spore con 10 µ g di purificato GH10-XA xilanasi o 10 µ g di β purificata di GH3-XT-xylosidase, come descritto nei passaggi 1.1-1.3 (Figura 6A).
  2. Raccogliere il pellet contenente le spore di enzima-adsorbito, li risospendere in 50 µ l di buffer ottimale per il dosaggio di reazione enzimatica (tampone sodio fosfato 50 mM a pH 6,5; 2,48689 g/L Na2HPO4, 4,88991 g/L NaH2PO4), e mescolarli insieme per ottenere una miscela di 100 µ l di spore adsorbente GH10-XA o GH3-XT.
  3. Aggiungere il substrato (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) e lasciare che le reazioni enzima avvengono per 16 h a 65 ° C.
  4. Centrifugare la miscela di reazione (per 15 min a 13.000 x g) e conservare il supernatante contenente il prodotto di reazione enzima.
  5. Risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di fosfato di sodio fresco 50 mM a pH 6.5 in presenza di un nuovo substrato (MGX) (Figura 6B).
    Nota: Per assorbire più di un enzima, è la possibilità di assorbire entrambi insieme o uno per uno in modo indipendente. Quest'ultima possibilità facilita l'analisi quantitativa dell'efficienza di adsorbimento e dell'attività di ogni enzima, che permette un equilibrio stechiometrico di ogni enzima necessario per le reazioni.

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Risultati

Adsorbimento di successo può essere valutata mediante western blotting. Al momento la reazione, la miscela è frazionata mediante centrifugazione e lavata, e la frazione di pellet (Figura 1) viene utilizzata per estrarre le proteine di superficie. L'estratto è frazionato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS (pagina), elettrotrasferiti ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) e ha reagito contro gli anticorpi primari e secondari. La ...

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Discussione

Questo protocollo di adsorbimento di spora è molto semplice e diretto. La reazione è strettamente legata al pH del tampone di reazione e l'efficienza di adsorbimento è ottima a valori di pH acido (pH 5.0 o inferiore). Alle condizioni di pH neutro, l'efficienza di adsorbimento è bassa, e a valori di pH alcalini, adsorbimento non può verificarsi. Adsorbimento ottima si ottiene utilizzando un volume di 200 µ l in tubi da 1,5 mL (o mantenere un rapporto simile) su un agitatore a dondolo.

Adsorbime...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" di L. Baccigalupi, titolo del progetto "SP-LAY: spore batteriche come piattaforma live per la visualizzazione di proteine".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di poli-L-lisina 0,1%SigmaP8920
0,45 µ m Membrana di tamponamento alla nitrocellulosaSartorius M_Blotting_Membranes
100&volte; obiettivo UPlanF1 per microscopioOlympus
Bacillus subtilis  ceppo NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1
BD ACCURI C6 PLUSBDcitometro
BX51Microscopiofluorescente Olympus
ClarityBiorad1705060
fotocamera digitale DP70 un'attrezzaturaper microscopioOlympus
Anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) di capra, FITCThermo fisherF-2754
Capra Anti-Coniglio IgG H& L (HRP) Abcamab6721
Monoclonale Anti-poliistidina− Anticorpo perossidasiSigmaA7058-1VLutilizzato per rilevare le proteine adsorbite che presentano un tag 6xistidina al terminale C o N.
SecureSlip  vetrino coprioggettiSigmaS1815-1PAK
Superwhite Vetrini per microscopio non caricatiVWR75836-190
U-CA Cambio di ingrandimento per microscopioOlympus
Attrezzatura a flussoAttrezzatura

Riferimenti

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Spore battericheesposizione enzimaticaesposizione antigenicamicroscopia a fluorescenzaWestern Blotanalisi Dot Blotquantificazione con ImageJriciclo delle spore

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