Articolo metodologico

Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

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DOI:

10.3791/59107

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23 maggio 2019

 , 
1Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e segnare la malattia in un modello di malattia xenogeneica innesto contro ospite (xenoGVHD). xenoGVHD fornisce un modello in vivo per studiare l'immunosoppressione delle cellule T umane. Inoltre, descriviamo come rilevare le cellule T umane nei tessuti con la PCR digitale come strumento per quantificare l'immunosoppressione.

Abstract

La malattia acuta di innesto contro ospite (GVHD) è una limitazione significativa per i pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche come terapia per carenze ematologiche e neoplasie. Il GVHD acuto si verifica quando le cellule T donatrici riconoscono i tessuti ospiti come un antigene estraneo e montano una risposta immunitaria all'ospite. Gli attuali trattamenti riguardano farmaci immunosoppressori tossici che rendono i pazienti suscettibili di infezione e recidiva. Così, C'è ricerca in corso per fornire una terapia acuta GVHD che può efficacemente indirizzare le cellule T del donatore e ridurre gli effetti collaterali. Gran parte di questo lavoro pre-clinico utilizza il modello murino xenogeno GVHD (xenoGVHD) che consente di testare le terapie immunosoppressive sulle cellule umane piuttosto che murine cellule in un sistema in vivo. Questo protocollo descrive come indurre xenoGVHD e come accecare e standardizzare il punteggio clinico per garantire risultati coerenti. Inoltre, questo protocollo descrive come utilizzare la PCR digitale per rilevare le cellule T umane nei tessuti dei topi, che possono essere successivamente utilizzate per quantificare l'efficacia delle terapie testate. Il modello xenoGVHD non solo fornisce un modello per testare le terapie GVHD, ma qualsiasi terapia che può sopprimere le cellule T umane, che potrebbe quindi essere applicata a molte malattie infiammatorie.

Introduzione

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeniche (HSCT) è diventato un trattamento di routine per i pazienti affetti da neoplasie ematologiche come la leucemia con prognosi infausta. Una complicazione significativa dell'HSCT è la malattia acuta di innesto contro l'ospite (GVHD). Uno studio del 2012 ha riferito che il GVHD acuto si è sviluppato nel 39% dei pazienti con HSCT che hanno ricevuto trapianti da donatori fratelli e 59% dei pazienti sottoposti a trapianto da donatori non correlati1. Il GVHD acuto si verifica quando le cellule T derivate dal donatore attaccano gli organi del destinatario. L'unica terapia di successo per gVHD è il trattamento con farmaci altamente immunosoppressivi2, che sono altamente tossici e aumentano il rischio di infezione e recidiva del tumore. Così, nonostante i miglioramenti che sono stati fatti nella sopravvivenza acuta GVHD negli ultimi anni3,4,5, c'è ancora una necessità critica per il miglioramento delle terapie GVHD con tossicità minima che promuovono la remissione a lungo termine.

L'obiettivo generale dei seguenti metodi è quello di indurre e segnare GVHD xenogeneico (xenoGVHD). Il modello xenoGVHD è stato sviluppato come strumento per indurre GVHD acuto con cellule umane piuttosto che cellule murine permettendo una traduzione più diretta della ricerca GVHD pre-clinica agli studi clinici6. Questo modello prevede l'iniezione per via endovenosa di cellule mononucleari del sangue periferiche umane (PBMC) in topi NOD-SCID IL-2R - null (NSG) irradiati sublethaldalmente. Le cellule T umane iniettate vengono attivate da cellule che presentano antigene umano (APC) che presentano l'antigene murno e le cellule T attivate migrano verso tessuti distanti con conseguente infiammazione sistemica e infine la morte6,7, 8 (IN vio , 9 (in vie , 10. La patologia della malattia e la progressione nel modello xenoGVHD imitano strettamente il GVHD acuto umano. In particolare, le cellule T umane patogene sono reattive a murine principali proteine complesse di istocompatibilità (MHC), che è simile all'alloreattività delle cellule T nel GVHD umano6,9. Il vantaggio principale del modello xenoGVHD rispetto al modello di mismatch MHC del mouse, l'altro modello GVHD ampiamente usato, è che consente di testare le terapie sulle cellule umane piuttosto che sulle cellule murine. Ciò consente di testare i prodotti che possono essere tradotti direttamente in clinica senza alcuna modifica perché sono fatti per indirizzare le cellule umane. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per testare un anti-IL-2 umano11, cellule T regolatorie umane (Tregs)12 e cellule staminali mesenchymiche umane13 come potenziali trattamenti per la GVHD acuta. In un contesto più ampio, questo modello può essere utilizzato come un saggio di soppressione in vivo per qualsiasi farmaco o tipo di cellula che può sopprimere l'attività delle cellule T umane. Ad esempio, Stockis et al.14 hanno utilizzato il modello xenoGVHD per studiare l'effetto del blocco dell'attività soppressiva di Treg in vivo. Pertanto, il modello xenoGVHD può fornire informazioni sul meccanismo di qualsiasi terapia mirata alle cellule T in un ambiente in vivo.

Un ulteriore metodo descritto in questo protocollo è come rilevare le cellule T umane nei tessuti dei topi utilizzando la reazione a catena di polimerasi digitale (dPCR). L'obiettivo di questo metodo è quello di offrire uno strumento per quantificare la migrazione e la proliferazione delle cellule T nei tessuti bersaglio, che misurano l'efficacia delle terapie immunosoppressive testate in questo modello. dPCR è un metodo relativamente nuovo per la quantificazione degli acidi nucleici15. In breve, la miscela di reazione PCR è divisa in partizioni che contengono piccoli numeri della sequenza di destinazione o nessun bersaglio a tutti. La sequenza bersaglio viene quindi amplificata e rilevata utilizzando coloranti intercalari del DNA o sonde fluorescenti specifiche del bersaglio. dPCR quantifica il numero di copie della sequenza di destinazione in base alla frazione di partizioni positive e alle statistiche di Poisson15,16. Il rilevamento delle cellule T con dPCR richiede molto meno tessuto rispetto ad altri metodi alternativi, tra cui citometria di flusso e istologia, e può essere eseguito su tessuto congelato o fisso. dPCR non richiede una curva standard per determinare i numeri di copia, né sono necessarie repliche tecniche. In questo modo si riduce la quantità di DNA di reagente e modello necessaria per il dPCR rispetto al tradizionale PCR quantitativo (qPCR)16. Partizionare la reazione PCR in sottoreazioni in dPCR concentra efficacemente gli obiettivi17. Pertanto, dPCR è principalmente uno strumento per il rilevamento di bersagli rari in una grande quantità di DNA non bersaglio. Ad esempio, dPCR viene utilizzato per rilevare la contaminazione batterica nel latte18, identificare rare mutazioni nel gene del recettore degli estrogeni19e rilevare il DNA tumorale circolante nel sangue dei pazienti20. In questo protocollo, dPCR funge da strumento efficiente per rilevare e quantificare le cellule T umane nei tessuti di topi con xenoGVHD.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità, e con l'approvazione dell'University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tutti i campioni di sangue umano sano sono stati ottenuti sotto il consenso informato e con l'approvazione da parte dell'Institutional Review Board presso l'Università del Kansas Medical Center.

1. Irradiazione di topi NSG

  1. Un giorno prima dell'iniezione DI PBMC, irradiano vecchi topi NSG da 8 a 12 settimane (entrambi i sessi possono essere usati). In un armadio sterile di biosicurezza, posizionare i topi in una gabbia sterilizzata o in un microisolatore. irradiare topi in una fonte di Cs137 o in un piccolo irradiatore animale (ad esempio, RS 2000) con una dose totale di 150 cGy con rotazione lenta per garantire anche l'irradiazione.
  2. Mettere i topi in gabbie pulite in un armadio sterile di biosicurezza.

2. Preparazione del PBMC umano per l'iniezione

  1. Raccogliere abbastanza sangue umano sano da isolare 1,1 x 107 PBMC per topo. Diluire il sangue eparanato in un volume uguale del 2% di siero bovino fetale (FBS) in fosfato bufferizzato salina (PBS).
    NOTA: Con questo protocollo, la resa del PMBC è generalmente 0,5–1 x 107 per 10 mL di sangue intero. Ogni mouse riceverà 107 PBMC in 100 , l'l di PBS. L'extra 1 x 106 su 10 l per mouse assicura che ogni mouse riceva l'intero dosaggio di PBMC, in caso di problemi con il riempimento delle siringhe.
  2. Aggiungere 15 mL di densità di separazione dei linfociti media per il gradiente medio (ad esempio, Ficoll) a un tubo conico da 50 mL, quindi sovrapporre con cura fino a 25 mL di sangue diluito sopra il gradiente di densità. Centrifugare il tubo contenente gradiente di densità e sangue diluito a 400 x g per 40 min a temperatura ambiente senza freno.
  3. Raccogliere l'interfaccia PBMC in 10 mL di PBS in un tubo conico da 50 mL. Centrifugare le cellule a 400 x g per 10 min. Rimuovere il supernatante.
  4. Allenta il pellet sfogliando il tubo e risospende nuovamente in PBS da 10 mL per lavare il PBMC. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min.
  5. (Facoltativo) Eliminare il globulo rosso (RBC) supernatante e liscile nel pellet cellulare aggiungendo un volume di buffer di lisi di ammonio-cchiuro-potassio (ACK) che è uguale al volume di pellet. Risospendere delicatamente il pellet e ruotare il tubo per 30-60 s. Tubo di riempimento con supporti RPMI senza sè e centrificare il tubo a 400 x g per 5 min.
  6. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 5 mL di PBS. Contare le cellule usando l'esclusione blu trypan con un emocitometro e un microscopio.
  7. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e rimettere in sospensione le cellule a 1 x 108 cellule / mL in PBS.

3. Iniezione retroorbitale di PBMC umano nei topi21

  1. Mettere una camera di anestesia in un cappuccio a flusso laminare per mantenere la sterilità. Pre-carica della camera di anestesia con 5% di isoflurane e 1 l/min di flusso di ossigeno per 5 min.
  2. Ridurre l'isoflurane al 2% e mettere i topi dalla stessa gabbia nella camera di anestesia. Una volta che i topi perdono il rinfarto, anestesizzano i topi per 5 min in camera. Durante questo periodo, pre-riempire la siringa con 100 (1 x 107 celle) di sospensione cellulare.
  3. Posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento con il naso in un cono naso per mantenere l'anestesia. Controllare la perdita di coscienza pizzicando una pedana e controllando la mancanza di riflesso.
  4. Restringere il mouse con il pollice e il dito medio. Inserire il 28 G 1/2 nell'ago con la smussata laterale al canto mediale, attraverso la membrana congiuntivale fino a raggiungere la parte posteriore dell'occhio. Ritrarre leggermente l'ago e iniettare lentamente 100 .L di cellule (1 x 107 cellule).
  5. Ritrarre completamente l'ago e smaltire correttamente la siringa e l'ago. Chiudere la palpebra e applicare una leggera pressione al sito di iniezione con una spugna di garza.
  6. Esaminare il sito di iniezione per il gonfiore o altri traumi visibili. Permettere al topo di riprendere coscienza in una gabbia sterile rivestita con asciugamani di carta per evitare l'aspirazione di biancheria da letto prima di trasferirsi in gabbia di casa. Dopo che qualsiasi sanguinamento si è fermato, applicare una singola goccia di proparacaina all'occhio per l'analgesia.
    NOTA: L'iniezione di vena tail è un metodo alternativo di iniezione endovenosa di PBMC per questo protocollo come descritto da Macholz et al.22.

4. Punteggio clinico del GVHD acuto nei topi (Figura 1)23

  1. Misurare il punteggio GVHD a giorni alterni fino a quando i topi raggiungono un punteggio di un 2 e poi ogni giorno fino al giorno di sacrificio.
    1. Mettere la gabbia in un cappuccio laminare, rimuovere il cibo e l'acqua e rimettere il coperchio. L'attività del punteggio osservando i mouse per 5 minuti e assegnare i punteggi come segue: 0 - il mouse inizia a camminare entro un paio di minuti e continua a camminare intorno alla gabbia, 1 mouse prende più di un paio di minuti per alzarsi e cammina lentamente intorno gabbia, 2 - il mouse non si alza in 5 min e cammina solo quando toccato.
  2. Pesare ogni mouse in un becher di vetro e dare un punteggio di perdita di peso: 0 - <10% di cambiamento, 1 - 10-25% cambiamento e 2 > 25% cambiamento.
  3. Mentre il topo è ancora nel becher, ispezionare per la postura: 0 - normale, 1 - curvo a riposo, 2 - curvo altera il movimento; texture di pelliccia: 0 - normale, 1 - da lieve a moderata ruffling, 2 - ruffling grave, e l'integrità della pelle : 0 - normale, 1 spuntato delle zampe / coda, 2 - aree evidenti di pelle denudata (guarda orecchie, coda e zampe per il ridimensionamento).
  4. Con cinque categorie e un punteggio di 0–2 per ogni categoria, un mouse può raggiungere un punteggio massimo di 10. Quando un topo raggiunge un punteggio di 7 o superiore o raggiunge 42 giorni dopo l'iniezione, eutanasia topo tramite eutanasia CO2 o altro metodo approvato dal Comitato locale per la cura e l'uso degli animali.
    NOTA: Per garantire l'accuratezza dei risultati, il punteggio viene eseguito da un ricercatore che è accecato ai gruppi di trattamento24. Inoltre, anche se >20% della perdita di peso corporeo è l'endpoint umano raccomandato per molti protocolli IACUC, con ulteriore giustificazione iACUC approvazione di questo protocollo può essere ottenuto.

5. Raccolta di tessuti per il DNA genomico da topi eutanasia e isolare il DNA genomico

  1. I topi dissetati che utilizzano strumenti chirurgici sterili. Tagliare un piccolo pezzo di tessuto di circa 3 mm x 0,5 mm di dimensione da un organo di interesse, ad esempio, polmone, fegato o milza. Pesare il campione di tessuto e posizionare il pezzo di tessuto in un tubo sterile da 1,5 mL. Se si raccolgono più tessuti, lavare gli utensili con etanolo tra il taglio di ogni organo.
  2. Congelare i tessuti immergendo i tubi contenenti il tessuto in azoto liquido fino a quando non smette di ribollire e conservare in -80 gradi durante la notte. Scongelare i campioni di tessuto e liverli secondo un kit di isolamento del DNA genomico (gDNA).
  3. Isolare il DNA genomico secondo le istruzioni del produttore come descritto nel kit. Assicurarsi di notare la quantità di tessuto che è stato elaborato per microlitro di gDNA eluito (mg/L).
    NOTA: I tessuti congelati possono essere conservati a -80 gradi centigradi per l'elaborazione in un secondo momento.

6. Quantificazione delle cellule T umane utilizzando PCR digitale (Figura 2)

  1. Preparare le reazioni PCR digitali secondo il protocollo per i coloranti di legame del DNA per la macchina PCR digitale in uso. Utilizzare i seguenti primer specifici per il DNA genomico dell'epsilon CD3 umano (NCBI Reference Sequence: NG_007383.1); Primer in avanti: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, Inverti primer: GCCCTACCAGCTGGGGAAAC. Questi primer produrranno una singola banda di 105 bp.
    NOTA: Aggiungere 0,5 l di un enzima di restrizione, come HindIII, ad ogni reazione per digerire il DNA genomico. Assicurarsi di testare diverse diluizioni gDNA per ottimizzare la separazione delle goccioline positive e negative. Inoltre, un sottoinsieme di cellule T infiltranti può essere cellule T regolatorie non patogene. Queste cellule possono essere quantificate utilizzando primer aggiuntivi per marcatori di cellule T regolatori.
  2. Eseguire la reazione PCR digitale nelle seguenti condizioni: Coperchio a 105 gradi centigradi, 95 gradi centigradi per 10 min (1 ciclo); 95 s per 30 s, rampa 2 C/s e 55 gradi c per 1 min, rampa 2 C /s (40 cicli); 72 gradi centigradi per 10 min, 12 gradi centigradi.
    NOTA: potrebbe essere necessario regolare questi parametri in base alle apparecchiature PCR digitali.
  3. Acquisire dati PCR digitali con software di analisi. Riportare i dati come numero di copie per mg di tessuto utilizzando la seguente equazione: (numero di copie/l) x (L di gDNA in reazione) x (fattore di diluizione)/(mg del tessuto/l del gDNA totale)

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Risultati

I vecchi topi NSG da 8-12 settimane irradiati sottolethaltale di entrambi i sessi che hanno ricevuto il PBMC umano hanno iniziato a mostrare segni clinici di GVHD intorno al giorno 10 dopo l'iniezione rispetto ai topi di controllo negativi che ricevevano solo PBS (Figura 1A). Mouse XenoGVHD ha avuto una sopravvivenza mediana di 23,5 giorni (Figura 1B). Con la PCR digitale, le cellule T umane positive dell'epsilon CD3 potrebbero e...

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Discussione

La progressione della malattia è generalmente coerente nel modello xenoGVHD, anche con l'iniezione di PBMC da donatori diversi, in modo da poter combinare più esperimenti. I passaggi chiave necessari per mantenere questa coerenza sono la tecnica di iniezione i.v. corretta, il punteggio accecante e coerente. Uno studio di Nervi et al.25 ha dimostrato che rispetto all'iniezione di vena della coda per via endovenosa, le iniezioni retroorbitali di PBMC hanno provocato un innesto più coerente e un GVHD...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

Vorremmo riconoscere il laboratorio di Lane Christenson per la fornitura della macchina PCR digitale utilizzata in questi esperimenti e per il supporto tecnico fornito. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Thomas Yankee per la sua guida e mentoring. Questi studi sono stati sostenuti dalla Tripp Family Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette Eppendorf da 1,5 mLFisher05-408-129
Pipetta sierologica da 10 mLVWR International89130-898
10mL BD Vacutainers - Verde con tappo con eparina sodicaBecton Dickinson366480
250 &; L Puntali per pipette Ranin17001118 RaininNon utilizzare altre pipette o puntali per pipette per la generazione di goccioline
Provetta conica da 50 mLVWR International89039-656
Piastra ddPCR a 96 pozzettiBio-Rad12001925
ACK (Ammonio-Cloruro-Potassio) Tampone di lisiLonza10-548E
Salviette imbevute di alcolFisher Scientific6818
Camera per anestesiaWorld Precision InstrumentsEZ-178Fornito dalla struttura per animali
Macchina per anestesiaParkland ScientificPM1002Fornito dalla struttura per animali
BD Vacutainer Safety-Lok Set per la raccolta del sangueBecton Dickinson367281
DG8 Cartucce e guarnizioni per generatore di gocce QX100/QX200Bio-Rad1864007
Tecnologie di vitaH2O di grado molecolare libero da DNAsi e RNAsi1811318
Alcool etilico, puro, a prova di 200, per biologia molecolareSigma-AldrichE7023-500ML
Siero fetale bovinoAtlanta BiologicalsS11150
FicollFisher Scientific45001750
Siringa da insulinaFisher Scientific
IsofluranoSigma-AldrichCDS019936Fornito da struttura animale
Azoto liquidoN/AN/A
Irradiatore per topi Gabbia per torteBraintree Scientific, Inc.MPC 1Contiene fino a 11 topi
Nexcare Gentle Paper Tape (noto anche come nastro chirurgico 3M Micropore / 3/4")Fisher Scientific19-027-761
P1000 pipetmanMidSciA-1000
P200 pipetmanMidSciA-200
Forceable Foil Heat SealBio-Rad1814040
Pipetaid Gilson MacromanFisher Scientific
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805Non utilizzare altre pipette o puntali per pipette per la generazione di goccioline
Kit per sangue e tessuti Qiagen DNeasy PiastreqPCR Qiagen69506
VWR International89218-292
QX200 Droplet Digital PCR SystemBio-Rad12001925Include generatore di gocce, lettore di gocce, computer portatile, software, materiali di consumo per componenti associati, per applicazioni EvaGreen o PCR digitale basate su sonda
Olio per la generazione di goccioline QX200 per EvaGreenBio-Rad1864006
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad1864033
Guarnizione per piastre priva di RNasi e DNasiThermo Scientific12565491
RPMI Advanced 1640Life Technologies12633012
Garze sterili (2" x 2", 12 strati)Fisher Scientific67522
Soluzione salina sterile tamponata con fosfatoFisher Scientific21040CV
Serbatoio sterileVWR International89094-662
Forbici chirurgicheKent ScientificINS600393-4
pinza chirurgicaKent ScientificINS650914-4
opzionali 329424F110756

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