Trasporto retrogrado delle proteine di superficie delle cellule di Golgi è essenziale per mantenere l'omeostasi della membrana. Qui, descriviamo un metodo per analizzare biochimicamente trasporti di superficie--Golgi cellulare di proteine ricombinanti utilizzando nanobodies funzionalizzati in cellule HeLa.
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Articolo metodologico
Analisi dell'endocitosi assorbimento e trasporto retrogrado alla rete Trans-Golgi utilizzando Nanobodies funzionalizzati in cellule coltivate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trasporto di proteine e membrane dalla superficie delle cellule di Golgi e oltre è essenziale per l'omeostasi, organello identità e fisiologia. Per studiare il traffico della proteina retrograda, abbiamo recentemente sviluppato un versatile basato su nanobody toolkit per analizzare il trasporto dalla superficie delle cellule al complesso di Golgi, mediante imaging cellulare fisso e dal vivo, da microscopia elettronica, o biochimicamente. Abbiamo progettato funzionalizzati anti-verde proteina fluorescente (GFP) nanobodies — raccoglitori di proteine ad alta affinità, monomerico e piccoli — che possono essere applicati alle linee cellulari che esprimono le proteine di membrana di interesse con una parte extracellulare di GFP. Derivatizzato nanobodies associato ai reporter GFP sono specificamente interiorizzato e trasportato sulle spalle lungo rotte ordinamento il reporter. Nanobodies sono stati funzionalizzati con fluorofori seguire trasporto retrogrado mediante microscopia a fluorescenza e immagini, con ascorbato perossidasi 2 (APEX2) per studiare la localizzazione ultrastrutturale dei reporter-nanobody complessi da elettrone dal vivo microscopia e con motivi di solfatazione (TS) di tirosina per valutare la cinetica dell'arrivo di trans-Golgi network (TGN). In questo articolo metodologico, descriviamo la procedura generale per batterico esprimere e purificare nanobodies funzionalizzati. Vi illustriamo l'uso potente del nostro strumento utilizzando il nanobodies mCherry - e TS-modificato per analizzare l'assorbimento endocitosi e TGN arrivo di proteine cargo.
Introduzione
Retrogrado traffico di proteine e di lipidi dalla superficie delle cellule ai vari compartimenti intracellulari è cruciale per il mantenimento dell'omeostasi di membrana per controbilanciare la secrezione e riciclare componenti di anterograda trasporto macchinari1 , 2. a seguito di internalizzazione tramite endocitosi clatrina-dipendente o - indipendente, carico della proteina e del lipido innanzitutto popolare presto endosomes da dove si trovano ulteriori reindirizzamento sia lungo il sistema endolisosomiale, riciclato alla membrana plasmatica, o mirati alla rete trans-Golgi (TGN). Riciclaggio da endosomi e/o....
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Protocollo
1. batterica trasformazione con Nanobodies funzionalizzati
Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato per l'espressione, la purificazione e l'analisi di nanobodies funzionalizzati anti-GFP come descritto in precedenza30. Derivatizzazione con altre parti di proteine potrebbero essere necessarie modifiche del presente protocollo standard.
- Scongelare i batteri chemocompetent (~ 100 µ l) adatti per l'espressione della proteina (ad es., Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) cellule) posizionandoli sul ghiaccio.
Nota: Preparare chemocompetent cellule batteriche secondo....
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Risultati
Per studiare il trasporto retrogrado proteina per varie destinazioni intracellulare, recentemente abbiamo stabilito uno strumento anti-GFP nanobody per etichettare e seguire le proteine di fusione ricombinante dalla superficie cellulare30. Qui, dimostriamo la produzione batterica di tali derivatizzati nanobodies e dimostrare la loro applicazione per studiare l'assorbimento endocitosi di microscopia di fluorescenza e immunoblotting, nonché il loro uso di investigare.......
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Discussione
Nanobodies rappresentano una classe emergente di proteina legante ponteggi con molti vantaggi rispetto ai convenzionali anticorpi: sono piccole, stabile, monomerico, possono essere selezionati per legami disolfuro ad alta affinità e mancanza33,35, 44 , 45. sono utilizzati in numerose applicazioni, come nei sistemi di coltura delle cellule e negli organismi in biologia dello sviluppo
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da Grant 31003A-162643 di Swiss National Science Foundation. Ringraziamo Nicole Beuret e Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) per il supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-GFP | Sigma-Aldrich | 118144600001 | Il prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche |
| Anti-His6 anticorpo | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| Anticorpo anti-actina | EMD Millipore | MAB1501 | |
| Capra anti-coniglio HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| Capra anti-topo HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | disciolto in 1x PBS/1%BSA |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Applichem | A3672 | |
| D-biotina | Sigma-Aldrich | B4501 | disciolto in 500 mM sterile NaH2PO4 o DMSO |
| acido 5-amminolevuilnico (dALA) cloridrato | Sigma-Aldrich | A3785 | disciolto in acqua sterile |
| DNasi I | Applichem | A3778 | disciolto in acqua sterile |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | 18037059001 | Prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
| Puromicina | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Penicillina/Streptomicina | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| L-glutammina | Applichem | A3704 | |
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
| Sulfur-35 come solfato di sodio | Hartmann Analytics | ARS0105 | Prodotto contiene 5 mCi |
| Sali bilanciati di Earle Soluzione | di aminoacidi Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM (50x) | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM soluzione vitaminica (100x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete, Mini cocktail di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | disciolto in acqua sterile, stock è 1 M |
| Carbenicillina sale disodico | Applichem | A1491 | disciolto in acqua sterile, lo stock è di 100 mg/mL |
| di Kanamicina solfato | Applichem | A1493 | disciolto in acqua sterile, lo stock è di 100 mg/mL |
| Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Applichem | A3813 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| Le sue colonne GraviTrap | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
| Il suo kit tampone | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| Colonne di desalinizzazione PD10 monouso | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15 pozzetti | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) senza Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| piastre da 35 mm | Falcon | 353001 | |
| piastre a 6 pozzetti | TPP | 92406 | |
| Vetrini coprioggetti in vetro (n. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
| Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | disciolto in 40% DMSO 60% isopropanolo, stock in 500 mM |
| Tryptone | Applichem | A1553 | |
| Estratto di lievito | Applichem | A1552 | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Merck Millipore | 105833 | disciolto in acqua sterile, stock è 1 M |
| Cloruro di calcio diidrato | Merck Millipore | 102382 | disciolto in acqua sterile, stock è 1 M |
| Cloruro di sodio | Merck Millipore | 106404 | disciolto in acqua sterile, stock 5 M |
Riferimenti
- Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
- Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-5....
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Ristampe e permessi
