Questo protocollo permette la visualizzazione dell'espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l'obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.
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Articolo metodologico
Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli ultimi anni, è stato rilasciato un genoma di bozza per la caverna cieca messicano (Astyanax mexicanus), rivelando l'identità di sequenza per migliaia di geni. Ricerca priore in questo sistema modello emergente capitalizzati sulle indagini di genoma complete che hanno identificato numerosi loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) associati con vari fenotipi di grotta-collegata. Tuttavia, la capacità di connettersi alla base ereditabile per cambiamento fenotipico di geni di interesse rimane una sfida significativa. Una tecnica che può facilitare la comprensione più profonda del ruolo di sviluppo in troglomorfiche evoluzione è intero-monta l'ibridazione in situ. Questa tecnica può essere implementata per confrontare l'espressione genica tra forme e superficie-caverne, nominare candidato geni alla base di QTL stabilito, identificare geni di interesse dagli studi di sequenziamento di nuova generazione o sviluppare altri direttamente approcci basati sulla scoperta. In questo rapporto, presentiamo un protocollo semplice, supportato da una lista di controllo flessibile, che può essere ampiamente adattato per l'uso ben oltre il sistema di studio presentato. Si spera che questo protocollo può servire come una vasta risorsa per la comunità di Astianatte e oltre.
Introduzione
L'ibridazione in situ è un metodo comune per la colorazione di tessuti fissi per visualizzare gene expression pattern1. Questa tecnica è stata eseguita per anni in altri tradizionali2 e sistemi di modello non tradizionali3 , per una varietà di studi biologici. Tuttavia, diversi passi e reagenti sono necessari per eseguire correttamente questa procedura. Per i ricercatori che non hanno mai eseguito questa tecnica, dando inizio al processo può essere intimidatorio a causa i molti passaggi. Ulteriormente, la natura lunga di questa procedura si presta ad errori tecnici, che possono essere difficile da....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati (protocollo n. 10-01-21-01).
1. fissazione
- Isolare il numero desiderato di Astyanax mexicanus embrioni da un serbatoio di allevamento e difficoltà ~ 50 embrioni alla volta. Se gli embrioni sono grandi e vecchi, può essere necessario fissare 25 alla volta per garantire anche fissazione.
- A seconda dell'età dell'embrione, utilizzare il metodo IACUC-approvato dell'anestesia. Per vecchi embrioni con un sistema nervoso funzionante, sacrificare embrioni tramite overdose di anestetico. Di....
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Risultati
In questo rapporto, forniamo un approccio semplice e diretto per eseguire etichettatura delle embrionali Astyanax campioni per analisi di espressione genica di alta qualità. Questa tecnica può essere effettuata in quattro o cinque giorni, e ogni passaggio principale della procedura è rappresentata in un diagramma di flusso con codifica a colori (Figura 1). Una volta completato, macchiati embrioni dovrebbero harbor un'etichetta cromatica viola scura n.......
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Discussione
A causa della vulnerabilità di RNA alla degradazione, una delle fasi più critiche nel protocollo riguarda la sintesi sterile della sonda RNA. Tuttavia, se una sonda è generata con attenzione e fornisce buoni risultati, può essere riutilizzato nelle successive reazioni di colorazione. Un secondo punto cruciale è la produzione accurata di tutti i reattivi utilizzati in tutto il protocollo. Poiché questo protocollo coinvolge diversi giorni e molti piccoli passi, è essenziale che tutti i reagenti sono accuratamente prodotte .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio lordo per utili commenti su questo manoscritto. Vogliamo riconoscere quattro studenti delle scuole superiori che hanno utilizzato questo protocollo durante stage estivi nel 2017 e 2018, tra cui Christine Cao, Michael Warden, Aki Li e David Nwankwo. HL è stato sostenuto da una borsa di studio UC biologia staminali durante l'estate del 2017. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della National Science Foundation (DEB-1457630 a JBG) e il National Institutes of Dental e Craniofacial Research (NIH; DE025033 a JBG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipetta sierologica da 10 mL | VWR | 89130-888 | |
| Unità di filtrazione da 1000 mL | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL conica | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| Pipetta sierologica da 25 mL | VWR | 89130-890 | |
| Unità di filtrazione da 250 mL | VWR | 89220-694 | |
| Pipetta sierologica da 5 mL | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL conico | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Unità di filtrazione | VWR | 89220-696 | |
| Anti-digossigenina-AP, Fab frammenti | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Soluzione bloccante | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Acido citrico | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| Kit di etichettatura dell'RNA DIG (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Etanolo | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Fiale dram in vetro | VWR | 66011-041 | 1 |
| Pipette in vetro | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Eparina | Sigma | H3393-25KU | |
| Cloruro di magnesio-cristallino | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Acido maleico | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Metanolo | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Acqua di grado molecolare (senza RNasi) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| Pellet di NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrato in polvere | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Siero di capra normale | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Miscelatore Nutante | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinasi K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Pipette in plastica | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Bagno d'acqua con agitazione 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Agitatore analogico standard | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Lievito | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Cloruro di litio (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
Riferimenti
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as r....
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Ristampe e permessi
