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Articolo metodologico

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

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DOI:

10.3791/59114

⸱

2 marzo 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo permette la visualizzazione dell'espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l'obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.

Abstract

Negli ultimi anni, è stato rilasciato un genoma di bozza per la caverna cieca messicano (Astyanax mexicanus), rivelando l'identità di sequenza per migliaia di geni. Ricerca priore in questo sistema modello emergente capitalizzati sulle indagini di genoma complete che hanno identificato numerosi loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) associati con vari fenotipi di grotta-collegata. Tuttavia, la capacità di connettersi alla base ereditabile per cambiamento fenotipico di geni di interesse rimane una sfida significativa. Una tecnica che può facilitare la comprensione più profonda del ruolo di sviluppo in troglomorfiche evoluzione è intero-monta l'ibridazione in situ. Questa tecnica può essere implementata per confrontare l'espressione genica tra forme e superficie-caverne, nominare candidato geni alla base di QTL stabilito, identificare geni di interesse dagli studi di sequenziamento di nuova generazione o sviluppare altri direttamente approcci basati sulla scoperta. In questo rapporto, presentiamo un protocollo semplice, supportato da una lista di controllo flessibile, che può essere ampiamente adattato per l'uso ben oltre il sistema di studio presentato. Si spera che questo protocollo può servire come una vasta risorsa per la comunità di Astianatte e oltre.

Introduzione

L'ibridazione in situ è un metodo comune per la colorazione di tessuti fissi per visualizzare gene expression pattern1. Questa tecnica è stata eseguita per anni in altri tradizionali2 e sistemi di modello non tradizionali3 , per una varietà di studi biologici. Tuttavia, diversi passi e reagenti sono necessari per eseguire correttamente questa procedura. Per i ricercatori che non hanno mai eseguito questa tecnica, dando inizio al processo può essere intimidatorio a causa i molti passaggi. Ulteriormente, la natura lunga di questa procedura si presta ad errori tecnici, che possono essere difficile da risolvere.

L'obiettivo generale di questo articolo è di presentare un metodo semplice e diretto che renderà accessibile ad un vasto pubblico questa tecnica di ibridazione. Per ridurre l'introduzione di errori, vi presentiamo un approccio diretto che produce alta qualità gene espressione macchiatura e riduce al minimo segnale di fondo non specifici. Questa procedura è simile ad altri approcci sviluppati in sistemi modello tradizionale, come Danio rerio4. Qui, ci proponiamo di facilitare l'implementazione attenta di ogni passo usando una lista scaricabile (Supplemental File 1), per promuovere attenzione l'attuazione del protocollo. La spiegazione razionale per questa operazione è quello di facilitare organizzazione attraverso i molti passaggi di questa procedura. Questo articolo è adatto per i ricercatori interessati a condurre l'ibridazione in situ del intero-supporto nello sviluppo di embrioni, ma non hanno ancora eseguito la procedura. Il vantaggio dell'approccio scelto per i ricercatori Astyanax è che è stato testato e dimostrato in caverna e superficie pesce morph, facilitando in tal modo l'analisi dell'espressione comparativa. Il metodo presentato può essere utilizzato dai ricercatori negli studi su Astyanax e altri sistemi.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati (protocollo n. 10-01-21-01).

1. fissazione

  1. Isolare il numero desiderato di Astyanax mexicanus embrioni da un serbatoio di allevamento e difficoltà ~ 50 embrioni alla volta. Se gli embrioni sono grandi e vecchi, può essere necessario fissare 25 alla volta per garantire anche fissazione.
  2. A seconda dell'età dell'embrione, utilizzare il metodo IACUC-approvato dell'anestesia. Per vecchi embrioni con un sistema nervoso funzionante, sacrificare embrioni tramite overdose di anestetico. Di conseguenza, posizionare gli embrioni in una soluzione di ~ 1% tricaina (tamponato a pH 7.4) per ridurre al minimo il dolore e il disagio per l'organismo.
  3. Una volta che gli embrioni sono insensibili al tatto, sistema acqua contenente tricaina di sostituire e aggiungere ~ 1 mL di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4): 1x.
  4. Rimuovere la soluzione di PBS e aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA). Difficoltà embrioni durante la notte a 4 ° C.
    Attenzione: PFA è pericoloso (vale a dire, è infiammabile ed è una pelle e polmone irritante), maneggiare con cura.

2. disidratazione

  1. Per disidratare gli embrioni, rimuovere la soluzione fissante e sciacquare con 1 mL di PBS. Posizionare fiale contenenti embrioni ad un angolo (tra 30° e 45°), su un agitatore di piattaforma durante il risciacquo. Continuare a lavare gli embrioni due volte, 5 min a lavaggio.
  2. Se gli embrioni hanno ancora un corion, collocare 50 tutti gli embrioni in un 100 mm x 25 mm piastra di Petri e attentamente isolarli da chorions utilizzando due set di Pinzette da orologiaio (ad es., #5 forcipe) sotto un microscopio.
    Nota: Durante la procedura descritta qui sotto e per il resto del protocollo, con attenzione rimuovere tutto il liquido dal passaggio precedente utilizzando pulito, vetro Pasteur pipette prima di aggiungere la soluzione successiva
  3. Disidratare gli embrioni in una serie di lavaggi sempre più concentrate di metanolo (MeOH) descritto di seguito. Le diluizioni sono basate su un volume totale di 1 mL con 500 µ l di soluzione andando in ogni flaconcino di vetro da 4 mL. Eseguire tutti i passaggi di disidratazione a temperatura ambiente (TA) su shaker a piattaforma.
    1. Rimuovere con attenzione la soluzione PBS. Aggiungere una soluzione al 25% MeOH (250 µ l di MeOH) + 750 µ l di PBS. Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.
    2. Rimuovere con attenzione la soluzione di MeOH 25%. Aggiungere una soluzione di 50% MeOH (500 µ l di MeOH) + 500 µ l di PBS. Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.
    3. Rimuovere con attenzione la soluzione di MeOH 50%. Aggiungere una soluzione di MeOH 75% (750 µ l di MeOH) + 250 µ l di PBS. Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 minuti.
    4. Rimuovere con attenzione la soluzione di MeOH 75%. Aggiungere una soluzione di MeOH 100% (1 mL di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min, ripetere questo passo 3 volte.
  4. A questo punto, conservare gli embrioni disidratati, come necessario, in loro fiale di vetro a-20 ° C (lungo termine). In alternativa, procedere direttamente al giorno 1 del protocollo.

3. giorno 1: reidratazione

  1. Ottenere embrioni disidratati dal congelatore a-20 ° C (o procedere direttamente dal punto 2.5).
  2. Ordinare gli embrioni utilizzando una pipetta Pasteur. Uno può ordinare basata su morfotipo (cioè, grotta e/o superficie), e il numero di geni valutati in ogni esperimento. Non ci sono solitamente non più di 12 embrioni per flaconcino una volta ordinato. Per mantenere l'organizzazione, è possibile utilizzare nastro colorato laboratorio per designare i flaconcini e le pipette per ciascun gene. Gli embrioni rimarranno nel flacone stesso in tutto l'intero protocollo.
    Nota: Posto la punta della pipetta Pasteur in 100% EtOH per sterilizzarlo tra utilizza.
  3. Impostare un bagnomaria con agitazione a 70 ° C deve essere utilizzato in un passaggio successivo. Attentamente, tirare fuori il MeOH in fiale di embrioni ordinati e sostituire con 500 µ l di nuovo 100% MeOH. Lavare brevemente (~ 1 min) su shaker a piattaforma.
  4. Reidratare embrioni in una crescente concentrazione di 1X PBS con Tween 20 (PBT, vedi sotto) su shaker a piattaforma. Le diluizioni sono basate su un volume di diluizione finale di 1 mL con 500 µ l in ogni flaconcino.
    1. Aggiungere una soluzione al 25% PBT (250 µ l di PBT, 750 µ l di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.
    2. Rimuovere con attenzione la soluzione PBT 25%. Aggiungere una soluzione al 50% PBT (500 µ l di PBT, 500 µ l di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.
    3. Rimuovere con attenzione la soluzione di 50% PBT. Aggiungere una soluzione di 75% PBT (750 µ l di PBT, 250 µ l di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.
    4. Rimuovere con attenzione la soluzione PBT di 75%. Aggiungere una soluzione al 100% PBT (1 mL di PBT). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min, ripetere questo passo 3 volte.

4. giorno 1: Digestione e fissazione

  1. Preparare una soluzione di K (PK) proteinasi aggiungendo 1 µ l di PK (20 mg/mL) a 2 mL di PBT.
  2. In previsione di passaggi successivi, è possibile ottenere le aliquote congelate di buffer di ibridazione (IBRID - e Ibrid +; vedere Supplemental File 2 e 3 File supplementare) e PFA da stoccaggio-20 ° C.
    1. Consentire PFA scongelare a TA.
    2. Porre le aliquote di ibrid - e Ibrid + in un bagno di acqua 70 ° C rotante. Posizionare tutti i reagenti e fiale all'interno di un piccolo "guarnizione" con un fondo di rete, all'interno l'apparecchio del bagno d'acqua galleggianti. In questo modo semplice aggiunta e rimozione di tubi e flaconi dal bagno di acqua rotante di 70 ° C.
  3. Aggiungere delicatamente la soluzione PK per il o i flaconcini di embrioni garantendo tutti i tessuti sono completamente ricoperti di soluzione. Digerire gli embrioni per ~ 12 min in soluzione di lavoro di PK nell'agitatore di piattaforma.
    Nota: La lunghezza di digestione può essere variata dallo sperimentatore per garantire risultati ottimali.
  4. Sfilare delicatamente la soluzione PK e brevemente inondare il flaconcino con PBT per diluire qualsiasi restante PK.
  5. Erogare la soluzione PBT e sostituire con 500 µ l di nuovo PBT. Lasciare la soluzione di sciacquare l'agitatore di piattaforma per 5 min.
  6. Disegnare i PBT e sostituire con 500 µ l di scongelati 4% PFA. Consentire gli embrioni a incubare per 20 minuti sull'agitatore piattaforma a TA.
  7. Prelevare il 4% PFA e brevemente inondare il flaconcino con PBT per diluire qualsiasi PFA rimanente. Sfilare il PBT e sostituire con 500 µ l di PBT fresco. Consentire gli embrioni sciacquare per 5 minuti sull'agitatore piattaforma. Ripetere questo passaggio 4 volte di più.

5. giorno 1: Prehybridization

  1. Posto 500 µ l di pre-riscaldato IBRID-soluzione nel flaconcino. Con attenzione è possibile posizionare la cuvetta nei 70 ° C acqua bagno (all'interno di guarnizioni) senza agitazione, per 5 min.
  2. Erogare la soluzione di ibridazione e inondare il flaconcino con 500 µ l di soluzione Hyb + pre-riscaldato. Posizionare la cuvetta indietro nel bagno di acqua 70 ° C con agitazione (40 giri). Incubare per entrambi 4 h, o durante la notte.
    Nota: Un'incubazione di 4 h produrrà un protocollo completo in situ che durerà per 4 giorni in totale. Qui, questo passo si presenta come un'incubazione overnight, che produrrà un protocollo di durata di 5 giorni in totale.

6. giorno 2: ibridazione

  1. Introdurre un'aliquota di ibrid + dal congelatore a-20 ° C in agitazione bagno acqua calda per 5 min.
  2. Sfilare il Hyb + dal flaconcino e sostituire con 500 µ l di pre-riscaldato Hyb +. A questa soluzione, aggiungere con cautela 2 µ l di sonda RNA per ogni flaconcino. Agitare delicatamente il flaconcino per garantire una distribuzione omogenea della sonda.
  3. Incubare la soluzione Hyb + (con sonda aggiunto) nel bagno d'acqua calda di 70 ° C per una notte mentre si stringono a 40 giri/min.
    Nota: Si può riutilizzare soluzione Hyb + (con sonda). Per questo, prendere Hyb + con sonda dalla prima esecuzione dal congelatore a-20 ° C e posto in una vasca di acqua calda per 5 min, Sostituisci Hyb + dal giorno 1 protocollo con Hyb + con sonda e consentire l'incubazione durante la notte in bagno di acqua calda.

7. giorno 3: Preparazione soluzione

  1. Preparare le provette microcentrifuga etichettate Hyb + con la sonda RNA "gene di interesse". Preparare la serie di diluizioni che verranno utilizzati durante il giorno 3.
    1. Utilizzando 6 tubi separati, preparare la seguente serie di diluizioni di ibrid - e salino sodio citrato (SSC, 0-100%) in un volume di 1 mL e posto nei 70 ° C in agitazione acqua vasca: tubo 1 = 100% IBRID-(1 mL di ibrid-): tubo 2 = 25% 2 x SSC (250 µ l di 2 x SSC, 750 µ l di ibrid-); Tubo 3 = 50% 2 x SSC (500 µ l di 2X SSC, 500 µ l di ibrid-); Tubo 4 = 75% 2 x SSC (750 µ l di 2X SSC, 250 µ l di ibrid-); Tubo 5 = 100% 2 x SSC (1 mL di 2 x SSC); Tubo 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL di 0,2 x SSC).
      Nota: Essere vigili della concentrazione di SSC, che cambia da 2x a 0.2 x.
    2. Utilizzando 4 separare tubi, preparare la seguente serie di diluizioni di PBT e SSC in un volume di 1 mL e inserire a RT: tubo 1 = 25% PBT (250 µ l di PBT, 750 µ l di 0.2 x SSC); Tubo 2 = 50% PBT (500 µ l di PBT, 500 µ l di 0,2 x SSC); Tubo 3 = 75% PBT (750 µ l di PBT, 250 µ l di 0,2 x SSC); Tubo 4 = 100% PBT (1mL di PBT).
    3. Preparare una provetta da 2 mL di tampone acido maleico, contenente la soluzione di lavoro di Tween 20 (MABT).
    4. Preparare due provette coniche da 15 mL di soluzione di blocco. In ogni provetta, aggiungere 0,2 g di reagente bloccante a 10 mL di MABT (vedere Supplemental File 4). Posizionare entrambi i tubi un mixer nutante (o shaker a piattaforma) fino al completamente dissolto nella soluzione (fino a 3 h).

8. giorno 3: Rimozione della sonda

  1. Erogare la soluzione Hyb + (con sonda) con un pipetta Pasteur di vetro e posizionarlo in una sterile, etichettato microcentrifuga. Conservare questo tubo nel congelatore di-20 ° C per un uso futuro (se la sonda-etichettatura è successo).
  2. Con attenzione aggiungere 500 µ l di calde SSC/IBRID-diluizioni (indicato sotto). Incubare in ciascuna delle seguenti soluzioni per 10 minuti ciascuno, a bagnomaria con agitazione i 70 ° C.
    1. Incubare in sequenza con 100% IBRID-(1 mL di ibrid-), 25% 2 x SSC (250 µ l di 2 x SSC, 750 µ l di ibrid-), 50% 2 x SSC (500 µ l di 2 x SSC, 500 µ l di ibrid-), 75% 2 x SSC (750 µ l di 2 x SSC, 250 µ l di ibrid-), 100% 2 x SSC (1 mL di 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL di 0.2 x SSC).
  3. Dopo l'ultimo passo, Incubare in ciascuna delle seguenti soluzioni per 10 minuti ciascuno. Tutte le incubazioni seguente si terrà al RT il shaker a piattaforma: 25% PBT (250 µ l di PBT, 750 µ l di 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µ l di PBT, 500 µ l di 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µ l di PBT, 250 µ l di 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 mL di PBT).
  4. Dopo un'incubazione di 10 min, rimuovere il 100% PBT e aggiungere 500 µ l di MABT in ogni flaconcino. Ripetere questo passaggio due volte per 5 min.

9. giorno 3: blocco

  1. Rimuovere MABT da ogni flaconcino e flood con soluzione premiscelata bloccante da uno dei tubi (preparati al punto 7.1.4). Flaconcino posto su un mixer nutante per ~ 4 h a TA.
  2. Aggiungere 2 µ l di Anti-DIG-AP Fab frammenti nel secondo flaconcino da 10 mL di soluzione (preparata al punto 7.1.4) e brevemente vortice di blocco.
  3. Riempire quasi completamente ogni flaconcino con soluzione (~ 5 mL) di blocco e nutante mixer durante la notte in frigorifero a 4 ° C.

10. giorno 4: MABT risciacqui

  1. Preparare un flaconcino stock di 10% siero di capra normale (NGS) nel MABT (aggiungere 100 µ l di NGS a 900 µ l di MABT).
  2. Erogare la soluzione bloccante in ogni fiala e aggiungere 500 µ l di miscela NGS/MABT in ogni flaconcino. Consentire gli embrioni a incubare per 25 min a RT sull'agitatore piattaforma.
  3. Sostituire la miscela NGS/MABT con 500 µ l di 100% MABT. Incubare per 30 min a RT sull'agitatore piattaforma. Eseguire questo risciacquo 11 più volte durante il giorno ogni 30 min.
  4. Riempire il flacone con 100% MABT e posto su un mixer nutante durante la notte in una camera frigorifero o cabina a 4 ° C.

11. giorno 5: Visualizzazione della sonda

  1. Preparare un'aliquota di 50 mL di tampone di fosfatasi alcalina (AP) (vedere Supplemental File 5). Combinare le operazioni seguenti in una provetta conica 50 mL avvolta nella carta stagnola per limitare l'esposizione alla luce: 5 mL di 1 M Tris (pH 9.5), 5 mL di 50 mM MgCl2, 5ml di 1% Tween 20, 5 mL di NaCl di 1m, 30 mL di ddH2O.
  2. Rimuovere MABT e sostituire con 1 mL di tampone di AP (tubo avvolto in carta stagnola). Lasciarlo a lavare per 5 min. Farlo due volte a garantire la rimozione completa di MABT.
  3. Buffer di AP di rimuovere e sostituire con 1 mL di tampone di AP con 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) e 4,5 μL di nitro blu di tetrazolio (NBT). Sostituire con preparati AP buffer/NBT/BCIP una volta ogni ora fino a quando la reazione è completa. Monitorare attentamente, controllando ogni 15 minuti, per permettere la reazione di colorazione che si terrà fino a quando è stato raggiunto il livello desiderato di macchiatura. Se precipitato comincia a formarsi, sostituire la soluzione al più presto.
  4. Fermare la reazione di colorazione risciacquando gli embrioni nel buffer di AP 100% fresco (senza NBT/BCIP) per 5 min continua risciacqui in PBT fino al raggiungimento dei livelli ottimali del segnale (con quantità minime di colorazione di fondo). Continuare a sciacquare gli esemplari con l'aumento di diluizioni di PBT in AP Buffer come segue: 25% PBT (250 μL di PBT, 750 μL di tampone di AP), risciacquo per 5 min; 50% PBT (500 μL di PBT, 500 μL di tampone di AP), risciacquo per 5 min; 75% PBT (750 μL di PBT, 250 μL di tampone di AP), sciacquare per 5 min.
  5. Sciacquare gli embrioni in ~ 5 mL del 100% PBT nutante mixer fino a quando lo si desidera una colorazione di fondo minimo viene raggiunto. Interruttore fuori con PBT fresco più volte. Questo potrebbe richiedere fino a diversi giorni.
  6. Quando risciacquo è completi, lavare gli embrioni in 500 μL di PBS sterile su un agitatore di piattaforma. Eseguire questo risciacquo due volte per 5 min. Dopo lava PBS, post-fissare i campioni in 500 μL di 4% PFA per 1h a RT su un agitatore di piattaforma. In alternativa, difficoltà durante la notte in 1 mL di 4% PFA in frigorifero a 4 ° C.
  7. Sostituire il fissativo con fresco, PBS sterile. Eseguire questo risciacquo almeno due volte per 5 min posto gli embrioni in ~ 4 mL di PBS sterile al 100% e archiviare a lungo termine a 4 ° C.

12. imaging

  1. Compongono una piastra di imaging in una capsula Petri usando agarosio al 3% e tampone TAE.
    Nota: Quantità dipendono da quanti piatti sono necessari. Piastre possono essere riutilizzati più volte. È consigliabile che uno stampo rettangolare poco profondo è disposto in di Petri mentre il gel è di raffreddamento al fine di creare una depressione per contenenti gli embrioni sulla piastra.
  2. Posizionare gli embrioni sulla piastra in PBS.
    Nota: Si consiglia di versare delicatamente gli embrioni nella piastra invece di pipettaggio fuori perché è stato trovato che che si attacchi all'interno delle pipette di plastica.
  3. Utilizzare la microscopia chiara al fine di visualizzare ciascun embrione. Utilizzare una sonda smussata per manovrare gli embrioni nella posizione desiderata.
  4. Prendere un'immagine quando l'embrione è nella posizione desiderata. Si noti che è importante acquisire le immagini degli embrioni all'interno di un paio di settimane di macchiatura completato per evitare una potenziale riduzione della macchia.

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Risultati

In questo rapporto, forniamo un approccio semplice e diretto per eseguire etichettatura delle embrionali Astyanax campioni per analisi di espressione genica di alta qualità. Questa tecnica può essere effettuata in quattro o cinque giorni, e ogni passaggio principale della procedura è rappresentata in un diagramma di flusso con codifica a colori (Figura 1). Una volta completato, macchiati embrioni dovrebbero harbor un'etichetta cromatica viola scura n...

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Discussione

A causa della vulnerabilità di RNA alla degradazione, una delle fasi più critiche nel protocollo riguarda la sintesi sterile della sonda RNA. Tuttavia, se una sonda è generata con attenzione e fornisce buoni risultati, può essere riutilizzato nelle successive reazioni di colorazione. Un secondo punto cruciale è la produzione accurata di tutti i reattivi utilizzati in tutto il protocollo. Poiché questo protocollo coinvolge diversi giorni e molti piccoli passi, è essenziale che tutti i reagenti sono accuratamente prodotte ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio lordo per utili commenti su questo manoscritto. Vogliamo riconoscere quattro studenti delle scuole superiori che hanno utilizzato questo protocollo durante stage estivi nel 2017 e 2018, tra cui Christine Cao, Michael Warden, Aki Li e David Nwankwo. HL è stato sostenuto da una borsa di studio UC biologia staminali durante l'estate del 2017. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della National Science Foundation (DEB-1457630 a JBG) e il National Institutes of Dental e Craniofacial Research (NIH; DE025033 a JBG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipetta sierologica da 10 mLVWR89130-888
Unità di filtrazione da 1000 mLVWR89220-698
15 mL conicaVWR-Greiner82050-278
Pipetta sierologica da 25 mLVWR89130-890
Unità di filtrazione da 250 mLVWR89220-694
Pipetta sierologica da 5 mLVWR89130-886
50 mL conicoVWR-Falcon21008-940
500 mL Unità di filtrazioneVWR89220-696
Anti-digossigenina-AP, Fab frammentiSigma-Roche11093274910
BCIPSigma-AldrichB8503-1G1 g
Soluzione bloccanteSigma-Roche11 096 176 00150 g
Acido citricoFisher ScientificA104-500500 g
Kit di etichettatura dell'RNA DIG (SP6/T7)Sigma-Roche11175025910
Eppendorf TubesVWR20170-577
EtanoloFisher-Decon04-355-2231 Gal
FormamideThermo Fisher Scientific17899100 mL
Fiale dram in vetroVWR66011-0411
Pipette in vetroFisher Scientific13-678-8A
HClThermal-ScientificPharmco-AAPER284000ACS500 mL
EparinaSigmaH3393-25KU
Cloruro di magnesio-cristallinoFisher ScientificM33-500500 g
Acido maleicoSigmaM0375-100g100g
MetanoloFisher ScientificA452-44L
Acqua di grado molecolare (senza RNasi)VWR7732-18-5500 mL
NaClFisher ScientificS271-33 kg
Pellet di NaOHFisher ScientificS318-500500 g
NBT Substrato in polvereThermoFisher Scientific340351 g
Siero di capra normaleFisher-Invitrogen31873
Miscelatore NutanteVWR82007-202
ParaformaldeideSigma158127-500g500 g
PBS 10xFisher ScientificBP399-2020L
Proteinasi K (200mg/10ml)Qiagen1913310 mL
Pipette in plasticaVWR-Samco14670-147
RNAseSigmaR2020-250mL250 mL
Bagno d'acqua con agitazione 12 LVWR10128-12612 L
Agitatore analogico standardVWR89032-092
TrisSigma Millipore-OmniPur9210-500GM500 g
tRNA LievitoFisher-Invitrogen1540101125 mg
Tween 20SigmaP9416-50mL50 mL
Vortex-Genie 2Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc50-728-002
Cloruro di litio (LiCl)Sigma-Aldrich203637-10G10 g
Dr

Riferimenti

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