Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test per transposase-accessibile della cromatina (ATAC-seq) la sequenziazione su linfociti CD4 + umani. Il protocollo è stato modificato per ridurre al minimo la contaminazione letture di DNA mitocondriale dal 50% al 3% attraverso l'introduzione di un nuovo buffer di lisi.
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Articolo metodologico
ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T
In questo articolo
Sommario
Abstract
ATAC-seq è diventata una metodologia ampiamente usata nello studio dell'epigenetica a causa del suo approccio rapido e semplice alla mappatura del genoma accessibile della cromatina. In questa carta presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce la contaminazione letture di DNA mitocondriale. Mentre precedente ATAC-seq protocolli hanno lottato con una media di 50% contaminando il DNA mitocondriale si legge, il buffer di lisi ottimizzato introdotto in questo protocollo riduce la contaminazione di DNA mitocondriale a una media del 3%. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata consente una riduzione del 50% nei pressi del costo di sequenziamento. Dimostriamo come queste librerie di ATAC-seq di alta qualità possono essere preparate da linfociti CD4 + attivati, fornendo istruzioni dettagliate da CD4 + isolamento dei linfociti da sangue intero attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata è stata convalidata in una vasta gamma di tipi di cellule e sarà di immediata utilità per i ricercatori che studiano l'accessibilità della cromatina.
Introduzione
Il dosaggio per transposase-accessibile della cromatina sequenziamento (ATAC-seq) è rapidamente diventato il principale metodo per interrogare architettura della cromatina. ATAC-seq può identificare regioni di cromatina accessibile attraverso il processo di tagmentation, la frammentazione e la codifica di DNA con lo stesso enzima, per produrre le librerie con cui sequenziamento può determinare l'accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma. Questo processo di tagmentation è mediato dalla transposase Tn5 iperattivo, che taglia solo regioni aperte della cromatina a causa di composti sterico. Come taglia, la transposase Tn5 inserisce anche schede di sequenziamen....
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Protocollo
Questo protocollo migliorato fornisce istruzioni dettagliate per eseguire ATAC-seq di linfociti CD4 +, da materiale di partenza di sangue intero attraverso l'analisi dei dati (Figura 1).
1. isolamento di CD4 + cellule di T dal sangue intero
Nota: Il materiale di partenza per questo protocollo è 15 mL di sangue intero fresco raccolti utilizzando le procedure standard, permettendo l'origine della materia prima di essere selezionato basato su requisiti di ricerca. Scala il protocollo come necessario. Pre-riscaldare il tampone fosfato salino (PBS) + 2% siero fetale del vit....
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Risultati
A partire da 15 mL di sangue intero fresco, questo protocollo genera una media di 1 milione di cellule T CD4 +. Questi possono essere congelati per la successiva elaborazione o utilizzati immediatamente. Vitalità delle cellule T CD4 +, fresche o scongelate, era costantemente > 95%. Questo metodo di isolamento delle cellule T CD4 + consente flessibilità nel tempo di materiale e raccolta di origine. Questo protocollo di ATAC-seq migliorato produce una raccolta finale di più maggior di 1 .......
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Discussione
Il protocollo modificato di ATAC-seq presentato in questo articolo fornisce risultati riproducibili con contaminazione minima di DNA mitocondriale. Il protocollo è stato usato per con successo caratterizzano l'architettura della cromatina di umano primario PBMCs10, monociti umani, le cellule dendritiche (inedite) del mouse, e linee cellulari di melanoma coltivate11. Anticipiamo la lisi migliorata condizione ha il potenziale di lavorare per altri tipi di cellule pure. È anch.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Atsede Siba per il supporto tecnico. C.s.c. è supportato da NIH grant 1R61DA047032.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x PBS, | Gibco | 10010023 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| 5810/5810 Centrifuga refrigerata a secchio oscillante R con secchi per provette da 50 mL, 15 mL e 1,5 mL Eppendorf | 22625501 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. | |
| Piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 163320 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Sistema di stazioni a nastro Agilent 4200 | Agilent | G2991AA | consigliato per la valutazione della qualità. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Componente critico |
| Dynabeads Kit di cellule T CD4 umane intatte | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Componente critico |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Componente critico |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Può utilizzare altri comparabili prodotti. |
| Kit DNA ad alta sensibilità | Agilent | 50674626 | Consigliato per la valutazione della qualità. |
| Cloruro di magnesio, esaidrato, grado di biologia molecolare | Sigma | M2393 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Kit di purificazione PCR MinElute (Buffer PB, Buffer PE, Buffer di eluizione) | Qiagen | 28004 | Componente critico |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| NaCl, grado di biologia molecolare | Sigma | S3014 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Componente critico |
| Kit di preparazione della libreria di DNA Nextera (2x tampone TD, enzima Tn5) | Illumina | FC1211030 | Componente critico |
| Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Polisorbato 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Bagno |
| d'acqua di precisione | Thermo Scientific | TSGP02 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Kit di purificazione PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | |
| Kit di analisi Qubit dsDNA HS | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggerito per la valutazione della qualità. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Consigliato per la valutazione della qualità. |
| Rosetta Sep Umano CD4+ Densità Media | Cellule Staminali Tecnologie | 15705 | Componente Critico |
| Rosetta Sep Umano CD4+ Arricchimento Cocktail | Cellule Staminali Tecnologie | 15022 | Componente Critico |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Resevoir | Sterile Thermo Scientific | 8096-11 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Termociclatore T100 con coperchio riscaldato | BioRad | 1861096 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Può utilizzare altri prodotti comparabili. |
Riferimenti
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.
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Ristampe e permessi
