Isolamento e trasferimento adottivo di sale alta trattati cellule dendritiche presentanti l'antigene

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare le cellule dendritiche da murine milze di ordinamento magnetico delle cellule e successivo trasferimento adottivo in topi ingenuo. Il modello delle cellule dendritiche attivate di alto-sale è stato scelto per spiegare le procedure dettagliate di trasferimento adottivo e citometria a flusso.

Abstract

Assunzione di sale dietetico in eccesso contribuisce ad infiammazione e svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di ipertensione. Precedentemente abbiamo trovato che cellule dendritiche presentanti l'antigene (DCs) possono percepire elevato sodio extracellulare che conduce alla formazione di isolevuglandin (IsoLG) e l'attivazione della NADPH ossidasi-proteina addotti. Questi IsoLG-proteina addotti reagiscono con self-proteine e promuovere una autoimmune-come stato e ipertensione. Abbiamo sviluppato e ottimizzato state-of-the-art metodi per studiare la funzione delle DC nell'ipertensione. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento, in vitro trattamento con sodio elevato e il trasferimento adottivo di murino CD11c splenica⁺ cellule nei topi destinatari per studiare il loro ruolo nell'ipertensione.

Introduzione

L'eccesso di sale dietetico è un importante fattore di rischio per ipertensione. ^{1 , 2} the American Heart Association raccomanda un massimo di 2.300 milligrammi (mg) di apporto di sodio (Na⁺) al giorno, tuttavia; meno del 10% della popolazione statunitense osserva questa raccomandazione. ^{3 , 4} riduzioni modeste nell'assunzione di Na⁺ abbassano la pressione sanguigna e riducono l'annuali nuovi casi di malattia coronarica e ictus negli Stati Uniti del 20%. ⁵ un grosso problema con il consumo di sale in eccesso è che il 50% della popolazione ipertesa esibisce sale-sensibilità, definita come un aumento di 10 mmHg della pressione arteriosa dopo caricamento Na⁺ o un simile calo della pressione sanguigna dopo Na⁺ restrizione e la diuresi. ⁶ sale-sensibilità si verifica nel 25% degli individui normotesi ed è un preannunciatore indipendente della morte e di eventi cardiovascolari. ^{7 , 8} sale-sensing meccanismi nell'ipertensione che coinvolgono il rene sono stati ben studiati; Tuttavia, gli studi recenti suggeriscono che le cellule immuni possono percepire Na⁺. ^{9 , 10}

La prova recente suggerisce che i cambiamenti in extra-renale Na⁺ manipolazione possono causare accumulo di Na⁺ nell'interstizio e promuovono l'infiammazione. ^{11 , 12} il nostro laboratorio ed altri hanno indicato che le cellule del sistema immunitario innato e adattivo contribuiscano all'esacerbazione dell'ipertensione. ^{9 , 13 , 14 ,} Vari stimoli ipertesi ¹⁵ , tra cui l'angiotensina II, noradrenalina e macrofagi causa sale, monociti e linfociti di T per infiltrarsi il rene ed il sistema vascolare e promuovere la ritenzione di Na⁺ , vasocostrizione, pressione sanguigna elevazione e danno d'organo fine. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} in studi precedenti, abbiamo trovato che DCs si accumulano isolevuglandin (IsoLG)-proteina addotti in risposta a vari stimoli di ipertesi compreso ipertensione di angiotensina II e DOCA-sale. ¹⁴ IsoLGs sono altamente reattivi prodotti di perossidazione lipidica che rapidamente e in modo covalente del complesso di Lisine sulle proteine e il loro accumulo è associato con l'attivazione delle DC. Formazione in murino DCs.⁹ entrata Na⁺ in DCs è mediata con amiloride sensibile trasportatori del complesso ¹⁴ recentemente abbiamo stabilito che elevato Na⁺ è un potente stimolo per IsoLG-proteina. Na⁺ viene poi scambiato per calcio (Ca^{2 +}) tramite lo scambiatore di Na⁺/ca^{2 +} . CA^{2 +} attiva la protein chinasi C (PKC) che attiva la NADPH ossidasi che porta maggiore superossido (O₂^{· -}) e la formazione del complesso IsoLG-proteina. ⁹ trasferimento adottivo di sale-esposti di ipertensione numeri primi DCs in risposta ad una dose sub-pressoria di angiotensina II. ⁹

Identificazione di CD11c⁺ DCs dai tessuti è stata precedentemente limitata a immunoistochimica e RT-PCR, e isolamento di DCs è stata limitata a cella ordinamento tramite flusso cytometry. Anche se l'ordinamento delle cellule di flusso cytometry è un metodo efficace per l'isolamento delle cellule del sistema immunitario, è costoso, richiede tempo e conduce ad un rendimento basso di cellule vitali. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un protocollo passo dopo passo per la digestione del tessuto, stimolazione in vitro e trasferimento adottivo di CD11c⁺ DCs per studiare l'ipertensione.

Protocollo

Vanderbilt University istituzionale Animal Care e uso Comitato hanno approvato le procedure descritte nel presente documento. Topi sono alloggiati e curati secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press. Riveduta 2010).

1. isolamento della milza dai topi

1. Preparare RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato di sodio di 1 mM, 50 µM β-mercaptoetanolo e 1% di penicillina/streptomicina.
2. Eutanasia: 10 – 12 settimana-vecchi topi maschii C57bl/6 per inalazione di CO₂ . Spruzzare il petto e fianchi del mouse con etanolo al 70%. Sul lato sinistro, aprire con cautela la pelle e la cavità peritoneale per esporre la milza.
3. Utilizzando piccole pinze, spostare con cautela l'intestino ed il fegato al lato sinistro del mouse e forbice delicatamente asportare la milza.
   Nota: Questo passaggio deve essere fatto con molta attenzione come danneggiamento del tratto gastrointestinale può indurre la contaminazione.
4. Posizionare ogni milza asportata in provetta conica da 15 mL con etichetta contenente 3 mL di terreno RPMI 1640.

2. generazione di sospensioni di cellule singole dalle milze

Nota: La milza può essere dissociata in una sospensione cellulare unico combinando dissociazione meccanica oltre a digestione enzimatica.

1. Preparare la soluzione di digestione della milza con l'aggiunta di collagenasi D (1 mg/mL; 0,29 U/mg liofilizzato) e dnasi I (0,1 mg/mL) a preparato medium RPMI 1640 (Vedi punto 1.1)
2. Utilizzare pinze per trasferire la milza in un C tubo (tubo di dissociazione) contenente 3 mL di soluzione di digestione della milza.
3. Eseguire la dissociazione meccanica utilizzando un omogeneizzatore semi-automatizzato secondo le istruzioni del produttore.
   1. Posizionare il tubo C l'omogeneizzatore semi-automatizzata, garantendo che il tubo di C è ben posizionato sul braccio rotante. Una volta posizionato il tubo C, premere il pulsante start sull'omogeneizzatore semi-automatizzato per eseguire il protocollo di milza 04.01 per 60 s.
      Nota: Dissociazione meccanica può essere eseguita anche inserendo un filtro 40 μm in cima una provetta conica da 50 mL e rettifica delicatamente la milza attraverso il filtro. Dopo la macinazione della milza, attraverso sciacquare il filtro 40 µm con 10 mL di terreno RPMI.
4. Dopo dissociazione meccanica, staccare il tubo dall'omogeneizzatore ed eseguire la digestione enzimatica. Incubare i campioni per 15 min a 37 ° C in continua rotazione (20 giri).
5. Trasferire la soluzione di pipettare in una provetta conica da 50 mL dopo aver filtrato attraverso un colino di 40 µm. Lavare il filtro 40 µm con 10 mL di PBS di Dulbecco (dPBS). Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
6. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante completamente e lavare la pallina di risospensione in 10 mL di dPBS. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.

3. isolamento di CD11c⁺ DCs dalla sospensione unicellulare splenica

1. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di dPBS e contare il numero di celle utilizzando un emocitometro e trypan blu esclusione.
2. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 300 x gper 10 min a 4 ° C.
3. Aspirare completamente il supernatante e risospendere il pellet in 400 µ l di buffer di magneticamente attivato l'ordinamento delle cellule (MACs).
4. Aggiungere 100 µ l di CD11c microsfere (Vedi Tabella materiali) a 1 x 10⁸ cellule.
5. Vortice la sospensione cellulare e incubare per 10 minuti in frigorifero a 4 ° C.
6. Aggiungere 10 mL di buffer di MACs per lavare le cellule. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
7. Aspirare completamente il supernatante e risospendere in 500 µ l di tampone di MACs.

4. magnetica separazione di CD11c⁺ DCs

Nota: Separazione magnetica è fatto manualmente con un separatore magnetico (Vedi Tabella materiali) provvisti di LS colonne. Separazione magnetica può essere eseguita anche automaticamente con un separatore magnetico automatizzato. (Vedi Tabella materiali).

1. Sistemare la colonna LS nel campo magnetico del separatore di MACs e un tubo conico da 15 mL sotto ogni colonna per raccogliere il flusso continuo.
2. Lavare la colonna LS con 3 mL di tampone.
3. Posizionare la sospensione cellulare su ogni colonna LS e raccogliere il flusso continuo che contengono le cellule senza etichetta.
4. Lavare la colonna LS con 3 mL di tampone di MACs raccogliendo le cellule senza etichetta che passano attraverso. Lavare la colonna LS 2 volte di più.
5. Rimuovere la colonna LS dal separatore magnetico. Aggiungere 5 mL di tampone di MACs a ogni colonna e sciacquare immediatamente le cellule magneticamente con etichetta immergendo saldamente la colonna LS in una provetta conica pulito da 15 mL.
   Nota: È importante eseguire un doppio isolamento delle cellule CD11c per ottenere una sospensione di cellule di elevata purezza. Quindi, ripetere i passaggi da 3.1 a 4.5. e 4 di figura di riferimento per gli standard di purezza. Questo passaggio migliora la purezza di CD11c⁺ cellule al 90 – 95%.
6. Determinare CD11c⁺ DC numero su un emocitometro utilizzando l'esclusione del blu di trypan. Diluire il campione di cellule ad una diluizione di 1:1 in soluzione di blu di trypan 0,4%.
   Nota: cellule Non vitali saranno colorate blue, mentre cellule vitali rimarrà senza macchiate.
   1. Per effettuare questa operazione, è attentamente riempire un emocitometro con 10 µ l della diluizione del campione delle cellule e incubare per 1 minuto.
   2. Contare le celle in 4 quadrati di 1 x 1 mm² nella camera che è stata caricata per determinare il numero di cellule vitali.

5. in Vitro alto trattamento al sale di CD11c⁺ DCs

1. Preparare il terreno di coltura DC aggiungendo 10% FBS, 0,1 mM HEPES, piruvato di sodio di 1 mM, 50 µM β-mercaptoetanolo e 1% di penicillina/streptomicina a 500 mL 1640 RPMI.
2. Preparare 10 x DC cellula del sale alta cultura media (400 mM) pesando 1,17 g di NaCl e inserirlo in un tubo falcon sterile 50 mL. Aggiungere 50 mL di sterili terreni di coltura delle cellule DC (preparato al punto 5.1) al tubo falcon 50 mL e vortice fino al NaCl in soluzione.
3. Filtrare immediatamente alto sale DC cultura media utilizzando vuoto filtrazione attraverso un filtro di 0,2 μm in una cappa di cultura cellulare.
4. Centrifugare ogni sospensione cellulare dalle milze a 300 x g per 10 min a 4º c. Ogni risospendere le cellule in terreni di coltura DC ad una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL.
5. Aggiungere 900 μL (circa 1 x 10⁶ cellule) della sospensione DC in un fondo piatto 24 pozzetti piastra Falcon. Aggiungere 100 µ l di alta sale DC cultura media ad ogni pozzetto per una concentrazione finale di sodio di 190 mM. La targhetta di etichettatura e posto in un a 37 ° C umificato CO₂ incubatore per 48 h.

6. trasferimento adottivo di sale alta trattati CD11c⁺ DCs

1. Dopo stimolazione in vitro per 48 h, rimuovere la piastra da 37 ° C umificato incubatore a CO₂ .
2. Pipettare i terreni di coltura cellulare su e giù per risospendere il CD11c⁺ DCs. Pipettare tutti il CD11c⁺ DC sospensione in un corrispondente denominato tubo di 1,6 mL. Ripetere questo passaggio per ogni individuo ben placcato.
3. Centrifugare ogni CD11c⁺ DC sospensione a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante. Risospendere il pellet di DC con 100 µ l di dPBS sterile.
4. Sorteggio DC sospensione in una siringa da 1 mL con ago 27 G ½ pollice.
5. Posizionare l'ingenuo maschio 10 settimana C57bl/6 topi sotto 2% isoflurane per realizzare un piano chirurgico stabile. Controllare il livello dell'anestesia con la mancanza del pedale riflesso. Una volta ottenuto un stabile piano chirurgico, lentamente e con attenzione introdurre l'ago nello spazio retro-orbitale in un angolo di circa 30°.
   Nota: La smussatura dell'ago 27 G dovrebbe essere rivolta verso il basso, lontano dagli occhi, per prevenire danni oculari.
6. Lentamente e dolcemente iniettare il CD11c⁺ DC sospensione (circa 1 x 10⁶ cellule). Una volta completata l'iniezione, rimuovere con cautela l'ago per lo spazio retro-orbitale, essendo cosciente di non danneggiare l'occhio.
   Nota: Dopo l'iniezione, ci dovrebbe essere poco o Nessun sanguinamento. Trasferimento adottivo di CD11c⁺ DCs può essere eseguita anche utilizzando un metodo I.V. di iniezione (ad es. vena caudale). I topi di controllo visualizzato CD11c⁺ DCs che sono state coltivate in media sale normale.
7. Rimuovere i topi dal cono di naso e monitorarli per circa 30 min durante il recupero dall'anestesia.

7. preparazione di 14 giorni della basso-dose dell'angiotensina II (140 ng/kg/min)

1. Preparare il tampone di angiotensina II aggiungendo 500 μL di 5 M di NaCl e 300 μL di acido acetico. Quantum Satis (QS) fino a 30 mL di deionizzata H₂0.
2. Sciogliere l'angiotensina II a 5 mg/mL di soluzione madre con il tampone di angiotensina II. Diluire la soluzione di riserva di angiotensina II con buffer aggiuntivo per ottenere una concentrazione finale, tale che il Minipompa osmotico consegnerà angiotensina II in una tariffa di 140 ng/kg/min in base al peso del corpo di ogni mouse.
   Nota: Essenziale dell'angiotensina II (mg) = (peso (g) il mouse x 0,2 mg / giorno x 14 giorni) / 1.000
   Preparato dell'angiotensina II (mg) = (essenziale dell'angiotensina II x 260 µ l) / pompa tasso (0.25 μL/hr)
   Angiotensina II Stock Volume (µ l) = preparato angiotensina II / concentrazione (5 mg/mL) x 1,000 di magazzino
   Diluire il volume (µ l) = 270 - volume stock di angiotensina II
3. Aggiungere volume stock di angiotensina II il diluito (tampone di angiotensina II) basato sui volumi calcolati al punto 7.2.
4. Sotto una cappa di cultura di cellule sterili, aprire Minipompa osmotico.
5. Aggiungere diluito angiotensina II soluzione ed espellere l'aria dalla siringa e ago. Inserire l'ago fornito nella parte inferiore della Minipompa osmotico e iniettare lentamente la soluzione di angiotensina II mentre lentamente e con attenzione l'ago dalla vescica di retrazione.
6. Inserire la testa Minipompa osmotico nella vescica osmotica completamente, prestando attenzione a non ottenere qualsiasi aria nella vescica.

8. l'impianto di 14 giorni della basso-dose angiotensina II minipompe osmotiche

1. Dieci giorni dopo il trasferimento adottivo di CD11c⁺ DCs, topi di posto in una camera di isoflurane per avviare l'anestesia e quindi spostare topi al cono di naso di ricevere continuamente 2% isoflurane per raggiungere e mantenere un appropriato piano chirurgico.
2. Rimuovere il pelo lungo il lato dorsale del collo con i clippers per preparare il sito chirurgico. Pulire l'area rasata con etanolo al 70% seguita da 7,5% betadine prima dell'inizio della chirurgia.
3. Creare una piccola incisione (circa 1,5 cm) nella pelle. Inserire emostatiche nell'incisione per creare una tasca sottocutanea per il posizionamento della Minipompa osmotico.
4. Inserire il Minipompa in tasca sottocutanea. Nelle vicinanze la pelle ferita con graffette chirurgiche 2-3 e applicare un'altra applicazione di 7,5% betadine sulla ferita e staples per prevenire l'infezione.
5. Monitorare i topi per 30 – 60 min durante il recupero dall'anestesia prima di restituirli alle loro gabbie.
   Nota: Topi devono essere monitorati fino a 3 – 4 giorni dopo l'impianto della Minipompa osmotico.

9. isolamento delle milze dei topi destinatari per analisi Cytometric di flusso

1. Dopo 14 giorni di infusione di basso-dose dell'angiotensina II, isolare le milze da topi che ricevono in vitro sale alta trattati DCs di trasferimento adottivo. Seguire i passaggi precisi elencati sopra (passaggi 1 e 2).

10. superficie di colorazione

1. Trasferire gli splenocytes che sono risospese in 1X PBS in un polistirolo tubo FACS e centrifugare a 350 x g per 8 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante dopo la centrifugazione. Lavare due volte con 1 mL di tampone di MACs e centrifugazione (350 x g, 8 min, 4 ° C).
   1. Dividere gli splenocytes ugualmente in tubi diversi polistirolo FACS basati sul numero di pannelli di cytometric di flusso desiderato.
2. Per eseguire la colorazione di vitalità a Live/Dead Cell, lavare le cellule con 1x PBS e centrifugare (350 x g, 8 min, 4 ° C). Risospendere in 1 mL di PBS 1X e aggiungere 1 µ l di una vitalità cellulare macchia (Vedi tabella materiali). Incubare per 15 min a 4 ° C (frigorifero o sul ghiaccio) coperto di stagnola per proteggere dalla luce.
3. Durante l'incubazione la macchia di attuabilità delle cellule, è necessario preparare il cocktail di anticorpi per la superficie della cellula che macchia in un adeguato volume di tampone di MACS.
4. Lavare le cellule con 1 mL di tampone di MACS, centrifuga (350 x g, 8 min, 4 ° C) e ogni risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo cocktail. Incubare protetta dalla luce per 30 min a 4 ° C.
   Nota: Ogni anticorpo di citometria a flusso è unico, ed è molto utile e consigliato per determinare la quantità ottimale di anticorpi necessari eseguendo una curva di titolazione della dose per ogni anticorpo specifico.
5. Lavare le cellule due volte con 1 mL di tampone di MACS e risospendere il splenocytes in una quantità appropriata di MACS Buffer per analisi cytometric di flusso.

Risultati

Figura 1 rappresenta uno schema dei passaggi descritti sopra. Milze murine isolate sono ordinate per CD11c⁺ DCs da magnetico cella ordinamento e placcato in media sale normale (NS; 150 mmol NaCl) o media sale alta (HS; 190 mmol NaCl) per 48 h. CD11c⁺ DCs vengono poi trasferiti passivamente da retro-orbitale iniezione di ingenuo destinatario topi. Dieci giorni dopo, i topi sono impiantati con minipompe osmotiche per infusione di basso-dos...

Discussione

Nel protocollo attuale, abbiamo ottimizzato le procedure per isolare CD11c⁺ DCs dalle milze di topi e passivamente trasferirli in animali per studiare il ruolo di controller di dominio nell'ipertensione indotta da sale. Questo protocollo può essere adattato per isolare e trasferire passivamente altri sottoinsiemi delle cellule immuni, compreso i macrofagi, monociti e cellule immunitarie adattive, compreso i linfociti T e B. Abbiamo ottimizzato il processo di digestione splenica per ottenere la sopravvivenza de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
APC/Cy7 anti-topo CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Microsfere ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenasi D	Roche	11088866001
DNasi I	Roche	10104159001
DPBS senza calcio e magnesio	Corning	21-031-CV
Reagente bloccante FcR	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-topo CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tubo	Miltenyi Biotec	130-096-334
Dispositivo dissociatore GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Protocollo d'uso: Spleen 04.01
Kit colorazione per cellule morte viola riparabile LIVE/DEAD	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Separatore Biotec	130-042-401
QuadroMACs	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medio	Gibco	11835-030