Incorporazione di una procedura di biopsia del fegato Survivable in topi, per valutare la risoluzione di steatoepatite Non alcolica (NASH)

Steatoepatite non alcolica (NASH) è una malattia epatica progressiva e una forma più severa di affezione epatica grassa non alcolica (NAFLD), che sta diventando sempre più diffuso grazie alla sua associazione con l'obesità e il diabete di tipo 2. Ci sono terapie approvate per NAFLD/NASH, o approvati biomarcatori valutare facilmente la progressione di malattia. NASH è diagnosticato istologicamente valutando l'infiammazione, l'eccesso lipidico epatico (steatosi), degli epatociti in mongolfiera e fibrosi^1,2,3,4. Negli studi clinici, questi endpoint vengono valutati prima dello studio in un campione di fegato raccolto tramite biopsia e da una seconda biopsia del fegato dopo un certo periodo di trattamento. Così, viene valutata l'efficacia dell'agente prova via cambiamento nella patologia epatica in soggetti con precedentemente identificato/quantificato (cioè, biopsia-provata) NASH che sono stati randomizzati ai gruppi di trattamento. Questi stessi endpoint istologico sono spesso utilizzati nei modelli del roditore valutare potenziali terapie NASH negli studi preclinici, ma soltanto nel tessuto terminale da topi eutanasizzati e così senza una comprensione del grado di efficacia al basale e l'incapacità al controllo per le differenze nello stato di malattia basale tra gruppi di trattamento.

Anche se 25% degli adulti con NAFLD sono presunti per avere NASH basato su livelli sierici elevati di aminotransferasi, non esistono metodi alternativi definitivi per confermare NASH diverso da prova istologica⁴. Metodi non invasivi, come ad esempio le modalità radiologiche (ecografia, tomografia computerizzata e risonanza magnetica) sono state sviluppate per rilevare la steatosi epatica, ma tali metodi non possono diagnosticare NASH o determinare lo stadio della fibrosi. Elastography transitorio offre una modalità di promessa non invasivo per misurare la rigidezza del fegato. Essa ha dimostrato di essere precisi nella differenziazione delle fasi di fibrosi. Tuttavia, la precisione diminuisce con il più alto indice di massa corporea (BMI) e tessuto grasso. ⁵ questo è problematico dovuto la maggior parte dei pazienti con NASH essere obesi. Oltre la rilevanza clinica di questi approcci, nessuna di queste modalità viene utilizzata negli studi preclinici.

Per ovviare a questo, il gruppo di ricerca del Dr. Jonathan Roth furono i primi a implementare una procedura di biopsia del fegato nel modello del topo di Amylin NASH (AMLN) di NASH^6,7,8. Hanno descritto la validità predittiva della biopsia con grado di malattia NASH e correlazione con la malattia metabolica. Qui descriviamo in dettaglio la procedura di biopsia del fegato nel modello AMLN di NASH e la sua utilità in un setting terapeutico, in particolare per valutare l'efficacia di liraglutide.

Tutti gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le condizioni istituzionali Animal Care ed uso Committee (IACUC) di MedImmune, LLC e d'intesa con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8a edizione (2011). Topo C57BL6J maschio sono stati disposti sulla dieta ad alta percentuale di grassi, alto contenuto di fruttosio, ricca in colesterolo AMLN. Le biopsie del fegato sono state eseguite dopo 26 settimane di dieta, 3 settimane prima dell'inizio dell'intervento farmacologico.

1. ottenere e preparare materiali chirurgici

1. Strumenti sterili autoclave (piccole forbici punta-punta, forcipe punta smussata, tamponi di cotone, garza piazze, clip 7 mm staples/ferita e cucitrice).
2. Ottenere, sutura sterile per la chiusura della parete addominale (5-0 suturare assorbibile rivestito con un ago di PC-1 è adatto), spugna di gelatina assorbibile compresso (per essere utilizzato a scopo emostatico), teli sterili e guanti, scrub a base di iodio e 70% etanolo tamponi/salviette , la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg dose per topo; almeno 3 dosi per topo) e chirurgico occhio unguento/lubrificazione.
3. Preparare il vaporizzatore per anestesia riempiendolo con isoflurano.
4. Accendere uno sterilizzatore della perla, per la sterilizzazione rapida strumento tra gli animali.
5. Girare su una superficie scaldavivande o rilievo di riscaldamento, da utilizzare per il recupero degli animali.
6. Don appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (cioè, maschera, Abito, capelli cofano, guanti).

2. pre-operatoria preparazioni

1. Posizionare il mouse nella camera di induzione con 2-3% isoflurane flusso a effetto.
2. Osservare il mouse fino a quando la mancanza di risposta a punta-pizzico conferma che la profondità dell'anestesia è appropriata.
3. Utilizzare un unguento oculare per prevenire la secchezza della cornea associata con l'anestesia.
4. Somministrare per via sottocutanea buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg).
5. Radere il sito chirurgico immediatamente caudale del processo xifoideo, utilizzando Tosatrici per animali.
6. Spostare il mouse a una superficie riscaldata (37 ° C) dopo la rasatura, il sito chirurgico. Posizionare il mouse in modo in modo che la superficie dorsale è verso il basso, e l'addome è esposto. Inserire il naso del mouse il cono di naso di anestesia per facilitare la consegna di isoflurane ad una portata di 2-3%.
7. Pulire il sito chirurgico con tamponi alternati di betadine e 70% di etanolo (3 volte).
8. Aprire e configurare gli strumenti chirurgici sterili.
9. Rimuovere i guanti e sostituire con guanti chirurgici sterili.

3. intervento chirurgico

1. Praticare un'incisione longitudinale con le forbici (1-2 cm), immediatamente caudale del processo xifoideo e leggermente a sinistra del mouse, nella pelle addominale.
2. Blunt sezionare la pelle lontano dalla parete addominale utilizzando pinze e le forbici.
3. Esporre la parete addominale e visualizzare il fegato sotto.
4. Utilizzo di una marca di lama bisturi sterile un'incisione (1-2 cm) nella parete addominale per visualizzare il lobo di sinistra-laterale (LLL) del fegato.
   Nota: Essere coerenti in tutto lo studio. Altri comuni lobi di interesse sono destra-mediale lobo (RML) e lobo di sinistra-mediale (LML).
5. Esternare il lobo laterale sinistro attraverso l'incisione.
6. Opzione 1: Leggermente massaggiare l'addome con il pollice e il dito indice per esporre una parte della formazione permanente.
7. Opzione 2: Posizionare un tampone di cotone sterile sotto il LLL per estrarre delicatamente una porzione di essere esposti.
8. Posizionare un pezzo imbevuta di soluzione fisiologica sterile di garza sotto il LLL per consentire una superficie sterile e idratata per il fegato a mentire su.
9. Tagliare un pezzo a forma di Cuneo del fegato dal LLL facendo due tagli con forbici sterili.
   Nota: La dimensione approssimativa del fegato viene rimosso è 30-50 mg (< 5% del fegato nei topi).
10. Tagliare un pezzo di spugna di gelatina dimensioni simili al pezzo di Cuneo del fegato. Inserire la spugna la parte tagliata del fegato usando il forcipe.
11. Tenere la spugna con il forcipe e mantenere il contatto con il fegato finché non aderisce alla superficie del fegato ed emostasi.
12. Posto il pezzo di biopsia del fegato nel tubo appropriato (cioè congelati, fissativo, ecc.).
13. Posizionare delicatamente il fegato indietro nella cavità addominale, avendo cura di non disturbare la spugna.
14. Suturare la parete addominale con il 5-0 suturare assorbibile rivestito iniziando e terminando con un nodo quadrato pieno.
15. Chiudere la pelle con 7mm ferita clip (o graffette).
16. Ispezionare la ferita clip per assicurarsi che ci sia una chiusura completa dell'incisione.
17. Rimuovere il mouse dal cono di naso e collocare in una gabbia pulita su una superficie riscaldata.
18. Strumenti posto nello sterilizzatore a perlina tra topi per 10-20 s. Assicurarsi che tutto il materiale organico deve essere rimosso dagli strumenti utilizzando soluzione salina sterile prima di mettere nello sterilizzatore di perlina di vetro.

4. post-operatorio

1. Monitorare il mouse finché riprende conoscenza e può giusto per sé.
2. Registrare le osservazioni post-operatorie e controllare i topi al giorno per deiscenza.
3. Somministrare una seconda e la terza dose di buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea 6-8 h post-chirurgia e nuovamente 24h post-chirurgia.
4. Rimuovere le graffe di ferita alla post-chirurgia 7-10 giorni.

Per questo studio, i topi sono stati randomizzati ai gruppi di trattamento (n = 12/gruppo) basata sulla biopsia pre-studio fibrosi grado ed il peso corporeo. Topi sono stati amministrati veicolo (PBS) o liraglutide (5 nmol/kg) per 42 giorni (veicolo o composto amministrato 10 mL/kg volume, la dose per via sottocutanea, una volta al giorno). Il giorno 42, i topi sono stati eutanasizzati (tramite inalazione di CO2 ) nello stato non a digiuno e fegato asportata ed elaborati per l'istologia.

Quindi di fegato biopsia e terminal pezzi sono stati corretti durante la notte in formalina al 10%, paraffina embedded e trasformati per ematossilina ed eosina e Sirius Red, colorazione tramite protocolli standard9. Sezioni di tessuto sono state valutate in cieco da un patologo secondo la NASH attività Scoring (NAS) sistema1,2. Il NAS riflette il grado di malattia per la steatosi, infiammazione lobulare e dell'epatocita in mongolfiera (ogni parametro dato un punteggio di 0-3) come descritto in precedenza9.

Incorporare una biopsia del fegato nel progetto di questo studio ha permesso per un punteggio di fibrosi (pre-biopsia) di riferimento. Un totale di 118 topi sono stati biopsiati dopo 26 settimane di dieta di NASH e steatosi e fibrosi del fegato sono stati segnati per ogni biopsia (Figura 1). Questi 118 topi, 49 topi sono stati esclusi basato su bassa fibrosi fibrosi alta (Punteggio pari a 0), (Punteggio di 4, che ha esibito la patologia anormale) e la perdita di peso anormale o la guarigione della ferita. Questi criteri di esclusione ammessi per 69 topi lasciato per assegnare in gruppi di studio e cercare miglioramenti nel fenotipo di NASH dopo il trattamento (Figura 1).

Topi sono stati trattati con il veicolo o il liraglutide agonista GLP-1R (5 nmol/kg) per 6 settimane. Nel gruppo trattato con veicolo, 1 mouse esposta fibrosi peggiorata e 4 topi ha mostrati peggioramento NAS segno (Figura 2A-B). Trattamento con liraglutide è stata associata con un miglioramento complessivo della fibrosi (Figura 2), con il 17% del gruppo di trattamento, il miglioramento e l'83% rimanendo invariata. Allo stesso modo, trattamento con liraglutide migliorato il generale NAS score (Figura 2D), con il 66% del gruppo avendo migliorato il Punteggio NAS e il 33% è rimasto invariato.

Inoltre, il trattamento di liraglutide ha migliorato l'infiammazione, con il 75% del gruppo avendo un basso punteggio di infiammazione e 25% è rimasto invariato (figura 3B). Trattamento del veicolo ha peggiorato l'infiammazione, con il 17% del gruppo che ha un più alto punteggio di infiammazione e l'83% è rimasto invariato (Figura 3A). Punteggio di steatosi è rimasto invariato dal basale alla fine dello studio in entrambi i gruppi trattati con veicolo e liraglutide (Figura 3A, B). Pre-vs confronti post-biopsia per topi individuali sull'infiammazione e parametri di volo in mongolfiera sono anche di colore (Figura 3-F).

Figura 1: pre-screening fibrosi del fegato biopsia e NAS Punteggio . (A) rappresentazione di tutte le 118 topi che sono stati sottoposti a screening per fibrosi, tramite biopsia del fegato. (B e C) mostrano la fibrosi basale e Punteggio di NAS, rispettivamente, dopo topi ammissibili sono stati ordinati in gruppi di studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Punteggio di fibrosi e NAS, pre- biopsia e post-intervento. Analisi dei responder per cento per il veicolo (A, C) o i topi trattati con liraglutide (B, D), come misurato dalla biopsia epatica al basale alla fine del campione di studio del fegato per la fase di fibrosi (A, B) e NAS (C, D). Per ogni gruppo, il passaggio dallo pre-studio a biopsia post-studio è indicato da una linea. I punti ad ogni passo notante è leggermente spostato per consentire la separazione visiva degli animali, questo è solo per scopi di visualizzazione e non riflette alcuna differenza nel punteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: steatosi, infiammazione e in mongolfiera, pre- biopsia e post-intervento. Analisi dei responder per cento per il veicolo (A, C, E) o i topi trattati con liraglutide (B, D, F), come misurato dalla biopsia epatica al basale alla fine del campione di studio del fegato per steatosi Punteggio (A, B), l'infiammazione (C, D) e ballooning (E, F). Per ogni gruppo, il passaggio dallo pre-studio a biopsia post-studio è indicato da una linea. I punti ad ogni passo notante è leggermente spostato per consentire la separazione visiva degli animali, questo è solo per scopi di visualizzazione e non riflette alcuna differenza nel punteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

S.O. e C.R. sono dipendenti attuali e/o azionisti di MedImmune/AstraZeneca. JLT era un dipendente e azionista di MedImmune/AstraZeneca nel momento in cui che questi esperimenti sono stati condotti.