Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Sommario

Vi presentiamo un protocollo di schermo semplice soppressore in fissione lievito. Questo metodo è efficiente, privo di sostanza mutagena e selettivo per le mutazioni che si verificano spesso in un singolo locus genomico.  Il protocollo è adatto per isolare i soppressori che alleviare i difetti di crescita in coltura liquida che sono causati da una mutazione o una droga.

Abstract

Un screen genetico per alleli mutanti che sopprimono fenotipici difetti causati da una mutazione è un approccio potente per identificare i geni che appartengono a vie biochimiche strettamente correlate. Metodi precedenti quali la matrice genetica sintetico (SGA) analisi e tecniche di mutagenesi casuale usando raggi ultravioletti (UV) o sostanze chimiche come methanesulfonate etilico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU), sono stati ampiamente usati ma sono spesso costosi e laborioso. Inoltre, questi metodi di screening basato su mutageno sono frequentemente associati a gravi effetti collaterali sull'organismo, inducendo mutazioni multiple che aggiungono alla complessità di isolare i soppressori. Qui, presentiamo un protocollo semplice ed efficace per identificare le mutazioni soppressore in mutanti che conferiscono un difetto di crescita in Schizosaccharomyces pombe. L'idoneità delle cellule ad un deficit di crescita standard multimediali liquido o mezzi liquidi sintetici possa essere monitorato per il recupero utilizzando un lettore di piastra a 96 pozzetti automatizzato per un periodo prolungato. Una volta che una cellula acquisisce una mutazione di soppressore nella cultura, suoi discendenti prevalere quelle di cellule parentali. Le cellule recuperate che hanno un vantaggio di crescita competitiva rispetto a cellule parentali possono essere isolate e backcrossed con cellule parentali. Vengono quindi identificate le mutazioni soppressore tramite sequenziamento intero genoma. Utilizzando questo approccio, abbiamo con successo isolato soppressori più che alleviare i difetti di sviluppo severo causati dalla perdita di Elf1, una famiglia di AAA + ATPasi che è importante nel trasporto di mRNA nucleare e mantenimento della stabilità genomica. Ci sono attualmente oltre 400 geni in S. pombe con mutanti che conferisce ad un difetto di crescita. Come molti di questi geni sono atipici, proponiamo che il nostro metodo si affretterà l'identificazione di nuove interazioni funzionali con questo approccio user-friendly, ad alta velocità.

Introduzione

La base della comprensione di legami funzionali tra geni si basa sulla capacità di identificare i meccanismi molecolari con cui tratti genetici complessi divergono per produrre fenotipi vari¹. Il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la maggior parte dei geni di proteina-codificazione è superflua per redditività². Questo risultato non parla il unimportance di questi geni, ma piuttosto intricati meccanismi compensativi le vie biochimiche a cui appartengono tali geni. Questi meccanismi compensativi di dissezione ha generato epistasi mappe, che hanno scoperto complete interazioni genetiche e ampliato la nostra comprensione dei meccanismi biochimici funzionali^3,4.

Metodi di alto-rendimento (ad es., analisi sintetica matrice genetica o SGA) sono stati sviluppati per identificare interazioni genetiche del genoma in lievito e sono state ampliate per fissione lievito^5,6. Tali approcci si basano spesso su una libreria di valida tutte le singole delezioni gene proteina-codificazione dei ceppi (circa 3.300 mutanti di delezione aploide che coprono oltre il 92% del genoma di lievito di fissione) e richiedono un braccio robotico per eseguire incroci genetici tra il ceppo di interesse e tutti i possibili ceppi nella library6. Inoltre, tecniche di SGA dipendano dalla capacità dei ceppi di libreria per avere la corretta ed efficiente di accoppiamento, un fenotipo che è anormale al 444 attualmente caratterizzati geni in S. pombe².

Nonostante la complessità delle interazioni genetiche, confrontando il fenotipo di un ceppo che trasportano le mutazioni in due geni al fenotipo di due ceppi che presentano mutazioni individuali di ciascun gene può avere uno dei due risultati importanti: 1) il doppio fenotipo mutante è peggio che i fenotipi parentali moltiplicativi previsti sotto forma di malattia o, nel caso più estremo, letalità. Questo è indicato come un'interazione genetica negativa ed è generalmente un segno che i due geni agiscono in parallele vie biologiche. 2) il fenotipo mutante doppio è meglio che la combinazione prevista dei fenotipi parentali, noto anche come una positiva interazione genetica. Una positiva interazione genetica è particolarmente interessante perché indica che questi geni funzionano nello stesso processo. Due geni positivamente interagenti hanno tre potenziali relazioni: un gene mutante può up-regolare l'espressione del gene in un percorso parallelo, due geni possono lavorare in concerto all'interno della stessa via a valle di uno altro, o i due geni codificano per proteine che interagiscono direttamente con l'altro. Di conseguenza, positive interazioni genetiche utilizzabile per nodi normativi gene di mappare e classificare geni atipici nelle vie biochimiche^7,8.

Un soppressore è una mutazione che può alleviare il fenotipo di malattia della mutazione di un altro gene, in genere rappresenta una positiva interazione genetica tra i due geni^9,10. Mutazioni di soppressore su un luogo diverso da quello della mutazione che sopprimono sono conosciute come soppressori di extragenic. Essi sono particolarmente preziosi nello studiare le mutazioni genetiche non vitali di salvataggio sinteticamente il fenotipo letale (conosciuto anche come l'effetto del Lazarus)¹¹. Essi hanno anche potenziali applicazioni terapeutiche nel trattamento di malattie ereditarie^12,13.

Per tutte queste ragioni, l'identificazione di mutazioni soppressore in vari organismi di modello è stata ampiamente utilizzata per facilitare la nostra comprensione di varie vie biochimiche^14,15,16. Screening per soppressori è basato solitamente sul fenotipo della mutazione in questione e richiede lo svolgimento di mutagenesi casuale per isolare le mutazioni che alleggerirebbe il fenotipo. Quasi tutti gli organismi modello hanno stabilito metodi mutagenesi casuale. Ad esempio, N-etil-N-nitrosourea (ENU) ed ethylmethanesulfonate (EMS), due agenti mutageni che sono in grado di indurre mutazioni puntiformi nel DNA, sono largamente impiegate in vari modelli da batteri a topi^17,18,19 . Inoltre, cloruro di manganese è stato utilizzato a lungo sui lieviti per la capacità del catione del manganese di inibire il DNA riparazione vie²⁰. Un altro approccio comune è mutagenesi indotta da UV, che genera il genoma mutagene della pirimidina dimeri^21,22.

Anche se l'utilizzo di mutagenesi chimica per identificare le mutazioni soppressore è stato popolare, il metodo ha molti svantaggi, compreso l'uso di prodotti chimici pericolosi, i tassi di successo altamente variabile e l'introduzione di variabili extra confusione presentato da effetti collaterali negativi di mutageno su più processi cellulari^23,24. Inoltre, mutagenesi chimica induce spesso più mutazioni nel genoma che aggiunge alla complessità dell'utilizzo di genetica e tecniche di sequenziamento per identificare la mutazione esatta che ha conferito il fenotipo soppressore nell' organismo²⁵.

Per colmare le lacune degli attuali approcci di mutagenesi, presentiamo un metodo alla schermata per le mutazioni spontanee soppressore in lievito di fissione che non si basano su qualsiasi mutageni o una libreria di eliminazione. Il metodo consente di isolare soppressori attraverso un test di selezione positiva. Il principio di questo metodo si basa sul vantaggio di crescita della sottopopolazione soppressore mutato in coltura liquida, che può essere monitorata da un lettore di piastre automatizzato. Corrispondersi e meiosi vengono utilizzate solo se uno vorrebbe ripulire il background genetico o confermare la presenza di alleli monogeniche di soppressori prima di sequenziamento intero genoma. Se il fenotipo di soppressione è causato da una singola mutazione, il fenotipo soppressore segregare i 2:2 dopo retroincroci con i ceppi parentali. Le mutazioni di soppressore possono quindi essere identificate mediante sequenziamento intero genoma. Proponiamo che questo metodo è applicabile per lo screening di soppressori in tutti i microrganismi che possono crescere fino a una grande popolazione in coltura liquida.

Protocollo

1. colare costruzione e preparazione

1. Generare una mutazione o una delezione del gene (yfm, tua mutazione preferita) mediante mutagenesi sito-diretta standard (SDM) come descritto in precedenza²⁶.
2. Prima di iniziare lo schermo, (in modo ottimale) incrocio ceppi mutanti con un ceppo selvaggio-tipo per pulire il background genetico e generare cellule mutanti fresco-Nato come i ceppi parentali. Striscia il ceppo parentale alle singole colonie su piastre standard multimediali. Scegliere casualmente le otto e le sedici colonie indipendenti (biologica replica) con le mutazioni desiderate per l'analisi del lettore piatto (Vedi 3.1).
   Nota: Questo protocollo è efficace solo quando i ceppi parentali hanno una crescita difetto nei mezzi liquidi (minimo o ricco, con o senza droga o cambiamenti di temperatura che causano il difetto di crescita). Tutti i ceppi parentali dovrebbero essere aploide e quindi in grado di essere geneticamente incrociati con altri ceppi aploidi con un tipo di accoppiamento complementare.

2. analisi del lettore piatto

1. Con un applicatore sterile, prelevare una piccola quantità di ognuna delle colonie preparate al punto 1.1 (nessun importo esatto necessario per inoculare l'avviamento della coltura) e posto in una micropiastra 96 pozzetti in polistirolo. Sospendere ognuna delle colonie in 200 µ l di supporto liquido appropriato (ricca o minimale, con o senza droga). Includere un pozzetto vuoto per ogni riga sulla piastra contenente 200 µ l del supporto stesso (senza cellule).
2. Esegui il seguente protocollo su un software di rilevazione di piastra lettore collegato a un lettore di micropiastre automatizzato: impostare un programma cinetico per 24 h e temperatura a 30 ° C, con continua agitazione veloce orbitale (425 cpm, 3 mm di ampiezza). Impostare le letture ottiche per misurare la dispersione della luce alla lunghezza d'onda di 600 Nm per densità ottica e la luce per leggere da sotto la piastra ad una frequenza di lettura di 2 min (721 letture totale su un periodo di 24-h per pozzetto).
3. Dopo 24 h, registrare le letture di densità ottica tranciate finale (tranciate OD600) e utilizzare la seguente formula per determinare il volume necessario per diluire ciascuno dei campioni verso il basso per O.D. = 0.1:
   
   Nota: Esportare i dati dal software di lettore di piastra e utilizzare un software di foglio di calcolo per inserire la formula di cui sopra come una funzione batch elaborare il volume di diluizione per essere utilizzato da ogni pozzetto sperimentale.
4. Ogni 24h, diluire ciascuno dei campioni utilizzando lo stesso supporto come giorno 0 a O.D. = 0.1 (circa 1.5 x 10⁶ cellule/mL) utilizzando la formula indicata al punto 2.3. Salvare tutte le crescita curve generato ogni giorno e prendere nota di qualsiasi Colonia individuo che mostra un tasso di crescita, giudicato da un O.D. finale che è significativamente più alto rispetto al resto del gruppo con lo stesso background genetico o da una curva di crescita che è simile a quella di colonie di selvaggio-tipo.
   Nota: Questo test richiede solitamente circa 7-14 giorni. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili.

3. selezione delle colonie del soppressore e conferma del fenotipo.

1. Dall'ultimo giorno dell'analisi del lettore piatto (punto 2.4), salvare le colture liquide che hanno un tasso di crescita notevolmente recuperato, presumibilmente guadagnando una mutazione di soppressore che può alleviare il fenotipo della mutazione parentale. Trasferire e mescolare coltura liquida di 250 µ l di un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contenente 250 µ l di glicerolo al 50%. Flash congelare le cellule in azoto liquido e salvare i ceppi a - 80oC a tempo indeterminato.
2. Per confermare che la mutazione di soppressore è un elemento geneticamente ereditabile, utilizzare metodi di incrocio genetico standard per attraversare yfm P (per parentale, il ceppo utilizzato all'inizio dell'analisi del lettore piatto) con yfm S (per soppressore, il ceppo salvato al termine dell'analisi del lettore piatto). Se la mutazione di soppressore è infatti un elemento geneticamente ereditabile, yfm P × yfm S dovrebbe produrre tetradi in cui due colonie hanno il fenotipo di malattia del ceppo parentale e due colonie hanno il tasso di crescita recuperati del soppressore ceppo.
3. Dalla Croce di passo 3.2, scegli tre colonie con il fenotipo soppressore (ceppo S) e tre colonie con il fenotipo parentale (ceppo P) dalla stessa genetica croce (3 replicati biologici per ciascuno) e procedere con l'estrazione del DNA genomico e procedura di sequenziamento riportata di seguito.
   Nota: Punti 3.2 e 3.3 sono altamente raccomandati, ma non sono necessari. In alternativa, uno può diffondere cultura liquido recuperato raccolto da 3.1 su supporto ricco in singole colonie, quindi scegliere casualmente tre colonie come biologici triplici copie per il sequenziamento di intero genoma senza ulteriore conferma genetica. In questo caso, tre triplici copie biologiche del ceppo parentale devono essere utilizzati per il confronto di sequenziamento genomico.

4. genomic del DNA estrazione, produzione di biblioteca e sequenziamento.

1. Per estrazione del DNA, preparazione libreria e l'ordinamento, scegliere casualmente tre replicati biologici al ceppo yfm P e tre biologico replica di ogni ceppi individualmente arisen yfm S da incroci genetici (punto 3.2) o dalla piatti che sono state diffuse per ottenere singole colonie del ceppo S (nota del punto 3.3).
2. Coltivare ceppi nelle culture 10ml in contenuti multimediali alla fase di Mid-registro (O.D. = 0,5 – 0,8, circa 0,75 – 1.2 x 10⁷ cellule/mL) e usare un incubatore di agitazione per coltivare colture liquide a 30 ° C con agitazione continuamente a 250 giri/min. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4 ° C per 5 minuti a 1000 x g.
3. Sospendere pellettate cellule in 400 µ l di tampone di estrazione del DNA (2% Triton X-100, 1% SDS, NaCl 100 mM, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM Na₂-EDTA), quindi aggiungere 400 µ l di perle di vetro e 400 µ l di 25:24:1 fenolo: cloroformio: alcool isoamilico. Vortexare vigorosamente per 2 min a 4 ° C.
4. Aggiungere un ulteriore 200 µ l del tampone di estrazione del DNA e mescolare capovolgendo più volte. Centrifugare per 5 min a 4 ° C a 20.000 x g.
5. Trasferire la fase acquosa in una provetta pulita, aggiungere 20 µ g di mix di RNasi A/T1 e incubare a 37 ° C per 15 min.
6. Aggiungere un volume equivalente di 25:24:1 fenolo: cloroformio: alcool isoamilico, spin per 5 min a 4 ° C a 20.000 x g, quindi trasferire la fase acquosa in una provetta pulita.
7. Aggiungere un volume equivalente di cloroformio, miscelare capovolgendo più volte, poi girare per 5 min a 4 ° C a 20.000 x g, poi trasferire la fase acquosa in una provetta pulita.
8. Precipitato DNA con due volumi di etanolo al 100% più 10% del volume di 3 M NaOAC (pH 4,3) a-20 ° C per almeno 2 ore, poi girare per 5 min a 4 ° C a 20.000 x g e raccogliere il pellet.
9. Lavare il pellet (precipitato DNA) due volte con etanolo al 70% refrigerati (Centrifugare a 20.000 x g, 5 min, 4 ° C) e sospendere il pellet in 50 µ l di 10 mM Tris tampone (pH 7,4).
10. Uso una preparazione libreria kit (Vedi Tabella materiali) a raccomandazioni del produttore per preparare la libreria di sequenziamento intero genoma.
    Nota: si consiglia il kit elencato nella Tabella materiali perché permette la costruzione della libreria genomica senza amplificazione di PCR, che minimizza le mutazioni di errore generate durante l'amplificazione di PCR. Inoltre, durante la preparazione di libreria genomica, non consentono le perline per asciugare completamente abbreviando il tallone asciugatura tempo per 1 – 2 min.
11. Per i parametri di taglio durante la preparazione di libreria, utilizzare un sonicatore concentrato (Vedi Tabella materiali) e impostare il fattore di utilizzo al 20%, potenza di picco a 175 W, con 200 cicli al burst, e modalità di frequenza spazzamento a 5.5oC a 6 ° C per 45 s. in alternativa, utilizzare un DNA e chomatin sistema di taglio (Vedi Tabella materiali) con le seguenti impostazioni: ampiezza di 50% a 4 ° C con modalità impulso, 15 s s on e 15 fuori per 10 min, con un tempo di elaborazione totale di 20 min.
12. È essenziale per gestire i materiali pericolosi utilizzati in questo passaggio con cura. Consultare l'appropriato Material Safety Data Sheets e dell'istituzione salute ambientale e sicurezza Office per la gestione NaOAC, etanolo, 25:24:1 fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e cloroformio.
13. Sequenza le librerie genomiche risultante. Le letture di sequenziamento intero dovrebbero coprire almeno tre volte dell'intero genoma con la risoluzione a una gamma di singolo nucleotide. Sequenziamento accoppiato-si è conclusa (o tecnologie) sono raccomandata.

5. analisi bioinformatica per l'identificazione delle mutazioni soppressore

1. Eseguire l'analisi bioinformatica di concentrarsi sui cambiamenti genomici che sono costantemente identificati tra genitori e soppressa yfm ceppi nei tutti biologici replica.
   Nota: Il processo completo della pipeline è descritto di seguito, ma, inoltre, due file di script BASH testo, fastq_to_vcf.sh e vcfprocess.sh, sono inclusi come materiali supplementari per mostrare esempi del flusso di lavoro dall'elaborazione di letture alla variante VCF file, elaborazione e incrocio tra il VCF file, rispettivamente.
2. Trim breve-letture utilizzando taglio (https://github.com/jbpease/shear) seguendo le linee di comando (tutte le altre opzioni impostazione predefinita):
   shear.py - fq1 $FASTQ1 - fq2 $FASTQ2 - out1 $OUTFQ1 - out2 $OUTFQ2 \
   -barcodes1 $BARCODE - piattaforma TruSeq - trimqual 20:20 \
   -trimpolyat 0 - trimambig - filterlength 50 - filterunpaired
3. Mappa legge a v 2.30 del genoma di riferimento S. pombe ottenuti da PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) utilizzando BWA v0.7.15²⁷. Utilizzare la seguente riga di comando (tutte le altre opzioni impostazione predefinita):
   BWA mem -t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1
4. Mettere file di allineamento SAM attraverso GATK consigliate pipeline di²⁸ per la variante chiamata utilizzando GATK v 3.6²⁹, PicardTools v 2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) e SAMtools v 1.3.1³⁰. Utilizzare le seguenti righe di comando e parametri (tutte le altre opzioni impostazione predefinita):
   Java-Xmx30g-jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT = $SAM1 \
   USCITA = $BAMMARKED RGID = 1 RGLB = lib01 RGPL = illumina \
   RGPU = $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER
   samtools fixmate - O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
   samtools ordinare - O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED
   Indice di samtools $BAMSORTED
   Java-Xmx30g-jar GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller \
   -R $GENOME-ho $BAMSORTED..--genotyping_mode scoperta \
   -stand_emit_conf 10 - stand_call_conf 30 -o $VCFRAW
5. Comprimere e indicizzare i file VCF utilizzando tabix:
   bgzip $VCFRAW.vcf
   tabix $VCFRAW.vcf.gz
6. Confrontare i file VCF tra genitori e soppressore ceppi sequenziamento replicati utilizzando BCFtools v 1.3.1²⁷. Utilizzare le seguenti righe di comando e parametri (tutte le altre opzioni sinistra predefinito):
   bcftools isec - n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
   $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
   Nota: Questo comando ha prodotto un file codificato con modelli binari dove varianti di sequenza che appare nel primo mutante solo sarebbe con codifica binaria come "000100", il mutante secondo solo come "000010", tutti e tre i mutanti come "000111," ecc. Questi file sono stati generati per ogni set di parentale e mutante replicare i file VCF.
7. Compilare i file di elenco di intersezione variante insieme con il nome del file aggiunto a ogni riga utilizzando il comando grep di UNIX:
   grep "." *.list > all.list
8. Creare riferimenti incrociati tra la lista completa della variante con il corrente file di annotazione di GFF3 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) utilizzando uno script Python personalizzato (variant_characterize.py) per identificare siti SNP coerente in regioni (sinonima e non sinonimo), 5 ' e 3 ' UTR e ncRNA proteina-codificazione.
   python3 variant_characterize.py - elenco common_variants.list \
   gff - schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \
   -fasta Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.DNA.Genome.fa \
   -modello 000100..--fuori all.list.filter.000100
   Ripetere questa modifica di script--modello e il suffisso del file di output (..--fuori) utilizzando il file binario
   modelli: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101 e 000111
9. Combinare l'output da tutti questi esecuzione di script in un file separato da tabulazioni, per essere visualizzato come un foglio di calcolo. La tabella con annotazioni di varianti include quelli che compaiono in uno o entrambi ceppo mutante rispetto al background. Il campo flag binario denota sia comparsa in un singolo ceppo mutante (000100, 000010, 000001), due ceppi mutanti (000011, 000101, 000110), o tutti e tre i ceppi mutanti (000111).
10. Analizzare gli elenchi di uscita annotato delle varianti non trovato nei campioni dei genitori, ma trovato in uno, due o tutti e tre i campioni mutanti. L'annotazione denota la posizione genomica e la classe della variante (sinonimo/non-sinonimo in una regione di codificazione, 3' / 5' UTR, non codificanti, ecc.). Da questa lista delle mutazioni del candidato, un esempio di un candidati fortemente rilevante potrebbe essere una variante non-sinonimo di codifica che appare costantemente in tutti e tre i ceppi. Un altro tipo di candidato forte sarebbe un accumulo di varie mutazioni di regolamentazione non sinonimo o presunti in ceppi mutanti che appaiono vicini o all'interno del gene stesso.

Risultati

Crescita lenta mutanti mostrano recupero fenotipica in coltura liquida
Abbiamo selezionato tre mutanti coinvolti in una varietà di percorsi biologici con un fenotipo malato, crescita lenta,: AAA famiglia dell'atpasi Elf1 istone deacetilasi Clr6 componente e complessi di giunzione esone Fal1. Un ceppo di tipo selvatico e ceppi che trasportano le mutazioni di questi tre geni che erano stato backcrossed con selvaggio-tipo ceppi erano striati di diverse colonie, e 16 singole colonie sono stati scelti a caso per essere coltivate in liquido multimediali utilizzando la piastra a 96 pozzetti come descritto in precedenza. Curve di crescita di diverse colonie sono state registrate presso il punto di tempo iniziale (giorno 0) e per 6 giorni con monitoraggio continuo utilizzando il lettore di piastra. Come previsto, colonie di selvaggio-tipo non mostrano nessun cambiamenti notevoli nelle loro curve di crescita in tutto l' esperimento³¹ (Figura 1). In particolare, quattro colonie con lo sfondo di elf1∆ e uno fal1∆ Colonia mostrano un cambiamento drammatico in crescita da crescita lenta ad alcuni livelli variabili di crescita simile o vicino a quello delle colonie di selvaggio-tipo. Drammaticamente, tutti i mutanti di clr6-1 mostrano un consistente recupero fenotipico, cresce a un ritmo più veloce entro la fine del saggio³¹ (Figura 1). Per caratterizzare i fenotipi differenti, ci riferiamo ai ceppi originali che sono a crescita lenta come "P" (o ceppi ceppi parentali) e ai ceppi risultati fenotipico recupero come "S" (o ceppi ceppi soppresse). Siete pregati di notare che nella figura 1 è un esempio di un round dell'esperimento lo screening e non rappresenta i totali soppressori non complementari identificati e sequenziati nei seguenti risultati rappresentativi.

Recupero fenotipica è attribuita a tratti ereditari
S. pombe può crescere come un aploide a contenuti multimediali, ma due ceppi aploidi con il compagno di tipi accoppiamento complementare sotto fame di azoto. Meiosi nel lievito di fissione comporta un turno di duplicazione seguita da due cicli di divisione cellulare. Il ciclo sessuale provoca la formazione di quattro spore aploidi che trasportano il materiale genetico del ceppo parentale con 2:2 segregazione dei caratteri genetici seguendo le regole della genetica mendeliana classica (Figura 2A). Quando coltivate nello stesso piatto per la stessa quantità di tempo, abbiamo confermato la segregazione di 2:2 quando tutti indietro-incrocio soppresso ceppi (ceppi di S) con loro ceppi parentali (ceppi di P), che ha provocato 2 piccole (difetto di crescita) e 2 grandi (fenotipo soppressore) colonie. Singoli esempi per le cellule elf1∆, clr6-1 e fal1∆ soppressi sono mostrati in Figura 2B. Abbiamo confermato che tutti i ceppi isolati di S portano un elemento genetico monogenico che sopprime il fenotipo di crescita lenta dei loro ceppi di P (dati non mostrati).

Sequenziamento di intero genoma identifica correttamente le mutazioni soppressore
Ad esempio, abbiamo usato il sequenziamento del genoma intero accoppiato-fine per identificare gli elementi genetici responsabili per il recupero fenotipico in ceppi di elf1∆ S . Una descrizione più completa di analisi dei dati è disponibile online³¹. In breve, abbiamo impiegato biologici triplici copie di due ceppi di elf1∆ P indipendentemente generato e biologici duplicati dei cinque gruppi non-complementare di ceppi di elf1∆ S , ognuno dei quali contiene diversi soppressori. Dopo che abbiamo ottenuto un elenco di varianti con annotazioni da analisi bioinformatica (6,1-10), abbiamo una priorità determinate classi di varianti che erano pertinenti alla nostra analisi. Ci siamo concentrati sull'identificazione di costanti cambiamenti genomici che erano identici in tutto dei replicati biologici di singoli ceppi di elf1∆ S rispetto ai loro ceppi parentali elf1∆ P (Figura 3 e supplementari tabelle 1-4 ). Abbiamo identificato cinque nonsynonymous modifiche alle regioni di CD in tutti i cinque diversi ceppi elf1∆ S , tra cui rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + e rpl2702 +. Sia S-A1 e A2 S contengono mutato SPBPJ4664.02, anche se le mutazioni si verificano in diversi amminoacidi. Perché SPBPJ4664.02 è un gene lungo (11.916 nucleotidi) con centinaia di ripetizioni, le mutazioni non potevano essere confermata effettuando PCR seguita dall'ordinamento. S-A3 contiene un mutante di delezione in rli1 che è coerente in entrambi biologici duplicati. Tuttavia, il mutante non ha fatto co-segregano con il fenotipo di S elf1∆ sfondo. Abbiamo identificato un mutante cue2 (cue2-1) in S-B1, con gli aminoacidi mancanti 396-400. S-B2 contiene un mutante di rpl2702 (rpl2702-1), che cambia dell'amminoacido alla posizione 45 da glicina ad aspartato³¹. Sia cue2-1 e rpl2702-1 sono stati confermati come soppressori di elf1∆ , come illustrato di seguito.

Conferma genetica delle mutazioni identificate soppressore verifica l'ereditabilità del fenotipo recupero
Due delle modifiche nonsynonymous identificate, cue2-1 e rpl2702-1, sono state ricostruite in laboratorio utilizzando protocolli standard per mutagenesi sito-diretta. Doppio mutante ceppi cue2-1 P elf1∆ e rpl2702-1 elf1∆ P furono incrociati con i gratuiti elf1∆ P ceppo³¹ (Figura 4). Se le mutazioni nonsynonymous, identificate attraverso questa schermata, fossero sufficienti a sopprimere elf1∆ P, quindi i risultante tetradi mostrerebbe un 2:2 piccolo grande rapporto nelle colonie risultanti da 4 spore in ogni tetrade. Infatti, incrocio genetico ha mostrato che le mutazioni identificate soppressore hanno successo nel sopprimere il fenotipo di crescita lenta di elf1∆ P e sono ereditabili.

Figura 1: recupero fenotipica può essere monitorato tramite la registrazione di curve di crescita in un lettore di piastra. Sedici singole colonie di wild-type (WT), elf1∆, clr6-1e fal1∆ sono stati collocati in una piastra a 96 pozzetti. Curve di crescita sono state registrate su un periodo di 24 h e colonie erano ri-diluiti al giorno in contenuti multimediali. Il difetto di crescita è evidente per la bassa assorbanza (O.D.) alla fine del periodo di 24 ore il giorno 0. Ceppi fenotipico recuperati sono quelli che visualizzano una curva di crescita simile, o vicino a, quello di selvaggio-tipo durante il periodo di 24 ore il giorno 6. Quattro colonie di elf1∆, una colonia di fal1∆e tutte le colonie di clr6-1 ha mostrato vari livelli di recupero fenotipica dopo 6 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: incrocio genetico può confermare che il recupero fenotipico è attribuito a un singolo allele ereditabile. (A) quando lievito di fissione cellule sono sottoposte alla fame di azoto, due cellule aploidi con un tipo di accoppiamento complementare in grado di generare uno zigote che sporulates per generare una tetrade di 4 spore. I materiali genetici dei genitori saranno segregare durante la meiosi seguendo le regole della genetica mendeliana. (B) recuperato fenotipico colonie (con etichetta S, per soppressa) con indicato genotipi parentali erano incrociata al rovescio con loro colonia dei genitori gratuito (che non mostra nessun recupero fenotipico, etichettato P, per parentale). Incroci genetici risultati 2:2 piccoli (scarsa idoneità) alle colonie di grande (recuperati fitness) dimostrano che il recupero fenotipico è ereditabile e può essere attribuito a un singolo elemento genetico. Nelle caselle rosse sono colonie che trasportano l'allele di soppressore e scatole blu sono colonie che trasportano l'allele parentale. Questa figura è stata modificata da Marayati et al., 2018³¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: analisi dei dati di sequenziamento del genoma per identificare gli elementi genetici responsabili di recupero fenotipico. Tre biologico replica di due ceppi parentali di "P" (P-A e P-B), e due repliche biologiche di cinque fenotipico recuperato commutato ceppi di "S" (S-A1, S-A2 e A3 S - recuperato dal P-A; S-B1 e S-B2 dal P-B), sono stati sequenziati e le mutazioni sono state organizzate come un elenco di ogni mutazione nel ceppo recuperato rispetto al genoma del ceppo parentale è stato derivato da (per esempio, P-A vs S-A1, ecc.). Il numero totale delle mutazioni rilevate attraverso l'intero genoma di tutte le tali confronti a coppie era 660. Un totale di 44 mutazioni sono state identificate quando sono state selezionate solo le mutazioni che si verificano in entrambi replicati biologici dello stesso ceppo "S". Fuori 44 mutazioni, 12 mutazioni erano inserzione/delezione (INDEL) o non - sinonima mutazioni. Fuori il 12 INDEL o mutazioni non-sinonimo, cinque si sono presentati nella sequenza di codificazione della proteina. Le cinque mutazioni potenzialmente correlano con il singolo elemento genetico responsabile per i ceppi fenotipico recuperati: una mutazione non-sinonimo in SPBPJ4664.02 trovata in S-A1 e S-A2, INDEL in rli1 trovato in S-A3, INDEL in cue2 trovato in S-B1 e non sinonimo mutazioni in rpl2702 trovato in S-B2. Sequenza dettagliata informazioni sulle mutazioni e il sottofondo sono incluso nel supplementare tabelle 1-4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: conferma di soppressori identificato mediante sequenziamento intero genoma. Risultati dal sequenziamento intero genoma sono stati confermati in modo indipendente generando le mutazioni ed eseguendo attraversa genetici per confermare il recupero fenotipico incrociando un ceppo di elf1∆ cue2-1 con un ceppo di P elf1∆ e elf1∆ rpl2702-1 con ceppo di elf1∆ P . Sono mostrati tre rappresentante tetradi verticale. Nelle caselle rosse sono colonie di doppio-mutante (elf1 cue2-1, o elf1 rpl2702-1); scatole blu sono colonie di elf1∆ . Questa figura è stata modificata da Marayati et al., 2018³¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare nella tabella 1. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella. 

Supplemental tabella 2 . Per favore clicca qui per scaricare questa tabella. 

Supplemental tabella 3 . Per favore clicca qui per scaricare questa tabella. 

Supplemental tabella 4 . Per favore clicca qui per scaricare questa tabella. 

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Discussione

Il protocollo descritto qui rappresenta un romanzo e una semplice schermata per le mutazioni spontanee soppressore rilevabile attraverso recupero fenotipica delle mutazioni che conferiscono una crescita lenta nel lievito di fissione, un fenotipo caratteristico di oltre 400 geni in S. pombe, la funzione di molte delle quali rimane sconosciuto^2,32. Metodi precedenti hanno preso altri approcci allo schermo per mutazioni soppressore nei microrganismi, tra cui l'uso di agenti mutageni²¹, o l'applicazione di un cambiamento di temperatura in sfondi mutante termosensibile³³. Al contrario, questo protocollo Mostra che recupero fenotipico si verifica senza interferenza ambientale/chimico ed evidenzia il vantaggio di fitness dell'aumento delle mutazioni di soppressione alla fine prendendo sulle risorse disponibili in liquido cultura. Questa schermata permette l'isolamento di soppressori di bypass o di soppressori di interazione perché è efficace per entrambe le mutazioni di perdita-de-funzione come elf1∆ o fal1∆ e mutazioni puntiformi come clr6-1, fintanto che i mutanti dimostrano i difetti di fitness in coltura liquida.

Finora, tutti i ceppi di S recuperati che abbiamo studiato hanno dimostrato vari gradi di recupero fenotipica. Come rilevato attraverso incroci genetici, il fenotipo recuperato è attribuibile ad un singolo elemento genetico ed è ereditabili (esempi mostrati nella Figura 2). Questo è uno dei vantaggi più significativi di questo metodo rispetto agli schermi di soppressore basato su UV o chimico, che spesso prendono di mira più loci genomici. È comune osservare una o due colonie recuperati fuori 16 colonie/ceppo (10% circa) entro una settimana. Tuttavia, abbiamo notato che alcuni mutanti, come ad esempio la perdita di funzione di Rrp6, la subunità nucleari specifici esosomi, mai recuperato per il tasso di crescita quasi selvaggio-tipo osservato in cellule di elf1Δ ³¹. È probabile che la funzione di Rrp6 può essere compensata solo parzialmente da soppressori, a differenza della funzione di altri mutanti testato, tra cui fal1∆, che è stato indicato per causare un grave difetto meiotico attraverso la sua importante funzione nella regolamentazione ³⁴di splicing. Noi crediamo che soppressore alternativi metodi di screening sarebbe soggetto al problema stesso quando yfg ha ruoli unici, non sostituibile nella crescita delle cellule.

Prima di eseguire il sequenziamento genomico, è ottima per retro-croce le colonie fenotipico recuperate, identificate dal lettore della piastra, con i ceppi parentali per cancellare i precedenti genetici e ottenere repliche biologiche. Inoltre, sequenziamento profondo intero genoma identifica centinaia di modifiche di singolo nucleotide, la maggior parte dei quali non sono identica tra repliche biologiche che sono di scarso interesse per lo screening. Ad esempio, abbiamo trovato un totale di 660 alterazioni genomiche tra tutti i tre cromosomi tra le due elf1Δ P e cinque diversi ceppi di S (Figura 3). Non abbiamo comunemente osservato mutazioni identiche tra biologico sequenziata replica di ogni ceppo, suggerendo che nuove mutazioni possono sorgere durante la coltura delle cellule di elf1Δ prima della costruzione della libreria genomica o errori casuali possono essere introdotta durante la costruzione della libreria e il sequenziamento. Quindi, isolando le mutazioni che sono coerenti in replicati biologici è un aspetto importante nell'identificazione riuscita di soppressori mediante sequenziamento intero genoma.

Abbiamo identificato e confermato due soppressori nelle regioni di CD in cinque sequenziate ceppi di S. Sebbene sia S-A1 e A2 S ceppi sono state individuate mutazioni in SPBPJ4664.02 , è improbabile che SPBPJ4664.02 è un soppressore valido perché S-A1 e S-A2 non contengono un soppressore sullo stesso gene, come non sono complementari con l'altro ( dati non mostrati). Abbiamo anche avuto conferma non rli1 in S-A3, che non ha fatto co-segregano con il fenotipo di S quando backcrossed con elf1Δ. In alternativa, abbiamo trovato specifiche mutazioni nelle regioni non codificanti in S-A1, A2-S e S-A3. È possibile che queste regioni genomiche non codificanti alterate alleviare il fenotipo di elf1Δ , che sarà affrontato nei nostri studi futuri. Rispetto ai metodi tradizionali come un'analisi di linkage, che può richiedere anni per mappare una mutazione genetica, abbiamo identificato due soppressori entro due mesi dopo la conferma che un elemento monogenico causato il fenotipo di S. Con il rapido sviluppo della tecnologia di sequenziamento di interi genomi, siamo ottimisti che questo metodo sarà più efficiente per identificare le mutazioni genetiche coerente nel prossimo futuro.

In sintesi, questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per identificare con successo le mutazioni soppressore per ogni gene di interesse con un difetto di crescita lenta in coltura liquida. La semplicità di questo test consente per lo screening su larga scala dei più ambiti di provenienza genetici di interesse con poco addestramento hands-on. C'è spazio per automatizzare ulteriormente il processo utilizzando un robot di manipolazione dei liquidi per eseguire le diluizioni quotidiane. Poiché il laboratorio di manipolazione di microrganismi richiede inevitabilmente la crescita in coltura liquida, un processo che è intrinsecamente selettivo per il fitness, proponiamo che questo protocollo può essere ampiamente applicato ad altri organismi di modello di grande popolazione come i batteri e altre specie di lieviti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenina, polvere	Acros Organics	147441000	Utilizzare a 75 mg/L per rendere liquidi e solidi ricchi terreni (YEA)
Batteriologia Petri Dish	Corning, Falcon	C351029	100 & 15 mm, utilizzare per far crescere ceppi in singole colonie su terreni solidi ricchi
D-glucosio anidro, polvere	Fisher Chemical	D16-1	Utilizzare a 30 g/L per produrre terreni ricchi liquidi e solidi (YEA)
Difco Agar, Granuated	Becton, Dickinson and Co.	214530	Utilizzare a 20 g/L per realizzare terreni ricchi solidi (YEA)
Tampone			2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA
Ultrasuoni focalizzati	Covaris Inc.	S220	In alternativa, utilizzare il sonicatore/sistema di taglio del DNA e della cromatina QSonica Q800R
Software di raccolta e analisi dati Gen5	Biotek, Inc.	GEN5SECURE	O equivalente, deve essere compatibile con il lettore di micropiastre, da utilizzare per esportare le letture dei dati dal lettore di micropiastre
Acido cloridrico 1N, liquido	Fisher Chemical	SA48-4	Da utilizzare per regolare il pH a 5,5 in terreni ricchi liquidi e solidi
Terreni ricchi liquidi (YEA liquido)			30 g/L di D-glucosio, 5 g/L di estratto di lievito, 75 mg/L di adenina, pH regolato a 5,5 con lettore di micropiastre HCl da 1 M
, lettore multimodale ibrido Synergy H1	Biotek, Inc.	BTH1MG	O equivalente, deve leggere la luce visibile a una gamma di lunghezze d'onda di 600 nm
Piastre di agar Rich Media (piastre YEA)			30 g/L di D-glucosio, 5 g/L di estratto di lievito, 75 mg/L di adenina, 20 g/L di Agar, pH regolato a 5,5 con 1 M HCl.
Miscela di RNasi A/T1	Thermo Fisher Scientific	EN0551	Utilizzare secondo le raccomandazioni del produttore
Anello di inoculazione in polistirene sterile	Corning, Inc.	OS101	O equivalente, da utilizzare per trasferire le colonie da piastre di agar a piastre a 96 pozzetti
Spazio di lavoro sterile e bruciatori Piastra
colture tissutali, fondo piatto ottico a 96 pozzetti con coperchio a bassa evaporazione Corning	, Falcon	C353072	O equivalente, deve avere un fondo piatto ottico per la preparazione
micropiastra Kit di preparazione della libreria LT/HT TruSeq DNA PCR-Free Illumina	, Inc.	20015962	Utilizzare per preparare la libreria di sequenziamento dell'intero genoma
Estratto di lievito, polvere	Fisher Chemical	BP1422-500	Utilizzare a 5 g/L per produrre terreni ricchi di liquidi e solidi (YEA)