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Articolo metodologico

Preparazione del campione per l'analisi di proteomica massa-spettrometria-basato di microvasi oculari

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DOI:

10.3791/59140

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22 febbraio 2019

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1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Proteoma caratterizzazione dei letti microvascolari oculari è fondamentale per la comprensione approfondita di molte patologie oculari in esseri umani. Questo studio dimostra un metodo efficace, rapido e affidabile per estrazione di proteine e preparazione del campione da piccoli vasi sanguigni che impiegano porcine brevi arterie ciliary posteriori come vasi di modello per le analisi di base di spettrometria di massa proteomica.

Abstract

L'uso dei vasi sanguigni oculari isolati in vitro per decifrare lo stato fisiopatologico dell'occhio utilizzando le più avanzate metodologie ha notevolmente ampliato la nostra comprensione di alcune malattie. Spettrometria di massa (MS)-base proteomica è emerso come un potente strumento per svelare le alterazioni nei meccanismi molecolari e proteina vie nei letti vascolari nella salute e nella malattia di segnalazione. Tuttavia, procedura di preparazione del campione prima dell'analisi MS è cruciale per ottenere risultati riproducibili e approfondita delucidazione del proteoma complessa. Ciò è particolarmente importante per la preparazione di microvasi oculari, dove la quantità di campione disponibile per analisi è spesso limitata e, pertanto, rappresenta una sfida per l'estrazione proteica ottimale. In questo articolo si sforza di fornire un protocollo efficiente, rapido e robusto per la preparazione del campione da un esemplare retrobulbar oculare letto vascolare che impiegano porcine brevi arterie ciliary posteriori. Il presente metodo si concentra sulle procedure di estrazione di proteine dal surnatante e pellet del campione dopo omogeneizzazione, campione di pulizia con dispositivi centrifughi prima unidimensionale gel elettroforesi e peptide di purificazione passaggi per quantificazione privo di etichetta in un liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-lineare trappola ionica-Orbitrap MS sistema. Anche se questo metodo è stato sviluppato specificamente per le analisi di proteomica di microvasi oculari, abbiamo anche fornito prove convincenti che può essere prontamente utilizzato anche per altri campioni tissutali.

Introduzione

Il progresso nel campo della proteomica, quali permessi integrati e insuperabile potere di raccolta di dati, notevolmente ha rivoluzionato la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di determinate condizioni di malattia anche come riflettendo la stato fisiologico di una cella specifica popolazione o tessuto1,2,3,4. Proteomica ha anche dimostrato di essere una piattaforma importante nella ricerca oftalmica a causa della sensibilità e analisi imparziale di diversi campioni oculari che ha facilitato l'identificazione di potenziali marcatori di malattia per eventuale diagnosi e prognosi, come evidenziato con eleganza da molti studi negli ultimi anni, tra cui alcuni dei nostri1,5,6,7,8,9,10. Tuttavia, spesso è difficile ottenere campioni umani per analisi proteomica per ragioni etiche, soprattutto considerando la necessità di controllo materiale da individui sani per analisi comparative affidabili. D'altra parte, è anche difficile da ottenere una quantità sufficiente di campioni per analisi di spettrometrihe di massa ottimale e affidabile. Ciò è particolarmente importante per la massa limitata materiali biologici quali il micro-vasi sanguigni dell'occhio. Uno tale vaso sanguigno principale retrobulbar che svolge ruoli fondamentali nella regolazione del flusso sanguigno oculare è Arteria ciliare posteriore corto (sPCA). Qualsiasi perturbazione o anomalie in questo letto vascolare possono portare a gravi conseguenze cliniche, che possono portare alla patogenesi di diverse malattie avvistare-minacciosa come glaucoma e nonarteritic neuropatia ottica ischemica anteriore (NAION)11 , 12. Tuttavia, c'è una mancanza di studi delucidando i cambiamenti del proteoma in questo letto arterioso dovuto gli inconvenienti di cui sopra. Di conseguenza, negli ultimi anni, i maiali di casa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) sono emerso come un buon modello animale nella ricerca oftalmica a causa le somiglianze morfologiche e filogenetiche alte tra esseri umani e suini13, 14,15. Porcini campioni oculari sono facilmente disponibili e la cosa più importante, sono la rappresentazione più accurata di tessuti umani.

Considerando il ruolo importante di questi vasi sanguigni nell'occhio, come pure la scarsità di metodologia era adatta per estrazione della proteina efficiente e analisi da questi microvasi, precedentemente abbiamo caratterizzato il proteoma della sPCA porcina utilizzando un in-House protocollo che ha provocato l'identificazione di un numero elevato di proteine16. Sulla base di questo studio, abbiamo ulteriormente ottimizzato e descritto approfondita la nostra metodologia in questo articolo, che consente analisi del proteoma da piccole quantità di campioni utilizzando la sPCA suina come tessuto di modello. Anche se lo scopo principale di questo studio era di stabilire una metodologia di MS-compatibile per vasi sanguigni oculari di massa limitata, abbiamo fornito evidenze sperimentali che il flusso di lavoro descritto può anche essere ampiamente applicata a vari campioni tissutali.

È prevedibile che questo flusso di lavoro sarà utile per la preparazione di campioni di alta qualità compatibile con MS da piccole quantità di materiali per l'analisi del proteoma completo.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali utilizzando campioni di animali sono state eseguite scrupolosamente l'associazione per la ricerca in visione e Oftalmologia (ARVO) istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e dalle linee guida istituzionali. Questo studio è stato condotto e approvato presso il reparto di oftalmologia, Università medica centro Mainz.

Nota: Porcini occhi insieme al nervo ottico ed extraoculare tessuti sono stati ottenuti fresca da macello locale immediatamente post-mortem. Occhi enucleated sono stati trasportati al laboratorio in soluzione salina ghiacciata tampone fosfato (PBS) e utilizzati immediatamente. La presentazione schematica del flusso di lavoro impiegato è raffigurato nella Figura 1.

1. soluzioni

  1. Per preparare Krebs-Henseleit (K-H) buffer, pesare le seguenti sostanze chimiche (27,68 g di NaCl, 8,4 g di NaHCO3, 1,4 g di KCl, 1,18 g di MgSO4e 0,64 g di KH2PO4) in una provetta conica per centrifuga di 50ml pulito e asciutto e , 1,47 g di CaCl2 e 8,0 g di glucosio in un altro tubo.
    Nota: La miscela di polveri di queste sostanze chimiche deve essere conservata in un luogo fresco e asciutto. La miscela di polveri CaCl2 e glucosio è meglio preparata fresco per prevenire l'assorbimento di umidità e l'agglutinamento.
  2. Per preparare 200 µ l di 2A di tampone di estrazione per campione di pellet, mix 100 µ l di estrazione buffer 2 e 100 µ l di reagente A partire dall'estrazione di proteine transmembrana kit (Vedi B6 nella Tabella materiali).
    Nota: Aliquotare i componenti del kit di estrazione di proteine transmembrana composto da tampone di estrazione 2, reagente A e inibitore della proteasi cocktail in porzioni di lavoro e conservare a-20 ° C per uso prolungato. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Scongelare i reagenti a temperatura ambiente (TA) prima dell'inizio della procedura di estrazione pellet.
  3. Per preparare la soluzione di bicarbonato di ammonio (ABC, 100 mM), sciogliere 0,39 g di ABC in 50 mL di acqua deionizzata.
  4. Per preparare 10 mM 1, 4-ditiotreitolo (DTT) soluzione, sciogliere 30 mg di DTT in 20 mL di 100mm ABC.
  5. Per preparare 55mm soluzione Iodoacetamide (IAA), sciogliere 200 mg di IAA in 20 mL di 100mm ABC.
    Nota: IAA deve essere tenuto all'oscuro. Utilizzare un foglio di alluminio per avvolgere i tubi con soluzioni sensibili alla luce.
  6. Preparare il tampone di tripsina contenente 10 mM ABC e il 10% (vol / vol) acetonitrile (ACN). Aggiungere 1,5 mL di tampone di tripsina in un flaconcino di 20 µ g di tripsina per sciogliere il contenuto per preparare una soluzione di lavoro di tripsina 13 ng / µ l.
    Nota: Sequenziamento della tripsina grado per volta viene fornito liofilizzato e devono essere conservati a-20 ° C fino ad uso.
  7. Per preparare il tampone di estrazione del peptide, miscela 1:2 (v/v) di acido formico al 5% con ACN.
    Nota: Preparare tutte le soluzioni in passaggi 1.3-1.7 fresco appena prima dell'uso ed eliminare qualsiasi volume inutilizzato.
  8. Per preparare il 0,1% acido trifluoroacetico (TFA), mescolare 10 µ l di TFA con 10 mL di acqua deionizzata.

2. isolamento di brevi arterie Ciliary posteriori

Nota: L'occhio porcino è sostanzialmente diviso nell'anteriore (Figura 2A) e posteriore sezioni (Figura 2B).

  1. Posto il globo oculare in una camera di dissezione contenente ghiacciata K-H tampone. Accuratamente tagliato via muscolo circostante e tessuti con un paio di forbici affilate di Mayo.
  2. Fare un'incisione con un bisturi e tagliare il mondo lungo il piano equatoriale con un paio di forbici affilate Mayo fino a quando l'occhio è separato nella metà anteriore e posteriore. Rimuovere come molto vitreo come possibile dalla metà posteriore dell'occhio usando un paio di pinze modello standard.
    Nota: Separazione del globo dell'occhio in due metà facilita l'isolamento del sPCA con facilità senza avere un occhio commovente nel piatto di dissezione. Tuttavia, questo passaggio non è obbligatorio. I vasi possono anche essere isolati senza aprire il globo oculare.
  3. Utilizzare pin di dissezione per accuratamente pin giù alla metà posteriore dell'occhio con il lato di retina verso il basso e il nervo ottico rivolto verso l'alto verso lo sperimentatore.
  4. Delicatamente tagliare via il tessuto connettivo che circonda il nervo ottico per esporre il vasculature retrobulbar sottostante con un paio di forbici di primavera studente Allerød.
  5. La sPCA può essere visto come rami corti delle navi (tra rami di 5-8) che penetrano la sclera e circonferenzialmente circondano la testa del nervo ottico (Figura 2C). Isolare il paraoptic e distale sPCA insieme il tessuto connettivo circostante con un paio di pinzette di precisione 5 tipo e Allerød capsulotomy forbici (Figura 2D).
    Nota: Assicurarsi che il buffer di K-H rimane ghiacciato durante tutta la procedura di isolamento. Si consiglia vivamente di cambiare il tampone ogni 20-30 min, a seconda della temperatura ambiente.

3. preparazione del campione

  1. Rimuovere i tessuti connettivi da segmenti arteriosi utilizzando pinzette di precisione punta extra fine tipo 5 e forbici capsulotomy Allerød sotto un microscopio stereoscopico delicatamente e sciacquare le arterie isolate in PBS ghiacciata per rimuovere i contaminanti e residui di sangue.
    Nota: Se i campioni non sono sottoposti ai passaggi successivi immediatamente, snap-freeze li in azoto liquido e conservare a-80 ° C fino al successivo utilizzo.
  2. Piscina arterie da due occhi per ottenere una replica biologico, trasferirli in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e pesare i campioni utilizzando una bilancia analitica.
  3. In ogni provetta, aggiungere una miscela di 0,5 e 1,0 mm perline di ossido di zirconio, seguita da reagente di estrazione della proteina del tessuto (T-a; vedere B7 in Tabella materiali).
    Nota: Il volume di T-PER dipende il peso dei campioni in ogni tubo, con un rapporto di 1 mL di reagente a 50 mg di campione. Una regola generale del pollice da seguire durante il caricamento tubi per omogeneizzazione è un rapporto di volume di 1:1:2 = campione: perline: T-a (Figura 3A). Non utilizzare troppo grande un volume di tampone di estrazione e troppo poco una quantità di perline per prevenire omogeneizzazione inefficiente.
  4. Caricare le provette in un omogeneizzatore del frullatore (vedere D6 nella Tabella materiali). Impostare il timer a 2 min e velocità livello 6 e, iniziare omogeneizzazione. Dopo l'esecuzione, controllo i campioni per omogeneizzazione completa e ciclo di ripetizione fino a quando i campioni sono completamente omogeneizzati (Figura 3B).
    Nota: Un totale di 24 provette dei campioni può essere omogeneizzato in una sola volta. È importante mantenere i campioni freddo durante la procedura di omogeneizzazione per minimizzare denaturazione proteica. L'omogeneizzatore di frullatore proiettile utilizzato in questo studio ha una caratteristica inerente di raffreddamento che mantiene i campioni freddo. Nei casi in cui nessuna caratteristica di raffreddamento interna è disponibile nell'omogeneizzatore, campioni possono essere tenuti sul ghiaccio tra ogni esecuzione.
  5. Pipettare attentamente omogeneato in fresco per microcentrifuga. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 20 min a 4 ° C per appallottolare proteine insolubili e surnatante separato contenente proteine solubili. Pipettare attentamente fuori il supernatante in microcentrifuga fresco senza toccare lo strato di pellet (Figura 3C).
    Nota: Pellet e surnatante sono memorizzabili a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.

4. pellet digestione

  1. Aggiungere 200 µ l di 2A di tampone di estrazione e 5 µ l di inibitore della proteasi cocktail per ogni campione di pellet. Sospendere la pallina più volte con una pipetta.
    Nota: Mescolare i reagenti di estrazione bene prima di aggiungere al pellet. Mantenere 2A di tampone di estrazione su ghiaccio e l'inibitore di proteasi a RT durante tutta la procedura di estrazione.
  2. Utilizzare un omogeneizzatore ad ultrasuoni per omogeneizzare completamente il pellet.
    1. Impostare l'ampiezza a 60 e ciclo su 1. Utilizzare una sonda in titanio (Ø 0,5 mm, 80 mm di lunghezza), che è appropriato per l'omogeneizzazione di campioni con piccoli volumi (10-500 µ l).
    2. Immergere la sonda nella miscela tampone pellet ed estrazione e premere il pulsante start per esporre il campione di onde ultrasoniche.
    3. Sonicare il campione fino a quando i grumi di pellet sono completamente omogeneizzati. Mettere in pausa per alcuni secondi tra ogni sonicazione.
    4. Controllare visivamente per omogeneizzazione completa. Mescolare l'omogenato diverse volte con una pipetta per garantire che non vi siano senza grumi.
      Nota: La procedura di estrazione pellet dovrebbe essere effettuata sul ghiaccio per prevenire la denaturazione delle proteine a causa del calore generato durante l'omogeneizzazione (Figura 4).

5. campioni di pulizia e del cambio

  1. Utilizzare dispositivi centrifughi con 3 kDa cutoff (Vedi D3 nella Tabella materiali) per questa procedura secondo le istruzioni del produttore con modifiche ove applicabile. In primo luogo, inserire l'unità filtro in un tubo del microcentrifuge (fornito nella confezione filtro).
  2. Dispensare 200 µ l di campione omogeneizzato al dispositivo un filtro e aggiungere 200 µ l di acqua deionizzata nello stesso filtro. Dirla in modo sicuro (Figura 5A).
  3. Inserire l'unità filtro in una centrifuga e spin per 14.000 x g per 15 min a 4 ° C.
  4. Rimuovere il dispositivo dalla centrifuga e separare l'unità filtro contenente concentrato di campione dal tubo del microcentrifuge contenente il filtrato. Scartare il filtrato (Figura 5B).
  5. Ricostituire il concentrato con l'aggiunta di 400 µ l di acqua deionizzata nell'unità filtro. Ripetere i passaggi da 5.3 e 5.4 tre volte. Pipettare attentamente il concentrato 'puliti' campione in una provetta pulita.
    Nota: In genere, un 200 µ l di campione grezzo resa di ~ 50-70 µ l di concentrato dopo filtrazione.
  6. Ripetere i passaggi da 5.1-5.5 per i restante omogeneati del campione.

6. proteina misura

  1. Utilizzare l'analisi della proteina (BCA) acido bicinconinico kit (Vedi B5 nella Tabella materiali) per determinare le concentrazioni di proteina delle frazioni dei campioni sPCA surnatante e pellet su un lettore di piastra.
  2. Preparare le diluizioni (BSA) standard di albumina (intervallo di concentrazioni definitivo BSA tra 25 a 2.000 µ g/mL) da una fiala di 1 mL, composto da 2 mg/mL BSA, secondo le istruzioni del produttore.
  3. Pipettare 10 µ l di ciascuna diluizione standard di BSA e campione replica (surnatante e pellet) in ciascun pozzetto della micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto.
  4. Preparare la BCA reagente di lavoro aggiungendo 50 parti di BCA reagente A 1 parte di BCA reagente B.
    Nota: Calcolare il volume totale del reagente di lavoro richiesto per ogni misurazione prima della preparazione e preparare appena sufficiente volume dipenda dal numero di campioni e diluizioni standard deve essere analizzato.
  5. Attentamente una pipetta 200 µ l del reagente di lavoro in tutti i pozzetti BCA. Coprire la micropiastra ed incubare a 37 ° C per 30 min. Dopo il raffreddamento della piastra a RT, misurare l'assorbanza a 562 nm su un lettore di piastra (Vedi D13 nella Tabella materiali).
  6. In base alla curva standard generata per ogni concentrazione standard di BSA (µ g/mL), determinare le concentrazioni di proteine dei campioni.

7. unidimensionale Gel elettroforesi (1DE)

  1. Preparare i campioni per 1DE come mostrato in tabella 1 (per un campione). Mescolare la miscela campione bene con una pipetta. Riscaldare i campioni a 70 ° C per 15 min e cool a RT.
  2. Preparare 1 x Running Buffer aggiungendo 50 mL di tampone di esecuzione SDS MES a 950 mL di acqua deionizzata. Mescolare bene.
  3. Preparare prefabbricati 4-12% gel di proteina Bis-Tris (Vedi B4 nella tabella materiali).
    1. Tagliare la busta di plastica per rimuovere il vassoio del gel e risciacquare la cassetta con acqua deionizzata.
    2. Togliere il pettine fuori il vassoio del gel in un movimento fluido, avendo cura di non per danneggiare i pozzi.
    3. Lavare delicatamente i pozzetti di caricamento 2 - 3 volte con 1 x Running Buffer utilizzando una pipetta. Capovolgere e scuotere delicatamente il vassoio del gel per rimuovere il buffer, non assicurando che ci bolle d'aria nei pozzetti.
    4. Rimuovere il nastro bianco nella parte inferiore delle cassette gel.
  4. Inserire il gel (massimi due cassette) nel gel in esecuzione serbatoio e una volta completamente assemblato, bloccare il cuneo di tensionamento di gel.
  5. Riempimento del buffer superiore (catodo) camera con 200 mL di Buffer in esecuzione fino a che i pozzetti siano completamente coperti. Controllare eventuali perdite.
  6. Aggiungere 500 µ l di antiossidante (Vedi A14 nella Tabella materiali) nel buffer in esecuzione.
    Nota: L'antiossidante è un reagente di correttezza che deve essere utilizzato con campioni ridotti con agente riducente (Vedi tabella 1) per mantenere le condizioni riducenti durante l'elettroforesi ed evitare re-ossidazione degli aminoacidi sensibili come triptofano e metionina.
  7. Accuratamente caricare 50 µ g di campione per corsia utilizzando una pipetta. Quindi, caricare lo standard pre-macchiato della proteina come un marcatore di massa molecolare (Vedi A18 in Tabella materiali).
  8. Riempire la camera inferiore del buffer (anodo) con 600 mL di Buffer in esecuzione.
  9. Eseguire i gel per ~ 60 min a una tensione costante di 175 V. Alla fine della corsa, con attenzione rimuovere il gel dalla piastra cassetta usando un coltello di gel.
  10. Trasferire con cautela i gel in un gel colorazione casella.
    1. Preparare la soluzione di fissaggio fresco basata sul numero totale dei gel che hanno bisogno di essere macchiato, secondo le istruzioni del produttore come descritto nella tabella 2.
    2. Scuotere il gel(s) nella soluzione di fissaggio per 10 min a RT su una piattaforma a dondolo.
  11. Scartare la soluzione di fissaggio e macchia i gel con colloidale blu kit di colorazione.
    1. Preparare la colorazione fresca di soluzioni basata sul numero totale dei gel che hanno bisogno di essere macchiato, secondo le istruzioni del produttore come descritto nella tabella 3.
    2. In primo luogo, misurare il volume appropriato e miscelare direttamente i componenti contrassegnati con un asterisco (*) nel gel colorazione casella. Scuotere il gel(s) nella soluzione colorante senza Stainer B per 10 min a RT su una piattaforma a dondolo.
    3. Aggiungi B Stainer direttamente nella macchiatura casella contenente il * soluzione di colorazione. Assicurarsi di agitare bene prima dell'uso Stainer B.
      Attenzione: Eseguire i passaggi di preparazione 7.10.1 e 7.11.1 sotto cappa aspirante.
  12. Scuotere il gel(s) nella soluzione colorante durante la notte per migliori risultati complessivi.
    Nota: Le bande colorate diventerà visibile entro 10 min dopo l'aggiunta di Stainer B. colorazione richiede un minimo di 3 h e l'intensità non varia se lasciato per più ore in soluzione colorante.
  13. Con cautela decantare la soluzione colorante e sostituire con 200 mL di acqua deionizzata. Scuotere il gel(s) per almeno 7-8 h in acqua per cancellare lo sfondo.
    Nota: Acqua deionizzata deve essere cambiata parecchie volte durante la procedura di decolorante per meglio rimuovere macchie di eccessiva. Il gel(s) può anche essere lasciato in acqua per fino a 3 giorni senza compromettere l'intensità di banda di proteina. Se il gel(s) non è sottoposto alla procedura successiva immediatamente, possono essere memorizzato in soluzione di solfato di ammonio al 20% a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

8. in-gel digestione trittica

Nota: Questo protocollo è secondo il metodo di Shevchenko et al.17, con lievi modifiche. Questa procedura deve essere eseguita in un flusso laminare del cappuccio e utilizzare set dedicato di pipette, punte, tubi e bicchieri appositamente per questo scopo. Indossare guanti e abbigliamento laboratorio appropriato in ogni momento per evitare che la cheratina e altre contaminazioni. Preparare tutte le soluzioni e i reagenti utilizzati in questa procedura poco prima dell'uso.

  1. Asportare le bande di proteine dal gel con le lame del microtomo pulito, nuovo. Tagliare la banda in piccoli pezzi (circa 1 mm x 1 mm a 2 mm x 2 mm). Trasferire con cautela i pezzi di gel in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
    Nota: Pezzi che sono troppo piccoli potrebbero intasare i puntali per pipette e pezzi più grandi ridurrà recupero del peptide. Esercitare cautela quando si utilizza lame del microtomo, che sono estremamente taglienti.
  2. Decolorante
    1. Aggiungere 500 μL di soluzione decolorante contenente 100 mM ABC soluzione/ACN (1:1, v/v) e incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti con agitazione occasionale o tramite vortex.
    2. Pipettare attentamente la soluzione decolorante. Controllare visivamente per qualsiasi tubi con macchia residua. Ripetere il passaggio 8.2.1 se gel pezzi sono ancora macchiati blu.
  3. Riduzione e alchilazione
    1. Aggiungere ~ 400 µ l di soluzione preparata di DTT e incubare a 56 ° C per 30 min. Assicuratevi che la soluzione copre completamente i pezzi di gel. Attentamente dispensare la soluzione riducente e scartare.
    2. Aggiungere ~ 400 µ l di soluzione preparata di IAA e incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min. Rimuovi l'alchilanti buffer con una pipetta e scartare.
  4. Digestione
    1. Aggiungere 500 µ l di ACN ordinata presso RT per 10-15 min fino a quando i pezzi di gel di restringono e diventano opachi. Pipettare fuori ACN e asciugare all'aria pezzi gel per 5-10 min sotto il cofano.
    2. Pipettare 50 µ l di soluzione di tripsina in ogni tubo per coprire completamente i pezzi di gel. Incubare le provette a 4 ° C per 30 min.
    3. Dopo 30 min, controllare ogni tubo se tutta la soluzione di tripsina è stata assorbita dai pezzi gel. Aggiungere un volume sufficiente di tampone di tripsina (50-100 µ l, a seconda del volume nel tubo) per coprire completamente i pezzi di gel, se necessario. Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C.
  5. Estrazione del peptide
    1. Pipettare attentamente la soluzione peptide estratti dai tubi e il trasferimento a pulire microprovette. Asciugare il surnatante in un centrifugo evaporatore sottovuoto.
      Nota: Non gettare via i pezzi rimanenti di gel.
    2. Aggiungere 100 µ l di tampone di estrazione (fare riferimento al punto 1.7) a ciascun tubo e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione.
    3. Pipettare il supernatante nella stessa microprovette contenenti i peptidi estratti secondo le rispettive bande e asciugare giù in una centrifuga vuoto.
      Nota: Se non utilizzato immediatamente, possono essere memorizzati gli estratti secchi peptide a-20 ° C fino a parecchi mesi fino all'ulteriore utilizzo.

9. peptide purificazione

Nota: Questa procedura del peptide desalificazione e purificazione del campione è effettuata con l'uso di puntali per pipette18 C (Vedi C15 nella Tabella materiali). Utilizzare un nuovo puntale per ogni campione.

  1. Preparare il seguente fresco di soluzioni in provette coniche per centrifuga e aliquota in provette microcentrifuga da 2 mL per la procedura di purificazione di peptidi, come illustrato nella tabella 4. Una sintesi dei tubi per purificazione del peptide è come segue: tubo (una soluzione di campione), tubo B (soluzione bagnante), tubo C (Equilibration solution), tubo D (soluzione di lavaggio), tubo E (soluzione per eluizione), tubo F (un vuoto 2 mL o 5 mL microcentrifuga, a seconda il numero di campioni da pulire, per lo smaltimento dei rifiuti) e tubo G (una microprovetta pulita, vuota, capacità 0,2 mL).
  2. Ricostituire il peptide secchi estratti dal passaggio 8.6.3 con 10 µ l di 0,1% TFA. Questo tubo è designato tubo A.
  3. Sonicare tubi A in bagno ad ultrasuoni con ghiaccio per 5 min.
  4. Rotazione verso il basso la soluzione campione in una centrifuga da banco a 1.000 x g per 1 min.
  5. Impostare una micropipetta P10 per l'impostazione del volume massimo di 10 µ l e fissare saldamente un puntale di18 C.
  6. Immergere il puntale nella soluzione bagnante (metropolitana B) ed aspirare accuratamente il materiale di imballaggio. Lentamente dispensare lo spreco nel tubo F. Ripetere questo passaggio almeno 7 - 8 volte.
    Nota: Premere lo stantuffo pipetta a un punto morto e rilasciare lentamente o dispensare stantuffo durante tutta la procedura. Prendere precauzioni per non introdurre bolle d'aria le punte durante il pipettaggio per assicurare l'associazione massimo peptide alla colonna C18.
  7. Equilibrare la punta per il legame del peptide di aspirazione 10 µ l di soluzione equilibrazione in tubo C. scartare la soluzione e ripetere questa procedura 3-4 volte.
  8. Avanti, aspirare e dispensare soluzione campione nel tubo A diverse volte (a seconda dello spessore di banda gel corrispondente) per associare i peptidi di punta colonna.
    Attenzione: Di aspirazione e di erogazione passi durante la procedura di associazione (passaggio 9,8) vengono effettuati all'interno di tubo A. Non erogare la soluzione di esempio ai rifiuti.
  9. Lavare la punta della pipetta18 C, aspirare la soluzione di lavaggio in tubo D e successiva eliminazione dei rifiuti (tubo F) 4 o 5 volte.
  10. Infine, eluire i peptidi associati di pipettaggio la soluzione di eluizione (tubo E) e l'eluente di erogazione nel tubo G.
  11. Ripetere l'intera procedura 2 o 3 cicli al campione per aumentare il recupero del campione.
  12. Eliminare la punta dopo la purificazione di un campione e utilizzare una nuova punta del campione successivo.
  13. Asciugare gli eluati di peptide purificato in un concentratore a vuoto.
    Nota: I campioni purificati sono ora pronti per analisi LC-MS/MS nel sistema LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS. Conservare i campioni essiccati a-20 ° C fino all'utilizzo ulteriore.

10. liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-MS/MS analisi

Nota: Analisi proteomica quantitativa privo di etichetta viene eseguita su un sistema di cromatografia liquida-electrospray ionizzazione-lineare trappola ionica-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS. Il LC è composto di pompa quaternaria Rheos Allegro, dotato di un degasatore online (accoppiate ad un autocampionatore HTS PAL e il sistema è costituito da una pre-colonna 30 x 0,5 mm C18 connessa a una colonna di18 C 150 x 0,5 mm. Uso invertire fase acquosa solvente A costituito da acqua di grado di LC-MS con acido formico 0.1% (v/v) e organico solvente B composto da acetonitrile grado LC-MS con acido formico 0.1% (v/v). Utilizzare il gradiente con un tempo di esercizio di 60 min per gel di banda, come descritto in dettaglio nel nostro precedente studi6,16.

  1. Sciogliere i campioni di peptide purificato in 10 µ l di 0,1% TFA. Sonicare i campioni su ghiaccio per 5 min.
  2. Pipettare 10 campioni di µ l in una piastra di fondo V 96 pozzetti e sigillare con un film di copertura trasparente, autoadesivo.
  3. Trasferire la piastra per l'autocampionatore.
  4. Utilizzare il seguente gradiente per ogni tempo di esercizio di 60 min: 0-35 min (15-40% solvente B), 35-40 min (40-60% solvente B), 40-45 min (60-90% solvente B), 45-50 min (90% solvente B), 50-53 min (90-10% solvente B) e 53-60 min (10% solvente B).
  5. Utilizzare le seguenti condizioni di spettrometrihe di massa dello strumento: modalità di ionizzazione electrospray di ioni positivi, spruzzo tensione (2.15 kV), capillare temperatura (220 ° C), modalità di acquisizione dati-dipendente, l'acquisizione automatica di commutazione tra Orbitrap-MS e LTQ MS/MS, risoluzione orbitrap (30.000), gamma di m/z (300 a 1.600), destinazione automatico controllo guadagno (AGC, 1.0 x 106 ioni), ricalibrazione interna (polydimethlycyclosiloxane [PCM] a in tempo reale gli 445.120025 ioni m/z), bloccare la massa opzione attivata in modalità MS, dati di tandem ottenuti selezionando l'ioni precursori più intensi primi cinque, ulteriore energia di collisione di frammentazione di dissociazione indotta da collisione (CID), normalizzato (NCE, 35% con tempo di attivazione di 30 ms con numero di ripetizioni di 3) e la durata di esclusione dinamico (600 s).
    Nota: Gli ioni frammentati risultanti vengono registrati nel LTQ.
  6. Eseguire biologici almeno tre repliche per ogni campione.

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Risultati

Disponibilità limitata del campione è uno degli inconvenienti principali nella ricerca oftalmica. Corrispondentemente, metodi di estrazione per la proteina ottima restituiscono da piccole quantità di campioni come vasi sanguigni oculari sono spesso discutibili. Ad oggi, ci è una scarsità dei metodi adatta particolarmente per estrazione della proteina dai vasi sanguigni retrobulbar. Pertanto, come primo passo nell'ottimizzazione del metodo e come un prova-de-principio di confrontare l'effi...

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Discussione

Profilatura di proteoma completo di una gamma diversificata di campioni oculare è un primo passo importante e indispensabile per delucidare i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nella salute e nella malattia. Al fine di ottenere dati di alta qualità e per garantire la riproducibilità dei risultati ottenuti da queste analisi, la precedente procedura di preparazione del campione è cruciale, come evidenziato in una recensione da Mandal et che discusso approfondite le procedure di elaborazione del campio...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Dr. Manicam è supportato da interno università ricerca finanziamenti (Stufe 1) dal centro universitario medico dell'Università Johannes Gutenberg di Magonza e una sovvenzione dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A. Sostanze chimiche
1, 4-Ditiotreitolo (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2)   Carl Roth5239,12,5 mM 
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) Thermo Fisher Scientific14190169
Acido formico (CH2O2)AppliChemA0748
Acetonitrile di grado HPLC (ACN, C2H3N)AppliChemA1605
Metanolo di grado HPLC (CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
Acqua di grado HPLC AppliChemA1589
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125
Cloruro di calio (KCl)   Carl Roth6781,14,7 mM 
Diidrogeno fosfato di calio (KH2PO4)  Carl Roth3904,21,2 mM 
Acido acetico di grado LC-MS  Carl RothAE69.1
Solfato di magnesio (MgSO4)     Carl Roth261,21,2 mM 
NuPAGE AntiossidanteThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Tampone per campioni Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Buffer di corsa Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Agente riducente del campione Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 proteina pre-colorata standard Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Tripsina modificata di grado di sequenziamentoPromegaV5111
Cloruro di sodio (NaCl)  Carl Roth9265,2118,3 mM 
Carbonato acido di sodio (NaHCO3)  Carl Roth965,325 mM 
Acido trifluoroacetico (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
&alfa;-(D)-(+)- Glucosio monoidrato  Carl Roth6780,111 mM 
B. Reagenti e kit
0,5 mm perle di ossido di zirconio Successivo AdvanceZROB05
Perline di ossido di zirconio da 1,0 mm Successivo ColorazioneAdvance ZROB10
  KitThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025Per colorare 25 mini gel per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gelThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1,0 mm, 10 pozzetti
Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinchoninico (BCA) PierceThermo Fisher Scientific23227
Kit per l'estrazione di proteine transmembrana ProteoExtract, TM-PEKMerck Millipore71772-320 reazioni per kit
Reagente per l'estrazione di proteine tissutali (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Strumenti
96 pozzetti Piastre con fondo a VGreiner Bio-One651180
Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti CorningSigma-AldrichCLS3595-50EA
Lame per microtomo monousopfm Medical207500014
Bisturi monouso #21pfm Medical200130021
Perni di dissezione Carl RothPK47.1
Forbici Bonn extra fini  Fine Science Tools14084-08
Provette da centrifuga coniche Falcon (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Forbici per maionese, taglio resistente  Fine Science Tools14130-17
Pinzette di precisione  Fine Science Tools11251-10Tipo 5
Pinzette di precisione, diritte con punte extra finiCarl RothLH53.1Tipo 5
Pellicole sigillanti autoadesive per micropiastreRatiolab (vWR)RATI6018412
Pinza modello standard  Fine Science Tools11000-12
Forbici a molla Vannas per studenti  Fine Science Tools91501-09
Forbici per capsulotomia Vannas   Geuder19760  Puntali per pipette ZipTip da 77 mm
C18Merck MilliporeZTC18S096
D. Attrezzature e dispositivi
150 & Colonna BioBasic C18 da 0,5 mmThermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 &volte; Pre-colonna BioBasic C18 da 0,5 mm Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Dispositivi di filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5 3K Merck MilliporeUFC500396Confezione da 96.
Bilancia analiticaAutocampionatore SartoriusH51
CTC Analytics AG, Zwingen, SvizzeraHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Concentratore Eppendorf, modello 5301Sigma-AldrichZ368172
Microcentrifuga Eppendorf, modello 5424Fisher Scientific05-403-93Centrifuga
Heraeus Primo RThermo Scientific75005440
Omogeneizzatore ad ultrasuoni refrigerato Labsonic M Pompa SartoriusBBI-8535027
LC-MS, modello Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, USA22080
Spettrometro di massa LTQ Orbitrap XL.Thermo Scientific, Brema, Germania
Lettore di piastre Multiskan Ascent Rotatore Thermo Labsystemsv2.6
con vorticeneoLab7-0045
Sonda in titanio (Ø 0,5 mm, 80 mm di lunghezza)SartoriusBBI-8535612
Bagno a ultrasuoni, tipo RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001
blu colloidale non refrigerata

Riferimenti

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  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

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