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Articolo metodologico

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

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DOI:

10.3791/59143

⸱

7 febbraio 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.

Abstract

Circolante e interstiziale piccole membrana-limita (SVE) vescicole di extracellulare rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di saggi di nuovo biomarcatore diagnostico o prognostico e probabilmente servono come giocatori importanti nella progressione di un vasto spettro di malattie. Ricerca corrente è focalizzata sulla caratterizzazione delle vescicole secernuta da cellule multiple e tipi di tessuto al fine di meglio comprendere il ruolo di EVs nella patogenesi di condizioni tra cui neurodegenerazione, infiammazione e cancro. Tuttavia, globalmente coerenti e riproducibili tecniche per isolare e purificare le vescicole rimangono in corso. Inoltre, a malapena vengono descritti metodi per l'estrazione del SVE da tessuto solido ex vivo . Qui, forniamo un protocollo dettagliato per estrarre piccoli EVs di interesse dai tessuti intero freschi o congelati, compreso i campioni del cervello e del tumore, per ulteriore caratterizzazione. Dimostriamo l'adattabilità di questo metodo per analisi multiple a valle, tra cui la microscopia elettronica e immunophenotypic caratterizzazione delle vescicole, così come la spettrometria di massa quantitativa delle proteine di EV.

Introduzione

Piccole vescicole extracellulari (SVE) includono endosomal-derivato esosomi e microvescicole membrana-capannone piccolo di ampio interesse biomedico. Piccoli SVE sono composti da una popolazione eterogenea di vescicole di membrana-limitano nm 50-250 contenenti proteine biologicamente attive, i lipidi e gli acidi nucleici che collettivamente sono creduti per svolgere ruoli importanti in una moltitudine di processi di malattia. Progresso della ricerca è particolarmente implicata queste vescicole in neurodegenerative e malattie da prioni, processi infettivi, condizioni infiammatorie o autoimmuni e la crescita del tumore e metastasi1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ricerca biomedica in rapida crescita del significato di EVs nella patogenesi della malattia ha generato interesse parallela allo sviluppo di metodi riproducibili e rigorosi per l'isolamento e la purificazione di queste vescicole.

Una sfida storica e attuale nella caratterizzazione di EV è stata l'incapacità di separare completamente piccola EV sottopopolazioni. Questa sfida è in gran parte a causa della nostra comprensione limitata dei differenti meccanismi molecolari che regolano la biogenesi delle vescicole distinte. Sovrapposizione di dimensioni, densità e carico biologico tra sottopopolazioni ulteriormente spire queste distinzioni. Parte di questa sfida è stato anche l'uso di diverse tecniche di arricchimento, fornendo un'incoerenza in analisi a valle delle vescicole isolate attraverso laboratori e minare lo sforzo globale per illuminare categorico EV popolazioni ampiamente.

Vale la pena notare che la maggior parte della caratterizzazione EV è stata eseguita da collezione in vitro della coltura delle cellule surnatante, con studi in vivo più recenti che descrivono le tecniche per isolare le vescicole da fluidi corpo umani o animale, tra cui plasma, urina e la saliva. Mentre SVE sono presenti in grandi quantità in circolazione, ha anche riconosciuto che queste vescicole svolgono un ruolo importante negli eventi di comunicazione cellula-cellula e sono presenti nell'interstizio dei tessuti cellulari. Nel contesto di cancro, EVs interstiziale può essere particolarmente importante nella modulazione del microambiente tumorale per la semina delle cellule di cancro e crescita metastatica14,15. Di conseguenza, non c'è valore nello sviluppo e nell'ottimizzazione delle tecniche per estrarre le vescicole da campioni di tessuto solido. Questi metodi fornirà un mezzo per studiare direttamente organo - o tumore - derivato EVs raccolti da campioni clinici, tra cui piccole biopsie e resezioni organo parziale o completo.

In questo studio e in un precedente rapporto pubblicato dal nostro laboratorio16, intendiamo affrontare parecchie preoccupazioni attuali principali nella metodologia di arricchimento EV: 1) per descrivere una tecnica riproducibile per isolare e purificare EVs ai più alti standard attualmente accettato nel campo; 2) per tentare di isolare piccole sottopopolazioni EV altamente arricchite in endosomal-derivato esosomi; e 3) per fornire un protocollo per l'estrazione di queste vescicole da campioni di tessuto solido ai fini di ulteriore caratterizzazione.

Recentemente, Kowal e colleghi descritti una pendenza di densità relativamente piccoli iodixanol per separare e purificare le sottopopolazioni di EV con maggiore efficacia rispetto paragonabile saccarosio densità gradienti17. Nello studio citato, EVs di derivati da cellule dendritiche catturato in una frazione di densità relativamente leggera, coerenza con una densità di 1,1 g/mL, altamente sono stati arricchiti in proteine endosomal credute di essere più coerente con una proporzione elevata degli esosomi presenti in questo frazione. Secondo gli autori, queste proteine "bona fide" exosomal includevano gene di suscettibilità del tumore 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e diversi annessina proteine17. Più tardi abbiamo adattato questa tecnica per avere successo un metodo di dissociazione del tessuto descritto da Gonzalez Perez et al.18 e un protocollo di successiva centrifugazione differenziale per isolare l'intero cervello-derivato SVE16. Inoltre, abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo nella caratterizzazione dei proteomi EV combinando un protocollo sequenza per la spettrometria di massa a valle quantitativo e comparativo della proteina vescicolare, precedentemente descritta dal nostro laboratorio19. Questo lavoro era equivalente a quello del laboratorio di Hill, in cui SVE sono state arricchite dalla corteccia frontale del cervello20.

In questo studio, abbiamo elaborato su questa tecnica ed estendere l'applicazione del protocollo recentemente pubblicato dal nostro laboratorio all'isolamento del SVE da tumori solidi del polmone. A nostra conoscenza, questo è il primo studio per descrivere un protocollo per arricchire SVE da ex vivo esemplari del tumore. Visto il diffuso interesse verso EVs come nuovi biomarcatori diagnostici e il loro ruolo nella tumorigenesi, questo metodo probabilmente si rivelerà prezioso per un numero crescente di ricercatori scientifici. Da un punto di vista clinico, EVs interstiziale potrebbe porto grande valore diagnostico, in particolare negli esemplari dove la valutazione istologica è limitata. La nostra speranza è che il metodo descritto qui fornirà un fondamento per una tecnica riproducibile raccogliere EVs in freschi o surgelati umani o animali esemplari chirurgici, spianando la strada per il lavoro futuro scoprire i ruoli significativi nella patogenesi della malattia questi piccoli le vescicole possono giocare.

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Protocollo

Tutto cervelli sono stati ottenuti con approvazione dall'uso animale istituzionale e cura Committee (IACUC) della Florida State University. Un totale di dodici cervelli di topo (3 cervelli da ogni gruppo d'età: 2, 4, 6 e 8 mesi) da un C57BL/6 J sfondo sono stati utilizzati per l'estrazione di EV, come descritto in precedenza16. Esemplari del tumore del polmone sono stati generosamente donati da Dr. Mandip Sachdeva sotto approvazione del Florida agricola e meccanica Università IACUC. Tumori del polmone sono stati derivati dalla linea cellulare umana dell'adenocarcinoma H1975 coltivato in immunodeficienti topi nudi di Balb/c nu/nu. Dati da due repliche rappresentativo del tumore sono evidenziati in questo studio.

Nota: Una descrizione schematica del metodo di isolamento e purificazione di vescicola è fornita nella Figura 1.

1. tessuto dissociazione e centrifugazione differenziale

  1. Preparare 10 mL di tampone di dissociazione (10 mg di papaina; 5,5 mM L-cisteina; 67 µM 2-mercaptoetanolo; 1,1 mM EDTA) nel mezzo di sospensione-E a circa 0,4-1,0 g di tessuto. Si noti che tutte le soluzioni utilizzate per la purificazione e l'arricchimento di EV devono essere diluite in acqua ultrapura filtrata.
  2. Aggiungere tessuto intero fresco o congelato a buffer di dissociazione in una provetta conica da 50 mL e incubare in un acqua calda vasca a 37 ° C per 20 min. del tessuto può essere tagliato in frammenti più piccoli prima dell'incubazione, se necessario.
  3. Dopo l'incubazione, aggiungere inibitori di proteasi e fosfatasi per una concentrazione finale di 1 x per il buffer di dissociazione che contiene il tessuto.
  4. Versare la soluzione contenente il tessuto in un omogeneizzatore lisata-morbida e delicatamente dissociare il tessuto utilizzando circa 30 colpi lenti per campione. Il numero di tratti può essere regolato in base alla consistenza del tessuto.
  5. Tessuto di trasferimento dissociato nel buffer di una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule e i rimanenti frammenti di tessuto fibroso o coesivi.
  6. Trasferire il surnatante di un tubo conico pulito da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g per 10 min a 4 ° C di pellet e scartare grandi detriti cellulari.
  7. Trasferire il surnatante nuovamente un tubo conico pulito da 50 mL e centrifugare a 10.000 x g per 40 min a 4 ° C a pellet indesiderate più grandi vescicole o corpi apoptotici piccolo.
    Nota: Questo pellet possono essere salvate per ulteriore studio delle vescicole più grande se lo si desidera.
  8. Decantare il supernatante attraverso un filtro a 0,45 µm in una provetta di ultracentrifugazione di mL 12 pulita.
    Nota: Campioni di tessuto densamente fibrotico non possono essere facilmente filtrati. Questi campioni possono essere filtrati attraverso un colino di cella 40 µm, quindi passavano in serie più piccoli aghi (18 G, 20 G, 22 G) prima di filtraggio attraverso il filtro da 0,45 µm.
  9. Ultracentrifuga il campione a 100.000 x g per 2 h a 4 ° C a pellet piccola EVs.
  10. Decantare il supernatante e lasciare i tubi di ultracentrifugazione invertiti per 5-10 min, toccando spesso per rimuovere il liquido residuo sui lati dei tubi. Liquido residuo può anche essere aspirato per mezzo di una pipetta sottovuoto ad aspirazione.
  11. Risospendere il pellet di EV in 1,5 mL di tampone di 0,25 M saccarosio (10 mM Tris, pH 7.4). È importante garantire completa risospensione del pellet in questo passaggio. A tale scopo, coprire le provette con parafilm prima Vortex EVs in soluzione. I tubi di ultracentrifuga per 15-20 minuti a temperatura ambiente prima di un mix di vortice finale della roccia.
  12. Centrifugare brevemente le provette a una velocità non superiore a 1.000 x g per recuperare la sospensione liquida nella parte inferiore del tubo.
  13. Procedere con i passaggi di purificazione gradiente qui sotto, o se necessario, conservare EV sospensione a 4 ° C durante la notte.

2. densità gradiente purificazione

  1. Aggiungere 1,5 mL di iodixanol 60% (soluzione in acqua) nel buffer di saccarosio/Tris di 1,5 mL contenente EVs per creare una soluzione finale che contiene 30% iodixanol. Pipettare fino e giù più volte per mescolare la soluzione. Essere cauti per evitare di perdere la soluzione nella punta della pipetta, come la concentrazione di iodixanol alta è abbastanza viscosa.
  2. Trasferire la soluzione tampone di iodixanol 30% contenente EVs il fondo di una provetta di ultracentrifugazione 5,5 mL.
  3. Preparare almeno 1,5 mL di 20% e 10% soluzioni di iodixanol per campione in acqua ultrapura dalla soluzione madre di iodixanol di 60%.
  4. Misura 1,3 mL di iodixanol di 20% e con attenzione il livello sopra il livello di sfumatura di fondo utilizzando una siringa e un ago da 18 G. Per evitare gli strati all'interfaccia densità di miscelazione, la smussatura dell'ago a contatto con l'interno del tubo ultracentrifugazione appena sopra il menisco e aggiungere goccia a goccia la soluzione.
  5. Strato di 1,2 mL di soluzione di 10% iodixanol sopra lo strato di iodixanol 20% usando la stessa tecnica come sopra.
  6. Attentamente equilibrio e caricare i tubi ultracentrifugazione in bucket di rotore e della centrifuga in un rotore di swing-benna a 268.000 x g per 50 min a 4 ° C. Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga i tassi minimi ammessi per evitare perturbazioni degli strati di densità.
  7. Etichetta dieci provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni campione corrispondono a frazioni di 1 a 10 del gradiente di densità. Frazione 1 viene designato come la frazione più in alto che verrà prima rimosso, mentre la frazione 10 è la frazione di fondo Ultima rimossa.
  8. Una volta completata l'ultracentrifugazione di pendenza, delicatamente togliere le provette dal rotore secchi e posto in un supporto stabile. Una banda visibile delle vescicole spesso sarà visibili nella frazione di interesse. Pipettare seriale dieci frazioni di 490 µ l dalla parte superiore della sfumatura nelle provette corrispondenti. Ci sarà una piccola quantità di liquido restante nella parte inferiore del tubo che probabilmente contiene proteine contaminanti. Questo esempio può essere scartato, o mantenuto come frazione 11 Se si desidera.
  9. Misurare gli indici di rifrazione delle frazioni utilizzando un rifrattometro. Ciò può anche essere eseguito con una sfumatura di controllo eseguita in parallelo, se è necessaria la conservazione del campione. Pipettare 20-30 µ l di ciascuna frazione contenente iodixanol sulla superficie del rifrattometro e stimare la densità confrontando gli indici di rifrazione di iodixanol noto densità. Si noti che le frazioni possono essere memorizzate durante la notte nella soluzione contenente iodixanol se necessario prima di procedere al passaggio successivo per la lavaggio ultracentrifugazione.
  10. Trasferire ogni frazione in una provetta di ultracentrifugazione mL 12 pulita. Aggiungere 5 mL di tampone fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 2mm KH2PO4, pH 7.4): 1x tubo e mescolare pipettando lentamente su e giù.
    Nota: PBS aggiunto ai campioni deve essere priva di particelle, assicurata da PBS sterile che filtra attraverso un filtro da 0,22 µm e la conservazione a temperatura ambiente per evitare la precipitazione del sale.
  11. Aggiungere un ulteriore 6 mL di 1X PBS all'inizio e ancora una volta mescolate con cura.
  12. Ultracentrifuga i tubi a 100.000 x g per 2 h a 4 ° C a ri-pellet piccole vescicole. Decantare il supernatante e toccare i tubi asciutte prima di lisi delle vescicole per l'analisi della proteina (passaggio 3) o risospensione di EVs per analisi morfologica (passo 5).

3. Lisi e Immunoblot conferma delle proteine di EV

Nota: Se la conservazione delle vescicole tutta per la caratterizzazione morfologica o attività biologica è voluta, i ricercatori possono procedere direttamente al passo 5. Negli esperimenti iniziali, o prima dell'analisi di spettrometria di massa, dovrebbero essere analizzate tutte le frazioni recuperate da immunoblot per confermare le frazioni con proteine di EV.

  1. Per lisare EVs per l'analisi della proteina, aggiungere 40 µ l di tampone di lisi forte (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-mercaptoetanolo, urea 8 M) con l'aggiunta dell'inibitore di proteasi a pellet EV in tubo ultracentrifuga.
    Nota: Se le condizioni non riducenti sono desiderate per il rilevamento di anticorpi delle proteine, sostituire acqua ultrapura per 2-mercaptoetanolo nel buffer di lisi forte.
  2. Garantire la completa risospensione del pellet e lisi del SVE nel buffer mettendo parafilm sopra l'ultracentrifugazione tubo Vortex vigorosamente, poi a dondolo per 20 min a temperatura ambiente prima di un vortice finale.
  3. Centrifugare brevemente a 1.000 x g per 30-60 s recuperare il volume del campione intero. Trasferire il campione di un nuovo microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione.
  4. Per preparare lisati purificato per l'analisi di immunoblot, aggiungere 5 x Laemmli tampone (10% SDS, 250 mM Tris-HCl pH 6.8, 1 mg/mL di bromofenolo, 0,5 M DTT, glicerolo al 50%, 5% 2-mercaptoetanolo) ai campioni per una concentrazione finale di 1 x.
    Nota: Se le condizioni non riducenti sono desiderate, è possibile sostituire il DTT e 2-mercaptoetanolo con acqua ultrapura.
  5. Se intero tessuto omogeneato controlli sono desiderati, lisare il tessuto nell'urea-che contiene forte buffer di lisi dettagliata sopra con l'inibitore della proteasi, poi Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a scartare i rimanenti della matrice extracellulare, le cellule intere, o detriti cellulari intatti. Aggiungere 5 x Laemmli tampone omogeneato del tessuto per una concentrazione finale di 1 x.
  6. Far bollire la sample buffer contenente campioni di omogenato EV o tessuto a 95 ° C per 5-10 minuti, quindi uguale volume di carico (dall'equivalente di 0,1-0,3 g di tessuto materiale di partenza; 1-2 µ g di proteina purificata EV) delle frazioni 1-10 in un gel di SDS-PAGE 10%. Carico uguale massa dell'omogeneato del tessuto. Maggiore volume dei campioni può essere necessaria per il rilevamento di anticorpi meno sensibili.
  7. Procedere con elettroforesi e Western blot analisi come precedentemente dettagliate21 per confermare proteine di EV nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di EV in frazioni.
    Nota: Una volta EV proteina è stata dimostrata in modo riproducibile in frazioni coerente, il lavaggio finale ultracentrifugazione descritto nel passo 2.12 può essere limitato a gradiente frazioni di interesse.

4. quantificazione della proteina EV

  1. Utilizzare un'analisi di fluorescenza-basata di detersivo e urea compatibili se sensibili quantificazione delle proteine di EV è desiderato per ulteriori analisi (Vedi Tabella materiali). Si noti che alcune analisi di fluorescenza-based sono compatibili con il blu di bromofenolo presente nel buffer del campione di Laemmli, facilitando lisi diretta del pellet EV (a passo 2.12) in questo buffer, se si preferisce.
  2. Se viene utilizzato il kit di quantificazione della suddetta proteina basata a fluorescenza, spot 1 µ l di campione o standard in almeno duplicare della carta da filtro fornita e continuare quantificazione di proteine secondo le istruzioni del produttore.

5. caratterizzazione della morfologia di EV

  1. Per esaminare tutta vescicole dopo la centrifugazione finale lavare in passo 2.12, accuratamente risospendere EV pellet in PBS 1X priva di particelle. Archivio EVs a 4 ° C per non più di una settimana fino al procedimento per evitare cicli di gelo-disgelo.
    Nota: È utile in precedenza hanno confermato le frazioni contenenti costantemente arricchito EV proteina dall'analisi del immunoblot per limitare l'analisi morfologiche alle frazioni di interesse.
  2. Eseguire nanoparticella analisi di rilevamento su intero EV campioni per determinare la concentrazione e le dimensioni delle vescicole nelle preparazioni, come precedentemente dettagliate22.
  3. Caratterizzare la morfologia EV e confermare le misure da microscopia elettronica delle vescicole, se lo si desidera. Griglie di EM possono essere preparati da sospensioni di vescicola seguendo passo 5.123, o in alternativa possono essere elaborate come blocco preparati24 da pellet seguendo passo 2.12.

6.-gel di purificazione e digestione della tripsina per analisi di spettrometria di massa

  1. Se si desidera la caratterizzazione dei proteomi EV mediante spettrometria di massa, carico uguale massa (almeno 10 µ g di proteina) di frazioni contenenti SVE in un prefabbricato gel di poliacrilammide per separare e purificare proteine. Gel pre-cast forniti dal produttore sono preferiti per ridurre i livelli di potenziale contaminazione proteine (ad es., cheratina) introdotti nei campioni.
  2. Eseguire l'esempio almeno 0,5 pollici in gel di poliacrilammide per purificazione della proteina, quindi difficoltà e macchia con colorante Coomassie, come precedentemente descritto in dettaglio25.
  3. Tagliare le corsie a 1 mm3 cubi per la digestione della tripsina, come in precedenza dettagliate19,26.
  4. Caricare 5 µ l di campione digerito peptide in LC-MS/MS strumento per separazione sulla colonna analitica e successiva analisi mediante spettrometria di massa secondo i parametri specificati in dettaglio16.

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Risultati

Nella Figura 1viene visualizzata una descrizione schematica della dissociazione del tessuto, centrifugazione differenziale e gradienti purificazione delle vescicole. Conferma della morfologica e immunophenotypic del gradiente-purificato sve è evidenziata nella Figura 2. Un diagramma di densità riproducibile dopo ultracentrifugazione di pendenza di iodixanol il 10-30% viene mostrato, con due popolazioni distinte della vescicola la...

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Discussione

Interesse molto scientifico è stato generato per quanto riguarda i ruoli che piccoli EVs giocare nel microambiente tumorale, come pure in funzione, la maturazione e lo sviluppo dell'organo. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'estrazione del SVE intatti da intero cervello o esemplari del tumore. Mentre qui abbiamo semplicemente dimostrare l'applicabilità di questa tecnica per EVs derivate da tumore del polmone, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per lavoro su altri te...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Richard Nowakowski e la Florida State University laboratorio animale risorse per fornire e la cura per gli animali utilizzati per sviluppare questo protocollo, rispettosamente. Ringraziamo Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e il Florida State University traslazionale Science Laboratory per assistenza con il lavoro di spettrometria di massa utilizzato per la caratterizzazione della vescicola a valle, come pure del fondo per la FSU biologico Scienza Imaging Resource l'utilizzo del microscopio elettronico trasmissione in questo studio. Infine, ringraziamo il dottor Mandip Sachdeva (Florida A & M University) per la donazione degli esemplari del tumore utilizzato nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca di la Florida reparto di salute Ed ed Ethel Moore Alzheimer malattia assegnato a d. G.M. e J.M.O (6AZ11) e il National Cancer Institute, del National Institutes of Health, premio numero R01CA204621 assegnato a d. G.M.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 & micro; m filterVWR28145-505
Provette per ultracentrifuga da 12 mLBeckman Coulter331372
provette per ultracentrifuga da 5,5 mLBeckman Coulter344057
anticorpo anti-AlixSanta Cruzsc-7129
anticorpo anti-CalnexinaSanta Cruzsc-11397
anticorpo anti-CD63Abcamab59479
anticorpo anti-CD81Santa Cruzsc-9158
anticorpo anti-Flotillin 2 SantaCruzsc-25507
anticorpo HSC70Santa Cruzsc-7298
anticorpo anti-Syntenin-1Santa Cruzsc-100336
anticorpo anti-TSG101 SantaCruzsc-7964
EZQ kit di quantificazione di proteineThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 rotore Eppendorf5820715006
FEI CM120 Microscopio elettronicoTSS
Microscopio capra anti-coniglio IgG (frammento Fab)Genetex27171
Inibitore della fosfatasi HALT (soluzione 100x)ThermoFisher Scientific78420
Inibitore della proteasi HALT (soluzione 100x)ThermoFisher Scientific78438
Ibernazione E mediaThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 rotore a secchiello oscillanteBeckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Ultracentrifuga da bancoBeckman Coulter393315
Optima XE-100 ultracentrifugaBeckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% di iodixanolo in soluzione di acqua sterile
Q Spettrometro di massa HF esattivoThermoFisher Scientific
coniglio anti-capraIgG Genetex26741
coniglio anti-topo IgGGenetex26728
Refracto 30PX (rifrattometro)Mettler Toledo51324650
S-4-104 rotoreEppendorf5820759003
SW 41 Ti a secchio oscillante RotoreBeckman Coulter333790
Centrifuga da tavolo 5804REppendorf22623508

Riferimenti

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