Articolo metodologico

Secondo i saggi foglia distaccati per semplificare gli studi sull'espressione genica nelle patate durante l'infestazione da mawing Insect Manduca sexta

DOI:

10.3791/59153

⸱

15 maggio 2019

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo presentato crea tessuto vegetale naturale danneggiato erbivoro attraverso l'applicazione di larve di sexta Manduca a foglie staccate di patate. Il tessuto vegetale è stato analisi per l'espressione di sei omologhi del fattore di trascrizione coinvolti nelle prime risposte all'erbivoro degli insetti.

Abstract

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La natura multitrofica degli studi sull'espressione genica degli insetti erbivori richiede un gran numero di repliche biologiche, creando la necessità di protocolli erbivori più semplici e più snelli. Le perturbazioni degli insetti masticatori sono di solito studiate in sistemi vegetali interi. Mentre questa strategia dell'intero organismo è popolare, non è necessario se osservazioni simili possono essere replicate in un'unica foglia staccata. L'ipotesi è che gli elementi di base necessari per la trasduzione del segnale siano presenti all'interno della foglia stessa. Nel caso di eventi iniziali nella trasduzione del segnale, le cellule devono solo ricevere il segnale dalla perturbazione e trasmettere quel segnale alle cellule vicine che vengono analizzate per l'espressione genica.

Il metodo proposto modifica semplicemente la tempistica del distacco. Negli esperimenti su piante intere, le larve sono confinate in una singola foglia che alla fine viene staccata dalla pianta e analizzata per l'espressione genica. Se l'ordine di escissione è invertito, dall'ultimo negli studi di piante intere, al primo nello studio distaccato, l'esperimento di alimentazione è semplificato.

Kennebec, Var, Varnebec di Solanum viene propagato dal trasferimento nodale in un semplice mezzo di coltura dei tessuti e trasferito al suolo per un'ulteriore crescita, se lo si desidera. Le foglie vengono ascise dalla pianta madre e trasferite ai piatti Petri dove il saggio di alimentazione viene condotto con gli stadi larvali di M. sexta. Il tessuto fogliare danneggiato viene analizzato per l'espressione di eventi relativamente precoce nella trasduzione del segnale. L'analisi dell'espressione genica ha identificato i fattori di trascrizione Cys2-His2-His2 (C2H2) specifici per l'infestazione, confermando il successo dell'uso di foglie distaccate negli studi di risposta precoce. Il metodo è più facile da eseguire rispetto alle infestazioni di piante intere e utilizza meno spazio.

Introduzione

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Herbivory mette in moto una serie di eventi molecolari durante i quali una pianta può sia identificare l'attacco che montare una risposta appropriata per la sua sopravvivenza. Una pianta riceve due segnali di base da insetti masticatori; uno dal danno fisico al tessuto e l'altro da sostanze specifiche per insetti. I modelli molecolari associati ai danni (DAMP) vengono rilasciati in risposta ai danni creati dalle parti della bocca larvale e innescano una risposta ben definita della ferita che si traduce in un aumento dell'acido jasmonico ormonale e nella trascrizione dei geni di difesa1. Uno dei DAMP più conosciuti è systemin, un polipeptide che è formato dalla scissione della proteina prosystemin più grande dopo una foglia viene ferita2,3. La risposta della ferita da acido jasmonico è ulteriormente modulata da modelli molecolari associati agli erbivori (HAMP), che possono essere derivati dalla saliva del bruco, dal contenuto intestinale (rigurgitante) e dalle feci (frass)4. Gli insetti usano queste sostanze per aumentare o eludere la risposta alla difesa5. I fattori di trascrizione trasmettono quindi il messaggio dai segnali ormonali nella risposta della difesa attraverso la regolazione dei geni di difesa a valle6,7,8.

Alcuni studi di interazione pianta-insetto utilizzati in ambienti di laboratorio sono di tipo simulato, con l'obiettivo di approssimare il metodo naturale di alimentazione da parte dell'insetto. L'erbivoro simulato è di solito realizzato creando danni artificiali ai tessuti vegetali con vari strumenti che imitano il meccanismo specifico delle parti della bocca degli insetti sufficiente a causare il rilascio di DAMP e innescare la produzione di geni di difesa. Altri componenti specifici degli insetti come secrezioni orali o rigurgitti vengono spesso aggiunti per replicare il contributo degli HAMP9,10,11. La creazione di una dimensione e di un tipo specifico di ferita e l'applicazione di quantità precise di HAMP è uno dei vantaggi di questi tipi di studi e può offrire risultati più riproducibili. Gli studi naturali sull'erbivoro, in cui i danni al tessuto vegetale sono compiuti mediante l'applicazione di insetti acquisiti sul campo o allevati in laboratorio, sono spesso più impegnativi perché le quantità di ferita e HAMP sono regolate dal comportamento degli insetti e aggiungono variabilità al dati. I metodi naturali rispetto a quelli simulati e i loro vantaggi e svantaggi sono ben dibattuti nella letteratura12,13,14.

Per studiare gli eventi di segnalazione precoce come i fattori di trascrizione, una certa percentuale della foglia deve essere consumata in un lasso di tempo relativamente breve, quindi le larve devono iniziare a masticare immediatamente e mantenere il consumo fino a quando la foglia non viene congelata per l'analisi. M. sexta è un alimentatore vorace su più piante solanacee durante molte delle sue fasi larve, rendendolo ideale per impartire il massimo danno in un tempo relativamente breve15. Ciò è utile quando si studiano i primi eventi di segnalazione, poiché la risposta della pianta si verifica quasi immediatamente dopo che un insetto contatta la superficie fogliare16,17. Il metodo di contenimento delle gabbie a clip comunemente usato si dimostra goffo, in quanto più gabbie richiederebbero continui aggiustamenti durante l'esperimento per consentire la rimozione o l'aggiunta di larve. Le foglie devono anche essere abbastanza grandi e forti da sostenere l'alimentazione di più insetti contemporaneamente. Questi tipi di piante di patate richiedono una grande quantità di spazio per osservare l'alimentazione. Le larve spesso si spostano nella parte inferiore della superficie della foglia, il che rende anche le osservazioni di alimentazione piuttosto difficili. L'uso di piante intere per eseguire questi esperimenti è chiaramente ingombrante.

Lo studio attuale utilizza foglie staccate isolate nei piatti Petri piuttosto che intere piante per snellire e semplificare l'intero approccio vegetale allo studio dell'erbivoro. L'applicazione del protocollo in questo studio è limitata all'osservazione di un gruppo di fattori di trascrizione C2H2 indotti precocemente nelle foglie di patate dopo danni erbivori da parte delle larve di M. sexta.

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Protocollo

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NOTA: il seguente protocollo è progettato per una persona per impostare, effettuare osservazioni e raccogliere campioni. Più corse della stessa configurazione possono essere combinate per aumentare la replicazione biologica. Eventuali ripetizioni aggiuntive dell'esperimento dovrebbero essere impostate alla stessa ora del giorno per eliminare possibili influenze diurne sull'espressione genica. Il protocollo è progettato per creare 3 foglie "infestate" per 5 punti di tempo di raccolta separati. Il controllo corrispondente lascia per ogni punto temporale creare un totale di 30 campioni. L'esperimento può essere eseguito con una varietà di dimensioni delle foglie e stadi larvali, ma si raccomanda che la dimensione della foglia, lo stadio larvale e il tempo di infestazione siano coerenti durante tutta la procedura.

1. Preparazione delle piante di patate

NOTA: Tutti i passaggi che richiedono una tecnica sterile devono essere eseguiti in un cofano di coltura dei tessuti18,19.

  1. Preparare le piantagioni di Kennebec dalla fonte dell'espianto.
    1. Preparare il supporto di propagazione.
      1. Aggiungere 4,43 g di Murashige e Skoog (MS) con vitamine in polvere, 20 g di saccarosio e 2 g di agar sostituiscono 1 L di osmosi inversa (RO)-purificato acqua in un flacone 2 L con una barra di rotazione. Trasferire il pallone su un piatto di agitazione e mescolare. Regolare pH a 5,8 utilizzando NaOH continuando a mescolare.
        NOTA: Agar non si dissolve fino a quando non viene autoclaved.
      2. Aggiungere 1 mL di conservante/biocida e autoclave su ciclo liquido per 20 min (121 , 101,3 kPa). Togliere il mezzo dall'autoclave subito dopo che il ciclo è finito e raffreddarlo a 50 gradi centigradi. Trasferire 100 mL di recipienti di propagazione sterili e raffreddati da medio a sterile (ad esempio, Magenta o Plantcon) utilizzando una tecnica sterile in una cappa di coltura tissutale.
    2. Preparare il materiale dell'espianto.
      1. Ottenere la fonte di espiante come patate di semi Kennebec e rimuovere tutte le tracce di terreno lavando con il rubinetto H2O. Rimuovere i germogli e tagliare in pezzi di 2 cm con un bisturi sterile.
      2. Sterilizzare i pezzi di germogli ammollo ammollo per 15 s nel 70% di etanolo, seguita da 13 min in 1:1 candeggina (1 parte RO-acqua: 1 parte concentrato germicida / quota commerciale candeggina di grado). Risciacquare 5 volte in sterile H2O.
      3. Trasferire materiale espiante in vasi di coltura tissutale sterili con mezzo di propagazione in un cofano di coltura tissutale utilizzando una tecnica sterile. Trasferire i vasi in una camera di coltura dei tessuti vegetali e crescere per 2-u20123 settimane o fino a quando le piantine si formano a 24 , 16 h luce (140 s-s-1)/8 h fotoperiodo scuro.
  2. Preparare piante di patate per la coltura dei tessuti propagancati dal nodale.
    1. Preparare il mezzo di trasferimento nodale.
      NOTA: Questo farà 10 vasi di coltura tissutale che possono essere utilizzati lo stesso giorno o possono essere fatti in anticipo e conservati a 4 gradi centigradi fino al trasferimento nodale.
      1. Aggiungere 36,43 g di mix di agar nutriente a 1 L di acqua depurata dal RO in un pallone da 2 L con una barra di spin. Trasferire il pallone su un piatto di agitazione e mescolare. Regolare pH a 5,8 utilizzando KOH continuando a mescolare.
        NOTA: Agar non si dissolve fino a quando non viene autoclaved.
      2. Autoclave su ciclo liquido per 20 min (121 o C, 101,3 kPa). Togliere il mezzo dall'autoclave subito dopo che il ciclo è finito e raffreddarlo a 50 gradi centigradi. Trasferire 100 mL di mezzi di trasferimento nodale raffreddato sterile a vasi di coltura sterili (vedi la Tabella dei Materiali) utilizzando la tecnica sterile in una cappa di coltura tissutale.
    2. Preparare tagli nodali.
      1. Ottenere le piantagioni Kennebec coltivate con materiale espiante (prodotto al punto 1.1.2). Le piantine devono avere da 3 a 4 nodi (punti di diramazione). Rimuovere le foglie con forbici sterili o bisturi. Tagliare i rami vicino allo stelo principale, lasciando circa 2 mm di tessuto diramazione.
      2. Rimuovere le sezioni nodali dal gambo tagliando circa 2 mm sopra e sotto ogni punto di diramazione o nodo. Disporre i tagli nodali in un recipiente di coltura dei tessuti sterili contenente un mezzo di trasferimento nodale (prodotto al punto 1.2.1.2) nello stesso orientamento del recipiente precedente (ramo rivolto verso l'alto).
      3. Trasferire i recipienti con tagli nodali in una camera di coltura dei tessuti vegetali e crescere per 2,u20123 settimane a 24 gradi centigradi, 16 h luce (140 s-s-1)/8 h fotoperiodo scuro.
        NOTA: Ogni taglio nodale crescerà in una nuova pianta. Il numero di tagli in ogni recipiente determina la dimensione della foglia. Un minor numero di tagli trasferiti per recipiente comporterà foglie più grandi. Tre piante per vaso avranno foglie da 15 mm x 20 mm in 2,u20123 settimane.
  3. (Facoltativo) Preparare il terreno coltivato piante di patate Kennebec.
    NOTA: Per produrre foglie più grandi, le piantagioni di patate propagate nodali possono essere trasferite sul suolo.
    1. Trasferire le piantagioni di patate coltivate nel mezzo di trasferimento nodale al suolo tirando delicatamente la pianta dal mezzo fino a quando tutto il tessuto radicale viene rilasciato dall'agar.
    2. Trasferire sul terreno appena sopra il primo nodo dalle radici e imballare leggermente il terreno intorno al trapianto. Acqua delicatamente per garantire il contatto del suolo con il sistema radicale.
    3. Posizionare in una camera di crescita con 16 h luce (140 smol -m-2s-1)/8 h fotoperiodo scuro e temperature di giorno/notte 25/20 gradi centigradi.
      NOTA: Le piante sono pronte quando le prime due foglie completamente espanse hanno raggiunto le dimensioni appropriate per il saggio.
  4. (Facoltativo) Preparare le piante di patate coltivate a tuberi.
    NOTA: Le piante di patate coltivate da tuberi sono più grandi e robuste e possono essere utili se si allevano larve sulle piante o se si desidera l'alimentazione larvale durante la notte.
    1. Mettere un tubero di patate 6 in profondità in un 10 in pentola contenente miscela di terreno integrato con 10 mL di fertilizzante a rilascio lento.
    2. Posizionare in una camera di crescita con 16 h luce (140 smol -m-2s -1)/8 h di fotoperiodo scuro e temperatura diurna/notte 25/20 gradi. Le piante sono pronte a circa 30-u201240 giorni dalla semina dei tuberi.
      NOTA: Non utilizzare piante che hanno cominciato a fiorire.

2. Preparazione degli insetti per l'alimentazione

  1. Ottenere lo stadio larvale desiderato di M. sexta.
    NOTA: Le larve per questo studio sono state allevate su dieta artificiale attraverso il 5o instar20 e messo in scena da un individuo esperto dall'insetto in-house. Le larve possono anche essere allevate parzialmente o completamente sul tessuto vegetale. Le larve non mangiano immediatamente prima di una muta e sono più propense a mangiare subito dopo la muta, quindi la messa in scena appropriata è importante21.
  2. Trasferire le larve a un vaso di contenimento appropriato (ad esempio, un piatto di coltura tissutale 6-, 12-, 24-pozzetto) a seconda delle dimensioni della larva. Ci dovrebbe essere una larva per bene nel piatto.
    NOTA: Le larve possono mostrare un comportamento territoriale o cannibale senza una fonte di cibo e possono essere ferite se alloggiate insieme.
  3. (Facoltativo) Larve affamate fino a 2 h in quanto ciò può migliorare l'alimentazione larvale.
    NOTA: Le larve devono essere in un recipiente di contenimento immagazzinato nella camera di crescita durante questo periodo.

3. Configurazione dei componenti per l'esperimento di infestazione

NOTA: vedere il riepilogo schematico nella Figura 1.

  1. Crea modelli di posizionamento per ogni punto di raccolta.
    NOTA: È utile impostare 5 vassoi diversi per ogni punto di raccolta. Questo mantiene i campioni organizzati e permette ai piatti di essere spostati in modo più efficiente come un insieme senza cambiare la loro disposizione. Se verranno eseguiti calcoli relativi alla percentuale di danni, questo è essenziale in quanto le immagini prima e dopo l'infestazione devono essere acquisite alla stessa lunghezza focale.
    1. Ottieni 5 robusti vassoi in grado di contenere un set di sei piatti Petri di dimensioni adeguate e linea con carta bianca.
      NOTA: La dimensione del piatto Petri si basa sulla dimensione della foglia scelta per il saggio di alimentazione. La foglia dovrebbe adattarsi facilmente nel piatto senza toccare i lati. Ad esempio, un piatto da 60 mm x 15 mm è adatto per foglie fino a 50 mm di lunghezza o larghezza.
    2. Tracciare un set di sei cerchi utilizzando il piatto Petri di dimensioni appropriate sulla carta in ogni vassoio. Etichetta un gruppo di cerchi 'controlla' A, B e C e gli altri 'infestati' A, B e C. Assegnare anche un'etichetta a ogni modello di posizionamento con il tempo di raccolta appropriato.
  2. (Facoltativo) Impostare una fotocamera per l'acquisizione di immagini "prima dell'infestazione" e "dopo l'infestazione".
    1. Fissare una fotocamera su uno stand alla lunghezza focale appropriata per l'acquisizione di immagini di tutti i piatti Petri nel modello di posizionamento.
  3. Etichettare i tubi del punto di raccolta.
    1. Etichettare un set di tubi di microcentrifuga da 30, 1,7 mL corrispondenti a ciascun cerchio nel modello di posizionamento. Etichettare i tubi per identificare in modo appropriato la perturbazione (controllo/infestata), la lettera di replica dell'impianto (A, B o C) e il punto di raccolta (numero di minuti dopo il periodo di infestazione).
  4. Preparare i piatti Petri scelti al punto 3.1.1.
    1. Inserire un disco di carta da filtro sterile in ciascuno dei 30 piatti Petri del passaggio 3.1.1. Aggiungere acqua sterile per inumidire i dischi; non permettere all'acqua in eccesso di raggrupparsi nel piatto. Posizionare ogni piatto in ciascuno dei sei cerchi in ogni modello di posizionamento.
    2. Posizionare tre piante di patate accanto a ciascun modello di posizionamento. Assicurarsi che le piante siano tutte della stessa età e dimensione relativa.

4. Esecuzione dell'infestazione

NOTA: viene impostato un punto/modello di posizionamento del punto di raccolta alla volta.

  1. Togliere le prime due foglie abbinate da ogni pianta con forbici sterili e mettere una foglia nella parabola di controllo Petri e una nella parabola Petri infestata per ogni pianta (A, B e C). Eseguire questo processo il più rapidamente possibile.
  2. (Facoltativo) Trasferisci il modello di posizionamento sul supporto della fotocamera per catturare un'immagine "prima dell'infestazione".
  3. Trasferire le larve a ogni piatto infestato utilizzando pinze soft touch il più rapidamente possibile. Impostare il timer per l'ora di 'infestazione' desiderata.
    NOTA: Il periodo di tempo in cui le larve consumano il tessuto fogliare è il "tempo di infestazione". Questo è qualcosa che può essere determinato empiricamente utilizzando alcune foglie / larve di prova prima dell'inizio dell'infestazione effettiva. Il "tempo di infestazione" prescelto deve essere coerente per tutte le foglie infestate.
    NOTA: Le larve devono essere maneggiate con cura con pinze a tocco morbido. Dal 2o alla 4a instella può essere afferrato delicatamente dal corno o dalla sezione centrale.
  4. Osservare l'alimentazione per assicurarsi che tutte le larve mangino. Le larve devono essere aggiunte/rimosse in base al comportamento alimentare. Tenere i coperchi sui piatti Petri il più possibile.
    NOTA: Possono essere utilizzate larve multiple per foglia.
  5. Rimuovere le larve dalle foglie alla fine del tempo di infestazione. Avviare il timer per il tempo di raccolta.
  6. (Facoltativo) Trasferisci il modello di posizionamento sul supporto della fotocamera per catturare l'immagine "dopo l'infestazione".
    NOTA: Tutte e sei le foglie nel modello di posizionamento vengono raccolte al momento del raccolto specifico.

5. Foglie di raccolta

  1. Trasferire ogni foglia al tubo etichettato corrispondente alla fine di ogni punto di tempo di raccolta e congelare immediatamente facendo cadere il tubo nel liquido N2. Conservare il tessuto vegetale raccolto a -80 gradi centigradi fino all'isolamento dell'RNA.
  2. Ripetere i passaggi da 4 a 20125.1 per ogni punto di raccolta.

6. Elaborazione del tessuto fogliare per l'analisi dell'espressione genica

  1. Macinare il tessuto fogliare congelato in polvere con un micropestle.
  2. Isolare l'RNA totale e il processo per l'espressione genica come descritto in precedenza22.

7. (Facoltativo) Stima dei danni alle foglie

  1. Stimare visivamente la percentuale di danni alle foglie o calcolare l'area delle foglie nelle immagini prima e dopo l'infestazione.
  2. Misurare l'area foglia con strumenti software (ad esempio, Phenophyte)23.
  3. Dalle misurazioni dell'area foglia, calcolare la percentuale di danni
    % danno : [(zona foglia prima – zona foglia dopo)/area foglia prima] x 100.

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Risultati

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Il consumo foglia definisce il successo del protocollo. Le larve in fase sane e accurate dovrebbero iniziare l'alimentazione immediatamente dopo il posizionamento sulla superficie della foglia e l'alimentazione dovrebbe continuare in modo abbastanza coerente per tutto il tempo di infestazione. Nel Video1, la larva nella parte superiore inizia a masticare subito dopo il posizionamento e mantiene una velocità costante durante l'alimentazione. Ciò è particolarmente important...

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Discussione

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L'uso di metodologie erbiflue vegetali intere esistenti non è necessario per raggiungere l'obiettivo di questo particolare studio (ad esempio, vagliare una serie di geni candidati per la loro risposta all'infestazione). L'ovvio vantaggio della raffinatezza delle foglie staccate è l'accorciamento del tempo necessario per eseguire i saggi erbivori. La natura ingombrante di intere piante con gabbie clip viene eliminata e i saggi vengono eseguiti prima, poiché le piante fino a 2 settimane possono essere utilizzate per raccog...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Bob Farrar e Alexis Park per aver fornito insetti utilizzati in questo studio e per la loro esperienza nella messa in scena larvale. Ulteriori grazie a Michael Blackburn e Saikat Ghosh per la revisione critica del manoscritto.

La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha lo scopo esclusivamente di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.

USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Il prodottoG3251PhytoTechnology Laboratories
il recipiente di contenimento Gelzan (piatto da 6,12 o 24 pozzetti)Fisher Scientific 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51molte altre aziende vendono questi prodotti
uova manduca Carolina Biological Supply Company14388030-50 uova
uova di manduca Great Lakes HornwormNA50, 100, 250 o 500 uova
larve di manducaCarolina Biological Supply Companychiama per richieste specifiche di stadi larvaliqualsiasi
larva di manduca instar qualsiasi larva di instarGrandi Laghi chiamaper richieste specifiche di stadi larvali
provette per microcentrifuga instar, 1,7 ml Thomas Scientific1158R22questi sono stati testati nel liquido N2 e non esploderanno
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/VitaminsPhytoTechnology LaboratoriesM519utilizzato per fare la propagazione medium
nutriente agar mixPhytoTechnology LaboratoriesM5825il prodotto è Murashige & Skoog Basal Medium con vitamine, saccarosio e
dischi filtranti in cartaFisher Scientific.09-805ACerchi Whatman-acquisto per adattarsi alla capsula
Petri, 60X15 mm o 100X15 mmFisher Scientific FB0875713A o FB0875712formato di acquisto appropriato per
i tuberi di patataqualsiasitaglia B (non biologico)suggerisci Maine Farmer' s Vasi di scambio
, 10" Forniture per serre Griffin, Inc.41PT1000CN2
conservante/biocidaTecnologia delle cellule vegetaliIl prodotto NAè PPM (Plant Preservative Mixture)
da semina per fonte di espiantoqualsiasidimensione B (non organica),suggerisce l'agricoltore del Maine' s
Scambio fertilizzante a lenta cessione (14-14-14 )anyNAOsmocote è un popolare marchio
pinze soft touchBioQuip4750
miscela di terrenoGriffin Greenhouse Supplies, Inc.65-51121il prodotto è
un recipiente di coltura sterilePhytoTechnology LaboratoriesC2100Recipiente di tipo magenta, PTL-100
sterile recipiente di coltura Fisher Scientific ICN2672206prodotto è MP Biomedicals Plantcon
di è dei qualsiasi Gelzan di delle dimensioni delle foglie  patate , di per miscele Sunshine LC1

Riferimenti

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