Articolo metodologico

Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

DOI:

10.3791/59160

⸱

15 marzo 2019

 ,  ,  ,  , 
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel tessuto del midollo spinale del ratto. Il vettore è preso alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio. Questo modello è adatto per l'analisi retrograda di importanti vie spinali o cellule targeting per applicazioni di terapia genica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'introduzione di proteine di interesse nella cellule nel sistema nervoso è impegnativo a causa delle barriere biologiche innate che limitano l'accesso alla maggior parte delle molecole. Iniezione direttamente nel tessuto del midollo spinale ignora queste barriere, fornendo accesso ai corpi cellulari o sinapsi dove molecole possono essere incorporati. Combinando la tecnologia di vettore virale con questo metodo consente di introduzione di geni bersaglio in tessuto nervoso ai fini della terapia genica o la traccia del tratto. Qui un virus progettato per trasporto retrogrado altamente efficiente (HiRet) è stato introdotto alle sinapsi di interneuroni propriospinal (PNs) per incoraggiare il trasporto specifico ai neuroni nel midollo spinale e dei nuclei del tronco cerebrale. Targeting PNs sfrutta le numerose connessioni che ricevono da vie del motore come i tratti nucleo e reticulospinal, nonché la loro interconnessione con a vicenda durante segmenti del midollo spinale. Rappresentante l'analisi utilizzando il vettore HiRet con dettagli di alta fedeltà spettacoli costitutivamente attiva proteina fluorescente verde (GFP) di corpi cellulari, assoni e pergole dendritiche in PNs toracica e in neuroni di reticulospinal nella formazione reticolare di Pontina. HiRet incorpora bene nella vie del tronco cerebrale e PNs ma mostra età dipendente integrazione nei neuroni del tratto corticospinale. In sintesi, l'iniezione del midollo spinale usando vettori virali è un metodo adatto per introduzione di proteine di interesse in neuroni dei tratti mirati.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vettori virali sono importanti strumenti biologici che possono introdurre materiale genetico nelle cellule al fine di compensare i geni difettosi, proteine di sovraregolare l'importante crescita o fabbricare proteine marker che mettono in risalto la struttura e le connessioni sinaptiche del loro obiettivi. Questo articolo si concentra su iniezione diretta di un vettore lentivirale retrogradely trasportabile altamente efficiente nel midollo spinale del ratto al fine di evidenziare le principali vie del motore con l'analisi fluorescente.  Questo metodo è anche molto adatto per studi di rigenerazione e la ricrescita assonali per introdurre le proteine di interesse in diverse popolazioni di neuroni ed è stato utilizzato per mettere a tacere i neuroni per mappatura funzionale studi1,2.

Molti dei dettagli anatomici delle vie motorie spinali sono stati chiariti attraverso studi di iniezione diretta con traccianti classici quali BDA e fluoro-oro3,4,5,6,7 , 8. tali rivelatori sono considerati il gold standard ma possono avere alcuni svantaggi come l'assorbimento dagli assoni danneggiati, o assoni in passaggio nella materia bianca che circonda un'iniezione sito9,10,11 . Questo potrebbe portare a errate interpretazioni della connettività via e può essere uno svantaggio negli studi di rigenerazione dove assorbimento della tintura da assoni danneggiati o mozzati potrebbe essere scambiato per la rigenerazione delle fibre durante la successiva analisi12.

Vettori lentivirali sono popolari in studi di terapia genica, in quanto forniscono espressione stabile, a lungo termine in popolazioni neuronali13,14,15,16,17,18 ,19. Tuttavia, tradizionalmente confezionati vettori lentivirali può avere limitata trasporto retrogrado e può innescare la risposta del sistema immunitario quando utilizzato in vivo4,20,21. Un vettore di trasporto retrogrado efficiente chiamato HiRet è stato prodotto da Kato et modificando la busta virale con una glicoproteina del virus di rabbia per creare un vettore di ibrido che migliora il trasporto retrogrado22,23.

Analisi retrograda introduce un vettore nello spazio sinaptico di un neurone bersaglio, permettendo così di essere ripreso da assone di tale cella e trasportati al corpo cellulare. Trasporto di successo di HiRet è stata dimostrata da sinapsi neuronali nel cervello di topi e primati23,24 e dal muscolo nei motoneuroni22. Questo protocollo dimostra iniezione nel midollo spinale lombare, specificamente destinati i terminali sinaptici di propriospinal interneuroni e neuroni del tronco cerebrale. PNs ricevere connessioni da molte diverse vie spinali e quindi può essere utilizzato per indirizzare una popolazione diversificata di neuroni nel midollo spinale e del tronco cerebrale. Neuroni identificati in questo studio rappresentano circuiti che innervano motoneurone piscine relative alla funzione motoria hindlimb. Etichettatura robusto è visto nel midollo spinale e del tronco cerebrale, compresi i dettagli ad alta fedeltà di pergolati dendritiche e terminali assonici. Abbiamo anche utilizzato questo metodo negli studi precedenti all'interno del midollo spinale cervicale per etichettare propriospinal e del tronco cerebrale reticulospinal vie25.

Questo protocollo dimostra l'iniezione di un vettore virale nel midollo spinale lombare di un ratto. Come si vede nel film 1, l'incisione è mirata individuando la vertebra L1 che si trova presso l'ultima costola. Viene utilizzato come punto di riferimento caudale per un'incisione di 3-4 cm che espone la muscolatura sopra la colonna vertebrale L1-L4. Laminectomies degli aspetti dorsali delle vertebre T11-T13 vengono eseguite e un ago di vetro smussato è diretto 0.8 mm laterale dalla linea mediana e abbassato 1,5 mm profondità nella materia grigia per iniettare il virus.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le seguenti procedure di cura chirurgica e animale sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato della Temple University.

1. pre-operatoria preparazioni

  1. Preparare il vetro tirato aghi per iniezione virale pochi giorni prima dell'intervento chirurgico utilizzando pipette capillari 3,5 in vetro nanolitro progettati per nanolitro iniettori. Tirare ogni pipetta un estrattore di ago in due fasi secondo le istruzioni del produttore per creare due modelli di aghi.
  2. Affinare la punta dei modelli dell'ago con il taglio da circa 1-2 mm di vetro in eccesso con microforbici. Misura approssimativa apertura dimensioni sotto un microscopio con un vetrino di calibrazione per isolare gli aghi con aperture di 30-40 µm.
  3. Con l'ago posizionato a 30°, è possibile utilizzare una Smussatrice micropipetta per creare una punta con un'apertura di 30-40 µm e un angolo di smusso di 45°. Verificare la larghezza di apertura con la scala del nonio su vetrino di calibrazione. Passare acqua ed etanolo attraverso l'ago di vetro usando una siringa con un allegato di ago flessibile per lavare via i detriti e contrassegnare l'ago a intervalli regolari con un pennarello nero.
  4. Posizionare gli aghi in un piatto coperto di Petri precedentemente puliti con etanolo al 70% e sterilizzare per 30 min in una cappa di biosicurezza ai raggi UV.
  5. Preparare dei lentivirus HiRet rimuovendo un volume idoneo dal freezer immediatamente prima della procedura.
    Nota: Un volume idoneo include l'importo necessario per l'iniezione (1 µ l per iniezione x numero di iniezioni) più una piccola quantità di volume in più per tenere conto per il pipettaggio e perdite di carico. Trasportare e conservare il virus su ghiaccio quando non in uso.
  6. Preparare l'iniettore inserendolo la micropompa e mettendoli in un micromanipolatore con scala Vernier.
  7. Per preparare l'ago di vetro, accuratamente caricare una tintura colorata come olio rosso con una siringa provvisti di un ago flessibile. Garantire che nessun bolle rimangono nell'ago. Usare una tecnica asettica quando si maneggia l'ago e astenersi dal toccare la punta.
  8. Inserire l'ago di vetro l'iniettore, assicurando che l'ago sia inserita correttamente nelle rondelle, iniettore è chiusa con il tappo stretto e ago dell'iniettore in acciaio si estende approssimativamente ¾ della lunghezza dell'ago di vetro. Virus possono essere caricati nell'ago in un passaggio successivo.

2. anestesia e preparazione del sito chirurgico

  1. Pesare l'animale su una bilancia digitale. Registrare il peso pre-operatorio per determinare il volume di anestetico richiesto e per consentire il monitoraggio di peso post-chirurgia. Ratti Sprague-Dawley femminili circa 200 – 250 g sono stati usati in questo protocollo.
  2. Anestetizzare il ratto tramite inalazione isoflurane o una soluzione di chetamina/xilazina iniettata (k / x). Qui, la ketamina è iniettato intraperitonealmente a 67 mg/kg e xilazina ad un dosaggio di 6,7 mg/kg.
  3. Confermare un appropriato piano di anestetico pizzicando il piede saldamente. In caso di ritiro riflessivo, attendere alcuni minuti supplementari prima di procedere.
    Nota: Osservare anche i baffi, gli occhi e tasso di respirazione per segni di coscienza. Se i baffi sono spasmi muscolari, l'occhio lampeggia quando viene toccato delicatamente o respirazione è rapido e superficiale, attendere fino a quando il piano di anestetico è più profondo di procedere con il protocollo. Inoltre monitorare questi segni in tutta la chirurgia di laminectomy e iniezione. Se l'animale Visualizza un piano superficiale di anestetico, amministrare un booster shot di sola ketamina uguale a ½ l'originale k / x dosaggio.
  4. Radere il ratto lungo la linea mediana dorsale dai fianchi fino all'angolo inferiore delle scapole. Tendere la pelle dell'animale per una rasatura più facile e precisa.
  5. Applicare unguento oftalmico in entrambi gli occhi.
  6. Applicare antisettico per zona rasata per sterilizzare il sito. Per la prima macchia, bagnare garze sterili con una soluzione di 5% di iodio e pulisca via tutti i capelli e detriti. Seguire questo con uno swipe unidirezionale con garza sterile imbevuta di etanolo al 70%, in modo che nessuna zona è contattata due volte. Utilizzare questa stessa tecnica con alternanza di iodio e garza imbevuta di etanolo di altre due volte.

3. preparazione di campo e strumento chirurgica

  1. Preparare un set di strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave che includono un bisturi, Pinze ossivore, ratto dente pinze, forbici di primavera, emostatiche, punto medio curvata forcipe e divaricatori o ganci ponderate di scartare l'involucro sterile per creare un campo sterile.
  2. Aprire un pacchetto di guanti chirurgici sterili e posizionare l'involucro sterile guanto sul tavolo. Utilizzare questo come un campo sterile supplementare per gli strumenti utilizzati per prevenire la contaminazione dell'involucro sterile.
  3. Lasciar cadere una lama per bisturi #10 sul campo sterile. Fissare la lama ad un manico con emostatiche. Soluzione salina sterile posizione, 4,0 catgut cromico sutura e materiali per controllare lo spurgo come un cauterizzatore, garza sterile, applicatori di cotone con punta sterili (per le sbavature del muscolo), o gelfoam o bonewax (per le sbavature dell'osso) in un luogo accessibile.
  4. Recuperare l'animale e impostarlo su un panno sterile. Posizionare la garza sotto la vescica per raccogliere l'urina. Puntellare l'area di destinazione con un asciugamano arrotolato sotto l'addome. Se disponibile, posto un rilievo di riscaldamento chirurgico sotto il panno sterile, soprattutto per le procedure più lunghe.
    Nota: La sterilità è importante durante la chirurgia di sopravvivenza. Tenere una bottiglia dello spruzzo di etanolo al 70% a disposizione per mantenere la sterilità delle mani guantate e uno sterilizzatore di perlina di uso se è stata compromessa la sterilità dello strumento, o tra singoli interventi chirurgici.

4. esponendo la colonna vertebrale e identifica il sito di laminectomia

  1. Identificare l'area in cui un'incisione della pelle verrà effettuata premendo delicatamente le dita presso l'ultima costola per individuare la vertebra L1. Usando questo come un punto di riferimento, fare un'incisione cutanea di 3-4 cm con un bisturi chirurgico #10 termina appena inferiore a L1 per esporre il muscolo. Tendete la pelle delicata diffondendo e premere con forza con la lama del bisturi per garantire un'incisione pulita.
  2. Tagliare e diffondere il grasso superficiale con pinze e le forbici se necessario. (A seconda sulla vertebra di destinazione, ci può o non essere un grande rilievo grasso superficiale al muscolo).
  3. Sento per i processi spinous con il piatto della lama bisturi o un dito. Spesso la zona del midline sarà delineata da una "V" della fascia bianca su entrambi i lati. Fare un piccolo taglio rostrale per consentire di afferrare saldamente su un processo superiore con il forcipe di ratto del dente, poi fare 2 lunghi, profondi tagli più vicino i processi possibili. Il punto più profondo del taglio, la superficie dorsale delle vertebre può essere sentita con il bisturi.
  4. Tenere i muscoli laterali da parte con divaricatori o ponderate ganci per migliorare la visibilità. Muscolare chiaro circa i processi con un bisturi, forbici di primavera o Pinze ossivore per determinare la forma delle loro teste.
    Nota: Ricordare che il midollo spinale non si estende l'intera lunghezza della colonna vertebrale, come le fermate di tessuto del midollo spinale prima nello sviluppo di osso in crescita. Ciò significa che il livello spinale di destinazione potrebbe essere sotto una vertebra diversamente denominata.
  5. Individuare il T11 e i processi di T12 e T13 adiacenti.
    Nota: Assistenza di mira i corretti livelli vertebrali è reperibile in un Atlante di midollo spinale del ratto e gli studi precedenti che delinea luoghi d'interesse al mouse, che ha una molto simile struttura vertebrale6,33. Un processo spinous rostrale come T9. lasciare riposare per dare un punto di riferimento del midline.

5. esecuzione di una laminectomia

  1. Una volta identificata correttamente l'area di destinazione, eseguire i laminectomies degli aspetti dorsali di T11-T13. Delicatamente e diffondere le vertebre per rivelare legamenti intervertebrali, che sono buoni siti per inserire Pinze ossivore per il morso iniziale dell'osso. Tenere le Pinze ossivore in grado di aumentare il controllo fine chiusa a metà.
  2. Rimuovere i processi spinous e funzione dorsale delle vertebre prendendo piccoli morsi con le Pinze ossivore. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale o disturbare la dura madre. Sollevare leggermente con il forcipe del dente di ratto per contribuire a tirare il midollo spinale dalle vertebre e diminuire la tendenza a colpire il tessuto del midollo spinale.
  3. Sgombrare il campo dell'osso dalla linea mediana affinché il linea mediana del vaso sanguigno possono essere osservato. Lasciare una finestra che chiaramente Mostra il tessuto del midollo spinale ed è privo di detriti.
  4. Toccare delicatamente il midollo spinale con il forcipe. Alcuni animali possono riflessivamente saltare, anche se il loro aereo anestetico è profondo. Applicare alcune gocce di un agente paralizzante come la lidocaina direttamente al midollo spinale per evitare di saltare durante la procedura di iniezione.
  5. Fissare l'animale in un supporto spinale di fissaggio stabilizzante forcipe ai processi spinous rostrali e caudali alla finestra laminectomia. Sollevare l'addome dell'animale usando il titolare spinale per negare l'effetto di movimenti di respirazione. Ciò aumenterà la stabilità dell'ago e garantire adeguata profondità di iniezione.

6. caricamento virus e posizionamento dell'iniettore

  1. Caricare virus nell'iniettore di pipettaggio circa 5 µ l su un pezzo di parafilm e posizionare l'ago in modo che la punta è dentro la goccia.
  2. Utilizzare la micropompa per prelevare fino a 4 µ l di virus ad un tasso di 20 – 100 nL/s.
  3. Impostare il controller per iniettare e rilasciare una piccola quantità di virus dall'ago affinché che la punta dell'ago non sia ostruita. Eliminare virus in eccesso con un panno da laboratorio.
    Nota: Una siringa Hamilton con un ago d'acciaio può essere utilizzata come alternativa alle pipette in vetro tirato.
  4. Posizionare il micromanipolatore, in modo che la scala del nonio è visibile e posizionare l'ago al midline del midollo spinale.
    Nota: La linea mediana può trovarsi a volte da un grande vaso sanguigno in esecuzione sulla superficie anteriore del midollo spinale. Tuttavia, questo può variare in ratti individuali e il targeting del midline dovrebbe essere confermato dal confronto con un processo spinous intatto.
  5. Dirigere l'ago lateralmente da 0,8 mm utilizzando la scala di Vernier il micromanipolatore.
  6. Abbassare l'ago al midollo spinale fino al rientro, ma non perforare, la dura madre. Con un rapido movimento rotatorio, la puntura dura con l'ago fino a quando ha affondato ad una profondità di 1,5 mm.

7. iniettare il virus nel midollo spinale

  1. Una volta che l'ago è in posizione, programma l'iniettore per iniettare a una velocità di 400 nL/min., a conferma che il virus sta entrando il midollo spinale di osservare l'andamento della parte anteriore di tintura. Ci dovrebbe essere nessuna perdita evidente o rigonfiamento del tessuto del midollo spinale. Se la perdita è osservata, a volte possono essere alleviato riducendo la velocità di iniezione di 200 nL/min.
  2. Una volta terminata l'iniezione, consentire l'ago riposare nel midollo spinale per 2 – 5 min (a seconda del volume iniettato) per facilitare la diffusione del virus.
  3. Lentamente, ritirare l'ago e spostare il prossimo sito di iniezione. Iniettare 1 µ l di virus in ognuno dei 6 siti uniformemente spaziati circa 1 mm di distanza lungo la lunghezza del tessuto spinale L1-L4. L'ago stesso può essere utilizzato per ogni iniezione, purché continui a funzionare correttamente.

8. cura di chiusura e post-operatorio della ferita

  1. Rimuovere l'animale dal titolare spinale ed estrarre divaricatori o ganci utilizzati per diffondere il muscolo laterale. Assicurarsi che la ferita sia libera da tutti i detriti prima della chiusura.
  2. Suturare il muscolo utilizzando una sutura 4.0 catgut cromico. Tagliate i fili di sutura vicino il nodo per ridurre il rischio di irritazione della pelle interna.
  3. Fiocco la pelle chiusa utilizzando clip 9 mm della ferita. Per consentire una guarigione ottimale, allineare i bordi della pelle prima di pinzatura.
  4. Metti l'animale su una convezione di acqua riscaldamento pad e monitor fino a quando il vigile.
  5. Iniettare 5 – 10 mL di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea per reintegrare i liquidi e un antibiotico come cefazolin per prevenire l'infezione. Quando l'animale è ambulatorio, inserirlo indietro nella sua gabbia a casa e fornire analgesici iniziali.  I ratti di qualsiasi segno di dolore e l'angoscia di monitorare e trattare secondo la procedura IACUC approvato per alleviamento di dolore.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iniezione di successo e di trasporto del vettore virale dovrebbe comportare di trasduzione di una popolazione robusta dei neuroni unilaterale nel midollo spinale ed in alcuni nuclei del tronco cerebrale. Figura 1 di seguito viene illustrato l'etichettatura stereotipata dei neuroni ed assoni nel midollo spinale toracico e nella formazione reticolare Pontina del tronco cerebrale ad post-iniezione quattro settimane. Espressione significativa di GFP è visto in neuroni in mate...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipolazione genetica dei neuroni nel cervello e nel midollo spinale è servito ad evidenziare sensoriali, motorie e autonomiche vie tramite l'analisi fluorescente e di esplorare il potenziale di ricrescita dei tratti neuronale dopo lesione27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. diretto iniezione di ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione dal Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo R01 R01NS103481 e Shriners Hospital per la ricerca pediatrica concede SHC 84051 e SHC 86000 e il dipartimento della difesa (SC140089).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#10 Lame per bisturiRobozRS-9801-10Da utilizzare con il bisturi.
Siringhe da 1 ml Becton, Dickinson and CompanyPer l'iniezione di IP anestetico, potenziali richiami anestetici e iniezioni di antibiotici.
Siringhe da 10 ml Becton, Dickinson and Company309604Per l'iniezione di soluzione salina nell'animale, dopo l'intervento chirurgico.
Sutura cromica 4.0 CatgutDemeTECHNN374-16Per rilegare il muscolo durante la chiusura.
48000 Smussatrice per micropipetteWorld Precision Instruments32416Utilizzato per smussare le punte dei tubi capillari di vetro tirati per formare aghi di vetro funzionali.
Soluzione di iodio al 5%Purdue Products L.P.L01020-08Per l'uso nella sterilizzazione del sito chirurgico.
70% EtanoloN/AN/APer la sterilizzazione di aghi di vetro appena preparati, modelli animali durante la preparazione chirurgica e mani del chirurgo durante l'intervento chirurgico, nonché per tutti gli altri piccoli mantenuti di sterilità.
Anestetico (soluzione di ketamina/xilazina)Zoetis240048Per mantenere l'animale nel corretto piano di coscienza durante l'intervento chirurgico.
Antibiotico (Cefazolina)West-Ward PharmaceuticalsNPC 0143-9924-90Da iniettare per via sottocutanea per prevenire l'infezione post-operatoria.
Sterilizzatore di perlineCellPoint5-1450Per sterilizzare a caldo gli strumenti chirurgici.
BonewaxFine Science Tools19009-00Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
CauterizzatoreFine Science Tools18010-00Per sigillare eventuali arterie o vene recise durante l'intervento chirurgico per prevenire un'eccessiva perdita di sangue.
Bilancia digitaleOkausREV.005Per pesare l'animale durante la preparazione chirurgica.
Attacco flessibile dell'agoWorld Precision InstrumentsMF34G-5Per la pulizia degli aghi di vetro e il caricamento di olio rosso negli aghi di vetro.
GelfoamPfizerH68079Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Tubi capillari in vetroWorld Precision Instruments4878Per aghi in vetro tirati - dovrebbe essere progettato per iniettori di nanolitri.
TagliacapelliOster111038-060-000Per liberare il sito chirurgico dai capelli.
EmostaticiRobozRS-7231Per uso generale in chirurgia.
KimwipesKimtech34155Per uso generale in chirurgia.
Pinze curve a punta mediaRobozRS-5136Per uso generale in chirurgia.
Micromanipolatore con scala a corsoioKanetecN/APer un puntamento preciso durante l'intervento chirurgico.
MicroforbiciRobozRS-5621Per tagliare i fili di vetro dai tubi capillari di vetro appena tirati.
Microscopio con luce e scala a corsoio Oculare LeitzWetzlarN/AUtilizzato per visualizzare e misurare la smussatura di tubi capillari di vetro tirati in aghi di vetro funzionali.
Controller per pompe a microsiringaWorld Precision Instruments62403Per controllare la velocità di iniezione.
Iniettore della testa della pompa Nanoliter 2000World Precision Instruments500150Per caricare e iniettare virus in modo controllato.
Estrattore per aghiNarishigePC-100Per riscaldare e separare i tubi capillari di vetro per formare aghi di vetro.
Unguento oftalamicoDechra Veterinary ProductsRAC 0119Per proteggere gli occhi dell'animale durante l'intervento chirurgico.
ParafilmBemisPM-996Per aiutare a caricare il virus nel nanoiniettore.
Aghi PrecisionGlide (25G x 5/8)Becton, Dickinson and Company305122Da utilizzare con le siringhe da 1 ml e 10 ml per consentire l'iniezione del modello animale.
Pinze per denti di rattoRobozRS-5152Per la presa di processi spinosi.
Red OilN/AN/APer fornire un fronte per la visualizzazione del virus che entra nel tessuto durante l'iniezione.
DivaricatoriRobozRS-6510Per tenere aperta la ferita chirurgica.
Rimadyl CompresseBio ServMP275-050Per la gestione del dolore post-operatorio.
RongeursRobozRS-8300Per rimuovere il muscolo dalla colonna vertebrale durante l'intervento chirurgico.
Manico a lama di bisturiRobozRS-9843Per affettare la pelle aperta e il cuscinetto adiposo di un modello animale durante l'intervento chirurgico.
ForbiciRobozRS-5980Per uso generale in chirurgia.
Clip per ferite in acciaio inossidabileCellPoint201-1000Per legare la pelle della ferita chirurgica durante la chiusura.
Pinze per la rimozione delle graffetteKent ScientificINS750347Per rimuovere le graffette, se applicate in modo errato.
Panno sterilePhenix Research ProductsBP-989Per fornire una superficie sterile per l'operazione.
Applicatori sterili con punta in cotonePuritan806-WCPer assorbire il sangue nella ferita chirurgica mantenendo la sterilità.
Garza SterileCovidien2146Per pulire l'area chirurgica e gli strumenti chirurgici mantenendo la sterilità.
Soluzione salina sterileBaxter Healthcare Corporation281324Per l'uso nella pulizia del sangue e per la sostituzione dei liquidi dopo l'intervento chirurgico.
Guanti chirurgiciN/AN/APer l'uso da parte del chirurgo per mantenere il campo sterile durante l'intervento chirurgico.
Cuscinetto riscaldante chirurgicoN/AN/APer mantenere la temperatura corporea del modello animale durante l'intervento chirurgico.
Microscopio operatorioN/AN/APer una migliore visualizzazione della ferita chirurgica.
Suturatrice chirurgicaKent ScientificINS750546Per applicare le graffette.
Pompa dell'acqua per terapia del calore T / PumpGaymarTP500CPer pompare acqua calda nel cuscinetto riscaldante per convezione dell'acqua.
Cuscinetto riscaldante a convezione d'acquaBaxter Healthcare CorporationL1K018Per l'uso nell'area di recupero post-operatoria per mantenere la temperatura corporea dell'animale incosciente.
Ganci ponderatiN/AN/APer tenere aperta la ferita chirurgica.
309659

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896(2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447(2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313(2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834(2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Spinal Cord InjectionLentiviral VectorRetrograde TransportPropriospinal InterneuronsGFP ExpressionBrainstem NucleiVertebral TargetingMicro pump InjectionDura PunctureNeural Circuit Tracing

Articoli correlati