Utilizzando Nanoplasmon-diffusione migliorata e imaging del microscopio a basso ingrandimento per quantificare gli esosomi derivati dal tumore

Summary

La traduzione clinica di biomarcatori derivati da esoni per le cellule malate e maligne è ostacolata dalla mancanza di metodi di quantificazione rapidi e accurati. Questo rapporto descrive l'uso di immagini a basso ingrandimento per microscopio a campo scuro per quantificare specifici sottotipi di Essome in campioni di siero o plasma di piccolo volume.

Abstract

Le cellule infettate o maligne spesso secernono più esosomi, portando a livelli elevati di esosomi associati alla malattia nella circolazione. Questi esosomi hanno il potenziale per servire come biomarcatori per la diagnosi delle malattie e per monitorare la progressione della malattia e la risposta del trattamento. Tuttavia, la maggior parte delle procedure di analisi Essome richiedono Essome isolamento e fasi di purificazione, che sono di solito richiede tempo e laborioso, e quindi di utilità limitata in contesti clinici. Questo rapporto descrive una procedura rapida per analizzare specifici biomarcatori sulla membrana esterna degli esosomi senza dover separare i passaggi di isolamento e purificazione. In questo metodo, gli esosomi vengono catturati sulla superficie di una diapositiva da anticorpi specifici per Esosoma e poi ibridato con sonde anticorpali coniugate con nanoparticelle specifiche per una malattia. Dopo l'ibridazione, l'abbondanza della popolazione di Essome bersaglio è determinata analizzando immagini a basso ingrandimento del microscopio a campo scuro (LMDFM) delle nanoparticelle vincolate. Questo approccio può essere facilmente adottato per la ricerca e l'uso clinico per analizzare i biomarcatori di Esosoma associati alla membrana legati alla malattia.

Introduction

Gli esosomi sono rilasciati dalla maggior parte dei tipi di cellule e giocano un ruolo chiave nelle comunicazioni tra cellule, compresi i processi fisiopatologici associati a varie malattie, dal momento che possono essere sede di specifici tessuti o tipi di cellule e contengono una varietà di acidi nucleici , proteine e lipidi che riflettono la loro cellula di origine e possono esercitare effetti normativi sulle loro cellule riceventi^1,2,3,4. Gli esosomi sono spesso secrinati a livelli elevati negli Stati di malattia, possono interagire con entrambe le cellule adiacenti e lontane, e si trovano a concentrazioni relativamente elevate nella circolazione, così come la maggior parte degli altri fluidi corporei, tra cui saliva, urina, pancreatico e bile liquido di lavaggio broncoalveolare^{5,6,7,8,9,10,11}. Questa abbondanza e stabilità di esosomi nei fluidi corporei umani, insieme alla loro natura ricca di informazioni, li rende biomarcatori ideali per la diagnosi delle malattie e il monitoraggio del trattamento.

Questo include gli esosomi derivati dal tumore (TDEs), che contengono fattori specifici del tumore o selettivi, che possono servire come biomarcatori della malattia, compresi gli alleli mutanti associati al tumore. I TDEs possono partecipare al rimodellamento del microambiente tumorale per facilitare lo sviluppo del tumore e la metastasi, e regolare le risposte anti-tumorali¹². Aumento della secrezione di TDE è un fenotipo comune della maggior parte dei tumori e diverse caratteristiche del microambiente del tumore, tra cui ipossia, pH acido, e l'infiammazione, sono noti per promuovere la secrezione di Essome. Sorprendentemente, dato il numero di cellule che secernono gli esosomi, un aumento del livello Esosoma totale può, a sua volta, funzionare come un biomarcatore del cancro. Ad esempio, uno studio recente ha scoperto che la concentrazione totale di EV nel succo di bile discrimina i pazienti maligni e non maligni nelle stenosi dei dotti biliari comuni con 100% di accuratezza⁷. Risultati simili sono stati trovati con studi che utilizzano altri fluidi corporei, compreso il plasma. Tuttavia, a causa del potenziale soggetto alla variazione del soggetto e di altri fattori di confusione, la maggior parte degli studi che indagano sugli esosomi come biomarcatori della malattia si sono concentrati sulla rilevazione di biomarcatori selettivamente associati ai TDEs invece che all'Esosoma totale Numeri.

Tuttavia, tradurre i biomarcatori di Essome nella pratica clinica rimane impegnativo poiché la maggior parte dei metodi di analisi degli esoni segnalati richiede lunghe e laboriose procedure di isolamento ¹³. Attualmente i metodi di isolamento Esosoma più diffusi includono ultracentrifugazione, gradienti di densità, esclusione dimensionale, co-precipitazione, acquisizione di affinità e approcci di isolamento microfluidico. Ultracentrifugation è il metodo "Gold standard", ed è più comunemente usato per isolazioni Essome, ma questa procedura richiede molto tempo e si traduce in danni Esosoma ed Essome clustering di membrana, e produce campioni esorpo che sono contaminati con proteine, lipoproteine e altri fattori che possono influenzare le analisi successive¹⁴. La maggior parte dei metodi di isolamento Esosoma, tra cui l'ultracentrifugazione, non può separare gli esosomi (30 – 150 Nm) dalle micro-vescicole (100 – 1000 Nm) e dai corpi apoptotici (100 – 5000 Nm), che sorgono attraverso diversi meccanismi e hanno funzioni diverse, a causa delle dimensioni sovrapposizione tra questi gruppi, e la diversità delle popolazioni Essome¹⁵. Sono necessari nuovi approcci per migliorare la sensibilità e la riproducibilità dei saggi Esosoma migliorando il recupero di Essome, riducendo al contempo i danni e la contaminazione di Essome, anche se eventuali saggi basati su tali metodi dovranno essere ottimizzati per renderli adatto per la traduzione in applicazioni in contesti clinici.

Diversi studi recenti hanno proposto di impiegare piattaforme integrate per catturare e analizzare gli esosomi direttamente dai fluidi corporei. Questi metodi impiegano microfluidica, Elettrocinetica, acquisizione di affinità e vari altri metodi per l'isolamento dell'Esosoma, l'elettrochimica, la risonanza del plasmonica superficiale e altri metodi per rilevare gli esosomi catturati. Non è chiaro come fattibile molti di questi approcci saranno in contesti clinici, a causa della loro complessità, spese, bassa produttività o altri problemi.

Abbiamo sviluppato un saggio rapido e poco costoso che può essere utilizzato per la quantificazione sensibile e specifica degli esosomi totali e dei sottotipi specifici di Esosoma, inclusi gli esosomi associati alla malattia, come i TDEs, che richiede solo una piccola quantità di campione e che utilizza un flusso di lavoro semplificato adatto per ambienti clinici. In questo saggio, una diapositiva è rivestita con anticorpi che legano un marcatore specifico per l'Esosoma o specifico della malattia espresso sulla superficie dell'Esosoma per catturare direttamente gli esosomi bersaglio presenti nei campioni di plasma o di siero di piccolo volume applicati ai pozzi sulla scivolare. Gli esosomi catturati vengono quindi ibridializzati con un nanoparticelle coniugato anticorpo che riconosce il biomarcatore di interesse su questi esosomi, che può essere un marcatore Esosoma generale o un fattore specifico per un sottotipo di Esosoma di interesse. Le immagini di questi pozzi di campionamento vengono quindi acquisite utilizzando un microscopio a campo scuro (DFM) e analizzate per misurare la luce dispersa dalle nanoparticelle legate agli esosomi di interesse catturati in ciascun campione ben^6,16,17. In particolare, l'imaging di un intero campione a basso ingrandimento DFM (LMDFM) evita una polarizzazione di selezione rilevata con analisi DFM ad alto ingrandimento quando gli utenti devono scegliere direttamente i campi da catturare per l'analisi delle immagini successiva. L'analisi dell'immagine LMDFM è soggetta a artefatti di dispersione della luce da irregolarità superficiali, tra cui graffi e detriti di campioni, ma questo sfondo può essere ridotto utilizzando un semplice algoritmo di riduzione del rumore che abbiamo sviluppato per funzionare sul programma di analisi delle immagini NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Questo algoritmo applica innanzitutto una soglia di contorno di input che viene utilizzata per rilevare i contorni del pozzo del campione per definire l'area dell'immagine per l'analisi successiva. La regione definita da questa regione di contorno viene quindi divisa in un segnale separato presente nei canali rosso, blu e verde dell'immagine e il canale blu viene sottratto dal canale rosso per rimuovere il segnale derivante da artefatti superficiali e illuminazione irregolare da aggregato nanorod segnale.

In questo articolo viene descritto come utilizzare questo saggio per quantificare rapidamente i livelli di esano totali o specifici nei campioni di plasma o di siero.

Protocol

1. preparazione delle sonde di nanoparticelle

Nota: questo saggio utilizza Nanorodi oro funzionalizzati (AuNRs; 25 Nm di diametro x 71 Nm di lunghezza) che sono covalenti coniugati con polimeri di neutravidina (AV) e hanno un picco di risonanza plasmonica superficiale che produce un segnale di dispersione rosso (641 Nm di picco) su DFM illuminazione.

1. Lavare 40 μL di AuNR-AV (2,56 x 10¹¹ particelle) tre volte con 200 ΜL di PBS (pH 7,0) per centrifugazione e aspirazione (8.500 x g a 4 ° c per 10 minuti), seguita da una fase finale di centrifugazione e aspirazione dopo la quale il pellet aunr-AV è sospeso in 40 μL di PBS.
2. Mescolare questa sospensione AuNR-AV con 10 μL di anticorpo biotinilato (0,5 mg/mL) specifico per un antigene sulla superficie del sottotipo di Esosoma di interesse e 150 μL di PBS e poi mescolare a 4 ° c per 2 h utilizzando un mixer per consentire il legame di neutravidina-Biotin per raggiungere il completamento.
3. Lavare tre volte le AuNRs (AuNR-IgG) coniugate con anticorpi risultanti per centrifugazione e aspirazione (6.500 x g a 4 ° c per 10 minuti), quindi sospenderle in 200 ΜL di PBS e conservarle a 4 ° c fino all'uso.
   Nota: la tecnica sterile e i tempi di conservazione brevi devono essere utilizzati per evitare contaminazioni e degradazione delle IgG di AuNR. È meglio usare le AuNRs coniugate con anticorpi entro 24 ore dalla loro coniugazione.

2. preparazione delle diapositive di cattura EV

1. Diluire gli anticorpi di cattura di Essome selezionati a 0,025 mg/mL in PBS e aggiungere 1 μL/pozzo di questa diluizione su una slitta A/G proteica a più pozzo, quindi incubare questa diapositiva a 37 ° c per 1 h in una camera umidificata per consentire il legame degli anticorpi di cattura con la proteina A/G immobilizzata su la diapositiva.
2. Aspirare pozzi per rimuovere gli anticorpi non legati, e lavare i pozzi tre volte con l'aggiunta e l'aspirazione di 1 μL/pozzo di PBS, quindi caricare ogni pozzetto con 1 μL di tampone bloccante (vedere tabella dei materiali) e incubare la slitta per 2 h a 37 ° c in una camera umidificata a b bloccare eventuali siti di legame proteico rimanenti.
3. Aspirare pozzi per rimuovere tampone di blocco, lavare i pozzi tre volte con l'aggiunta e l'aspirazione di 1 μL/pozzo di PBS, e utilizzare immediatamente le diapositive bloccate per l'acquisizione e l'analisi Essome.

3. preparazione della curva standard

1. Per quantificare accuratamente l'abbondanza assoluta o relativa di uno specifico sottotipo di Esosoma, l'utente deve generare una curva standard con una popolazione Esosoma pura che esprime uniformemente il biomarcatore di superficie Esosoma di interesse. Questo studio analizza l'abbondanza di esosomi che esprimono una proteina di membrana associata a metastasi, il recettore Ephrin a2, che ha una relazione segnalata con la fase del tumore pancreatico e la prognosi^6,18.
   Nota: la linea cellulare del tumore pancreatico umano PANC-1 e i suoi esosomi sono noti per esprimere questa proteina e gli esosomi isolati da questa linea cellulare sono stati utilizzati per generare una curva standard per quantificare il numero di esosomi che esprimono questa proteina in Esosoma complesso Campioni.
2. Cellule di coltura per 48 ore a 37 ° c in mezzi di coltura privi di siero per consentire l'accumulo di espo nei media, quindi isolare i supernatanti della coltura cellulare mediante la centrifugazione delle colture di sospensione o l'aspirazione diretta dei media di coltura da colture cellulari aderenti.
3. Centrifugare i supporti raccolti a 2000 x g per 30 minuti per rimuovere i detriti e recuperare il surnatante.
4. Filtrare il supernatante di coltura chiarificato attraverso un'unità filtrante a basso contenuto proteico di 0,45 μm di capacità appropriata (ad esempio un'unità di filtrazione sottovuoto in polietersulfone 250 mL).
5. Concentrare il filtrato risultante mediante centrifugazione a 3200 x g utilizzando un sistema di filtraggio del limite di peso molecolare nominale 100.000 a un volume finale di 250 μl. Raccogli il volume trattenuto da questo filtro, quindi lava il filtro con 200 μL di PBS e combina questo volume di lavaggio con il volume del campione di Essome raccolto.
6. Centrifugare questo campione a 21.000 x g per 45 minuti e recuperare accuratamente il surnatante, facendo attenzione a non raccogliere alcun materiale precipitato.
7. Centrifugare il surnatante recuperato a 100.000 x g per 3 ore per precipitato gli esosomi. Aspirare via il surnatante e raccogliere il pellet esorpo in 100 μL di PBS.
8. Conservare le sospensioni Essome risultanti a 4 ° c se utilizzate entro 24 ore o a-80 ° c per la conservazione a lungo termine.
   Nota: non sottoporre campioni di Esosoma a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
9. Quantificare un'aliquota della sospensione dell'Esosoma dopo la miscelazione mediante la misurazione diretta dei numeri di Esosoma (ad esempio, mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle o rilevamento di impulsi resistivi regolabili o misurando la concentrazione proteica di Esosoma lisati mediante microbicinchoninic saggio acido, o un metodo equivalente, come mezzo per approssimare la quantità di Esosoma)^16,19.
10. Genera una serie di diluizioni seriali della sospensione dell'esone per consentire il confronto del segnale delle nanoparticelle per immettere un numero espo o un contenuto proteico.
11. Trasferire 1 μL di ogni standard di espo a ciascuno dei suoi pozzetti replicati sulla piastra di saggio.
    Nota: le curve standard possono essere utilizzate per calcolare la pendenza della linea di correlazione tra il segnale delle nanoparticelle e la concentrazione di Esosoma fino a (1) valutare le prestazioni del saggio e (2) determinare la concentrazione relativa degli esosomi bersaglio in campioni sperimentali.

4. elaborazione di campioni di plasma o siero umano

1. Raccogliere campioni di plasma o siero con metodi standard e conservare a-80 ° c fino a quando necessario per l'analisi Essome. Scongelare rapidamente i campioni in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Mescolare ripetutamente i campioni scongelati per inversione per promuovere una sospensione omogenea.
   Nota: i risultati dei campioni di siero e plasma potrebbero non essere equivalenti, poiché durante la reazione di coagulazione è presente un significativo rilascio di esosomi.
2. Centrifugare plasma o campioni di siero a 500 x g per 15 min per precipitato aggregati proteici e altri detriti. Trasferire un'aliquota del campione di plasma o di siero in un tubo fresco e aggiungere PBS per generare una diluizione 1:1. Miscelare il campione diluito con un lieve vortaggio o inversione, se del caso. Trasferire 1 μL di ogni sospensione plasmatica o sierica a ciascuno dei suoi pozzetti replicati sulla piastra di saggio.

5. acquisizione e rilevamento di Essome

1. Caricare i pozzetti di una slitta di cattura EV bloccata con 1 μL/pozzo di campione di espo, utilizzando 8 repliche per campione, e incubare la slitta durante la notte a 4 ° c in una camera umidificata. Aspirare tutti i pozzetti di campionamento e poi aggiungere 1 μL/pozzo di PBS per lavare i pozzi e rimuovere gli esosomi non legati e altri contaminanti dal campione di Esosoma caricato.
2. Caricare i pozzetti dei campioni con 1 μL/pozzetto di una sospensione di AuNR-IgG precedentemente preparata (vedere paragrafo 1) e incubare il vetrino per 2 ore a 37 ° c in una camera umidificata. Aspirare la soluzione di nanoparticelle e lavare la slitta in PBS integrata con 0,01% Tween-20 (PBST) per 10 minuti utilizzando un mixer, quindi aspirare e lavare tutti i pozzetti di campionamento con acqua deionizzata per 10 minuti utilizzando un mixer rotante e asciugare ad aria per le successive immagini LMDFM.
   Nota: i coefficienti di variazione inter-saggio (CV) sono valutati da otto replicati dello stesso campione. I campioni che presentano CVs > 20% sono considerati non informativi e devono essere ripetuti, se vi è un campione sufficiente.

6. acquisizione immagini DFM

1. Acquisisci immagini per la quantificazione di Essome in un'illuminazione omogenea utilizzando una fotocamera digitale collegata a un microscopio dotato di un condensatore a campo scuro (1,2 < NA < 1,4) e un obiettivo 4x che impiega un tempo di esposizione di 1/220 s.
2. Aprire il software di acquisizione delle immagini.
   Nota: usiamo il software di imaging per microscopio NIS-Elements (Vedi tabella dei materiali) per il protocollo descritto di seguito, ma è possibile utilizzare un altro software che può corrispondere ai suoi parametri di acquisizione dell'immagine. Il software di imaging NIS-Elements Viewer è un programma autonomo gratuito per visualizzare i file di immagine e i set di dati che contengono strumenti di analisi, visualizzazione e archiviazione. I parametri riportati di seguito sono anche per un microscopio con autofocus e una fase automatizzata che consente a più immagini di essere acquisite e cucite automaticamente in una singola immagine.
3. Posizionare lo scivolo capovolto sullo stadio del microscopio, regolare la posizione della slitta e applicare una piccola goccia di olio da immersione sul retro della slitta, dove l'obiettivo del condensatore Contatta la slitta.
4. Fare clic sul pulsante Live nell'interfaccia del software e regolare il tempo di esposizione contro un pozzo standard ad alta concentrazione per garantire che l'immagine non sia saturata.
5. Aprire la finestra scansione grande immagine dalla scheda Acquisisci e impostare i parametri dell'interfaccia software come segue: immagine macro ottica conf = corrente; Obiettivo: 2:10x, scansione ottica conf = corrente, obiettivo: 2:10x; Sovrapposizione cuciture = 20%; Cucitura tramite = percorso ottimale.
6. Scegliere Crea immagine grande, Chiudi otturatore attivo durante il movimento dello stage, attendere prima di ogni acquisizione: 20 ms, messa a fuoco manualmente all'avvioe utilizzo della messa a fuoco passo-passo ogni campo 20. Queste impostazioni verranno salvate con le immagini acquisite.
7. Spostare la fase del microscopio per definire il limite inferiore sinistro superiore destro del campo di scansione di destinazione. Regolare la messa a fuoco per ottenere un'immagine nitida sul monitor e regolare le impostazioni del condensatore e l'illuminazione ambientale come necessario per minimizzare eventuali irregolarità di illuminazione nell'immagine focalizzata.
8. Denominare il file di output dell'immagine nel software. Fare clic sul pulsante Scan e consentire al microscopio di scansionare e creare e salvare un'immagine cucita dell'intera diapositiva.
9. Aprire l'immagine salvata con il software di acquisizione di immagini che si sta utilizzando e salvarlo in scala 1/8 per l'analisi successiva sul plugin DSM in ImageJ.

7. analisi immagine DFM

1. Scaricare il programma ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Installare il plugin dell'algoritmo DSM in ImageJ utilizzando le istruzioni elencate in https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
2. Aprire il software ImageJ, quindi impostare i seguenti parametri di input all'interno dell'algoritmo DSM: soglia contorno (CT) = 253,020, tipo = rosso, scala centrale (S) = 0,8, basso (LT)/alto (Ht) limite di quantificazione = 0/62.
3. Aprire l'immagine salvata dalla sezione 6,8 con ImageJ. Scegliere il pulsante scansione DSM dalla scheda plugins , quindi definire il numero di colonne e righe in base all'immagine aperta. Il programma può riconoscere le aree di rilevamento e l'analisi dell'intensità di dispersione delle nanoparticelle nelle aree in base automaticamente. Impostare i seguenti parametri di input all'interno della finestra di scansione DSM : Ridimensiona percentuale = 25, diametro spot (in pixel) = 190-200, Intervallo diametri = 32, diametro incremento (in pixel) = 8, configurazione DSM-bassa Limit = 0, limite alto = 62, distanza adiacente = 100, Sottrai bias = 0.
   Nota: i risultati dell'intensità di dispersione delle nanoparticelle riflettono la quantità di esosomi legati sulla diapositiva.

Results

I vetrini con rivestimento A/G di proteina multi-well (Figura 1a) sono stati funzionalizzati con anticorpi anti-EphA2 e quindi utilizzati per catturare in modo specifico gli esosomi EphA2-positivi da campioni di siero di pazienti con e senza carcinoma pancreatico (1 μl/pozzo) e incubati con nanorodi dorati coniugati con un anticorpo anti-CD9 (Figura 1B). Le immagini DFM di luce sparse da queste nanoparticelle sono state analizzate utilizzando il plugin DSM nel software ImageJ per quantificare gli esosomi positivi di EphA-2 in ogni pozzo. L'algoritmo DSM definisce automaticamente il contorno di un campione, filtra il rumore dagli artefatti, calcola il segnale disperso da ogni pozzo e restituisce queste informazioni (Figura 2). L'algoritmo DSM attenua fortemente gli artefatti di dispersione della luce da graffi o detriti presenti nel campione e migliora la sensibilità e la riproducibilità del rilevamento delle nanoparticelle e può elaborare automaticamente un lotto di immagini di diapositive per un throughput elevato usare. Questo algoritmo utilizza i comandi e i parametri ImageJ immessi dall'utente per sottrarre lo sfondo dell'immagine, calcolare il segnale di dispersione da ciascun pozzo e generare un file di dati e immagini (Figura 3). Le regioni di interesse sono definite dai limiti di pozzo ad alta intensità nell'immagine di acquisizione utilizzando la funzione di soglia del contorno del programma macro ImageJ. Le analisi delle immagini utilizzano una soglia di contorno e parametri di immagine predefiniti per calcolare l'intensità della dispersione delle nanoparticelle per ogni pozzetto.

Come riportato nel nostro precedente lavoro (informazioni supplementari di Liang et al.⁶), gli esosomi isolati dalle colture cellulari PANC-1 caratterizzate da microscopia elettronica a trasmissione e Western blot hanno esposto la gamma di dimensioni, la morfologia e il marcatore proteico espressione coerente con un campione di Essome di elevata purezza. Gli esosomi PANC-1, preparati con la stessa procedura del nostro lavoro precedente, sono stati usati qui per convalidare il nostro saggio nPES per la quantificazione Esosoma. Questo saggio ha utilizzato un anticorpo anti-EphA2 per catturare una grande popolazione di esosomi dalla popolazione Esosoma totale e un anticorpo contro la proteina Esosoma generale CD9 per rilevare gli esosomi catturati. I risultati ottenuti utilizzando campioni di esorpo PANC-1 serialmente diluiti, con concentrazioni proteiche che vanno da 0,24 a 1,2 μg/μL, hanno mostrato una buona riproducibilità nei pozzetti replicati (Figura 4a) e una forte correlazione lineare tra la risposta allo spargimento e concentrazione di proteine Essome (Figura 4B).

Per dimostrare la potenziale applicazione di questo metodo, sono stati analizzati campioni di siero di pazienti con e senza carcinoma pancreatico per rilevare l'abbondanza di esosomi sierici che esprimono il biomarcatore associato al cancro EphA2, utilizzando un anticorpo anti-EphA2 per catturare direttamente gli esosomi bersaglio da siero e nanoparticelle coniugati con un anticorpo anti-CD9 per rilevare gli esosomi legati. Questa analisi ha rivelato che i campioni di siero dei pazienti affetti da tumore pancreatico avevano livelli significativamente più elevati di esosomi EphA2 + (Figura 5) rispetto ai loro controlli.

Figura 1: schema di quantificazione espo. (A) schema delle diapositive a/G di proteina multi-pozzetto (192 pozzetti) utilizzate in questo saggio. B) gli esosomi bersaglio sono direttamente catturati da campioni, compresi siero e plasma, dall'immobilizzazione superficiale sull'anticorpo di cattura (ad esempio anticorpo anti-EphA2) legato alla slitta, e poi incubato con nanorodi dorati coniugati con un rilevamento anticorpo (ad es. anticorpi anti-CD9) prima dell'analisi dell'analisi DFM. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2: quantificazione Essome applicando l'algoritmo DSM alle immagini LMDFM. Le immagini a basso ingrandimento vengono elaborate con l'algoritmo DSM per eliminare il segnale di sottofondo e gli artefatti del segnale che possono derivare da graffi, vuoti di miscelazione, detriti e illuminazione del campione irregolare per consentire un rilevamento robusto del segnale aggregato nanorod dorato, che è correlato alla concentrazione di espo. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Sun, D. et al. metodo di riduzione del rumore per quantificare la dispersione della luce delle nanoparticelle a basso ingrandimento microscopio a campo oscuro immagini di campo lontano. Chimica analitica. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) società chimica americana. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 3: schema dei comandi e delle uscite dell'algoritmo DSM. I passaggi indicati utilizzano i comandi nativi di ImageJ e tutti i parametri di input vengono selezionati in base ai requisiti degli esperimenti tramite l'interfaccia utente grafica. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Sun, D. et al. metodo di riduzione del rumore per quantificare la dispersione della luce delle nanoparticelle a basso ingrandimento microscopio a campo oscuro immagini di campo lontano. Chimica analitica. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) società chimica americana. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 4: immagini LMDFM rappresentative di nPES e dati di output DSM. (A) immagine lmdfm di un saggio di NPES che analizza un gradiente di concentrazione di esosomi PANC-1 e (B) la correlazione lineare del segnale ottico e la concentrazione di Esosoma da questa diapositiva (da sinistra a destra: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μL rispettivamente per ciascuna colonna). I dati sono presentati come media ± SE, n = 6, con un coefficiente di correlazione Pearson R² = 0,99 e coefficiente di variazione per i replicati di ogni concentrazione < 0,2. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 5: il segnale LMDFM di EphA2⁺ Exosomi differisce nel siero da pazienti con e senza carcinoma pancreatico. I campioni di siero analizzati da nPES utilizzando un anticorpo di cattura anti-EphA2 (associato al cancro) e un anticorpo di rilevazione anti-CD9 (marcatore Esosoma generale) hanno evidenziato una differenza significativa nella concentrazione di esosomi EphA2 + in campioni di siero di pazienti con e senza tumore pancreatico (N = 7/gruppo). I risultati sono presentati come media ± SE. * *p = 0,002 di Mann-Whitney U-test (fronte-retro). Questa cifra è stata modificata da [Sun, D. et al. metodo di riduzione del rumore per quantificare la dispersione della luce delle nanoparticelle nel microscopio a basso ingrandimento a campo scuro immagini di campo lontano. Chimica analitica. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussion

Gli esosomi derivano da invaginazioni regolamentate della membrana endosomica esterna che producono corpi multivesicolari, un sottoinsieme specializzato di endosomi che contengono un gran numero di vescicole intraluminali che subiscono la fusione con la membrana plasmatica per liberare maturo gli esosomi nello spazio extracellulare. A causa di questo percorso di biogenesi, gli esosomi possono trasportare fattori legati alla membrana associati a frazioni di membrana che comprendono o si fondono con la membrana endosomica, così come più tipi diversi di componenti citosolici, e contengono quindi carichi di proteine, DNA e vari sottotipi di RNA (mRNA, microRNA, RNA lunghi non codificanti) che possono riflettere il fenotipo della loro cellula di origine²⁰. Poiché gli esosomi sono secreto dalla maggior parte se non tutti i tipi di cellule, possono esibire una maggiore secrezione da cellule malate o maligne, e si accumulano nella maggior parte dei fluidi corporei, gli Exosomi sono oggetto di un'indagine globale e sistematica come un promettente minimamente metodi invasivi per rilevare condizioni specifiche di malattia e monitorare le loro risposte al trattamento²¹.

L'isolamento di Essome, necessario per la maggior parte delle analisi esocisteriche, è una procedura lunga e laboriosa, che limita la traduzione clinica di biomarcatori associati a Esosoma con potenziale rilevanza medica. Molti metodi di isolamento comuni (ultracentrifugazione, dimensione-esclusione, precipitazioni, ecc.) spesso non distinguono sufficientemente gli esosomi (30 – 100 nm) da micro-vescicole (100 – 1.000 Nm) e corpi apoptotici (100 – 5000 Nm) a causa di sovrapposizioni nelle loro gamme di dimensioni o Proprietà fisiche o possono danneggiare l'integrità dell'esofita¹⁵. Nuovi approcci sono in fase di sviluppo che possono consentire analisi Essome più rapide, ma non è chiaro come fattibile può essere quello di implementare molte di queste piattaforme in contesti clinici dovuti.

In questo rapporto, presentiamo un nuovo approccio che consente la quantificazione di Essome ad alto throughput basato su nanoparticelle utilizzando immagini di microscopio a basso ingrandimento del campo scuro. Questo metodo non richiede la purificazione di Essome, costose attrezzature dedicate o nuove competenze tecniche e dovrebbe quindi essere suscettibile di traduzione rapida nella maggior parte delle ricerche e delle impostazioni cliniche. Il nostro saggio può essere applicato per quantificare con precisione la concentrazione di una popolazione di Esosoma bersaglio che porta uno specifico biomarcatore quando i risultati del saggio vengono confrontati con una curva standard, poiché i nostri risultati mostrano una forte correlazione lineare (R² = 0,99) tra risposta ottica e concentrazione di espo. Per dimostrare il potenziale del mondo reale di questo approccio, abbiamo fornito i dati in cui abbiamo impiegato questo metodo per quantificare la concentrazione di un biomarcatore esopatico associato al cancro del pancreas nei campioni di siero ottenuti da pazienti con e senza carcinoma pancreatico.

In LMDFM, l'intero pozzo del campione viene immaturato per evitare la polarizzazione di selezione trovata nelle analisi DFM ad alto ingrandimento, dove gli utenti devono scegliere direttamente i campi campione da catturare per l'analisi delle immagini successiva, ma sono soggetti a artefatti di dispersione della luce dalla superficie irregolarità, compresi graffi e detriti del campione. Questo background può essere ridotto per rilevare il segnale derivato da Essome di destinazione utilizzando il nostro algoritmo di riduzione del rumore DSM che gira sul programma di analisi delle immagini NIH, ImageJ, ma è comunque necessario prestare attenzione per evitare di introdurre tali artefatti che possono ridurre la gamma dinamica di del saggio.

Materiali utilizzati in questo saggio:

Le diapositive SuperProtein A/G multi-pozzetto che detengono 1 μL/pozzo sono state acquistate da Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Le nanoparticelle sono state ottenute da Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 10¹²/ml). Le immagini DFM sono state acquisite con una fotocamera digitale Nikon DiR2 collegata a un microscopio Nikon ti-Eclipse, con un'illuminazione costante e un tempo di esposizione di 1/220 s. La linea di cellule PANC-1 utilizzata in questo studio è stata acquistata dalla American Type Culture Collection.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Ripetitore di corrente	Fisher Scientific	05-401-040
Eppendorf Research plus	Eppendorf	3120000011	0,1 – 2,5 &�; L, grigio scuro
Nanorods d'oro funzionalizzato	Nanopartz	C12-25-650-TN-DIH-50-1	Funzionalizzazione del polimero di neutravidina in vitro
HulaMixer Sample Mixer	Thermo Fisher Scientific	15920D
Incu-shaker 10L	Benchmark Scientific	H1010
Microscopio di ricerca invertito	Nikon	Ti-DH	Con condensatore a campo scuro, fotocamera DS-Ri2 e supporto universale Ti-SH-U e tavolino motorizzato
NIS-Elements	Software di imaging per microscopio	Nikon
Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)	GE Healthcare Life Sciences	SH30256.02	HyClone
Protein A/G Vetrini per substrati trattati	Arrayit Corp.	Substrato per	microarray AGMSM192BC Premium
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC	Q500-110	Con sonda standard (#4220)
Tampone di blocco Superblock	Thermo Scientific
TWEEN 20	Sigma Life Sciences	9005-64-5